專利名稱：一種甘藍型油菜erf-b3家族轉錄因子基因及其制備方法
技術領域：
本發明涉及作物遺傳育種領域，具體涉及一種改良的甘藍型油菜ERF-B3家族轉 錄因子的基因序列及其制備方法。
背景技術：
油菜(Brassica napus)是全世界廣泛種植的一種重要油料作物，是我國具有傳統 優勢的重要油料作物，也是我國第五大作物。我國的油菜產業發展對世界菜籽油及制品市 場影響巨大王漢中，中國油料作物學報，2005，27 (4) 100-105。基因的體外定向分子進化是在體外模擬生物大分子的自然進化進程，通過突變或 重組、篩選循環進行，能在短時間內產生符合我們需要的特定分子，在試管里模擬達爾文自 然進化過程，結合隨機突變和重組，篩選具有目的性狀的突變體。與自然進化不同，這種策 略具有明確的目標性(即篩選靶特性人為確定)，針對特定生物大分子的特定性狀加以改 造，因而也被稱之為定向進化(Directed evolution)和人為進化(Artificial evolution)HaseItine 等，Annu Rev Biophys Biomol Struct, 2007, 36 :1_19。DNA改組(DNA Shuffl ing)技術的發展和成熟是在上世紀九十年代，1994年 Memmer提出的，開辟了定向進化技術的新紀元Memmer，Nature，1994，370 =389-391 ] 隨 著PCR技術的發展和成熟，DNA Shuffling技術更成熟，應用更廣泛，涉及的基因也更多。 DNA Shuffling是與PCR技術結合的，由于隨機片段的同源重組和突變，而導致基因序列的 變化。DNA改組主要是基因經過DNA酶處理變成10到50bp的DNA隨機短片段，然后經過兩 步PCR過程重新組裝成一個完整的全長核酸序列，此過程中引入了突變并進行了重組，實 現核苷酸序列的體外迅速進化，從而提高核苷酸序列編碼的蛋白功能。轉錄因子CTranscription factor, TF)又稱反式作用因子，是和專一性DNA序列 結合并能激活或抑制其他功能基因轉錄的蛋白質分子。典型的轉錄因子一般由DNA結合 域(DNA-binding domain)、轉錄調控域(Transcriptionregulation domain)、寡聚化位點 (Oligomerization site)禾口核定位信號(Nuclearlocalization signal, NLS)4 個功能域 組成，轉錄因子通過這些功能區域與啟動子順式元件(cis-acting element)或其他轉錄因 子的功能區域相互作用，激活或抑制基因的轉錄劉強等，科學通報，2000，45 1465-1474。 植物體內存在大量的轉錄因子，對擬南芥(A. thaliana)第4號染色體的基因組序列進 行分析，發現15%的基因編碼或可能編碼轉錄因子Riechmann等，Science, 2000, 290 2105-2110。ERF-B3家族轉錄因子通過參與乙烯、脫落酸、茉莉酸和水楊酸等信號轉導途 徑，調控下游基因的表達，從而提高植物的抗性和耐受性。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種甘藍型油菜ERF-B3家族轉錄因子基因。所述甘藍型油菜ERF-B3家族轉錄因子基因的堿基序列為SEQ IDN0. 1。所述甘藍型油菜ERF-B3家族轉錄因子基因編碼的蛋白質，其氨基酸序列為SEQ IDNO. 2。所述甘藍型油菜ERF-B3家族轉錄因子基因為Mu&iaERF_B3基因。所述甘藍型油菜ERF-B3轉錄因子基因Mu&iaERF-B3是通過以下方法得到1.引物的設計與合成設計一對引物，引物兩端分別引入Bam HI和Mc I的酶切位點。正向引物GGATCCATGGCAACTATTGAGGAAATC ；反向引物GAGCTCTCAGAATTCGTTTGATGATGAATTGC。該引物由上海生工生物工程技術有限公司合成(http://WWW. sangon. com/)。2.甘藍型油菜ERF-B3轉錄因子基因突變體庫的構建本步驟通過DNA突變過程，包括甘藍型油菜ERF-B3轉錄因子基因的DNA片段的擴 增，甘藍型油菜ERF-B3轉錄因子基因DNA片段PCR產物用DNA酶降解得到小片段，甘藍型 油菜ERF-B3轉錄因子基因小片段進行無引物的PCR擴增以及取無引物PCR產物為模板進 行引物PCR擴增四步，最后獲得甘藍型油菜ERF-B3轉錄因子基因DNA片段的突變體庫。(1)甘藍型油菜ERF-B3轉錄因子基因DNA片段的擴增根據甘藍型油菜ERF-B3轉 錄因子基因核苷酸序列，使用正向引物GGATCCATGGCAACTA TTGAGGAAATC ；反向引物GAGCT CTCAGAATTCGTTTGATGATGAATTGC，兩個引物進行擴增，以甘藍型油菜cDNA為模板,擴增得到 長度為600bp左右的甘藍型油菜ERF-B3轉錄因子基因DNA片段。(2)回收DNA，甘藍型油菜ERF-B3轉錄因子基因DNA片段用DNA酶進行降解，形成 彌散的片段10-200bp，通過透析袋回收30-50bp的小片段。(3)回收產物進行無引物PCR擴增，形成200_400bp的彌散條帶。(4)取無引物擴增產物為模板，加入正向引物GGATCCATGGCAACTA TTGAGGAAATC ；反向引物GAGCTCTCAGAATTCGTTTGATGATGAATTGC 兩個弓丨物進行PCR擴增，其擴增產物即為甘藍型油菜ERF-B3轉錄因子基因DNA片段的突變 庫。3.含改組突變的甘藍型油菜ERF-B3轉錄因子基因DNA片段酵母表達質粒庫的構
建本步驟是將回收的改組突變的甘藍型油菜ERF-B3轉錄因子基因DNA片段經過Bam HI和Me I雙酶切后，植入同樣經過Bam HI和Me I雙酶切含有氨芐青霉素抗性基因的載 體 Π304中，再用Ml I和Mc I酶切回收片段連接入PPC86載體。利用該質粒可以通過 LacZ基因的表達產物β -半乳糖苷酶與底物X-Gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖苷) 作用形成藍色的深淺來篩選所需要的改組突變的甘藍型油菜ERF-B3轉錄因子基因。4.突變群體的篩選，獲得功能增強的新型甘藍型油菜轉錄因子Mu&iaERF-B3的個 體本步驟是將含有改組突變的甘藍型油菜ERF-B3轉錄因子基因庫的表達載體 質粒轉入宿主菌釀酒酵母中，篩選得到藍色較深且顯色快的陽性克隆，獲得突變個體為 MuBnaERF-B3(參見圖 1)。5.基因的序列分析將Mu&iaERF_B3陽性克隆進行總DNA抽提，轉化大腸桿菌DH5 α，進行質粒抽提，電泳鑒定后進行突變個體為Mu&iaERF-B3基因的測序與分析。經過DNA序列測定，得到全長 的核苷酸序列。分析發現與原始的&iaERF-B3基因核苷酸序列相比，Mu&iaERF-B3核苷酸改 動了 M個，具體為從野生型基因序列變為改組突變基因序列54，A — T ;151，A — T ； 167， G — T ；169，C — T ；184，T — C ；185，C — G ；203，G — C ；208，T — C ；209，G — A ；240ACAACT, A — / ；241，C — / ；242,A — / ；243,A — / ；244，C — / ；245，T — / ；251，Τ — A ；350,A — C ； 380，G — T ；465，G — A ；549，A — T ；550，A — G ；557，G — A ；574，C — T ；576，A — G (數字 表示突變位點，/表示缺失突變)。氨基酸序列改動了 11個，具體為從野生型基因序列變為改組突變基因序列18， M — L ；50，Q — L ；56，A — V ；61, F^S ；69，M — T ；77，T — / ；78，T — / ； 155，G — R ； 183， N—C; 191，Τ — I ； 192，Τ —A (數字表示突變位點，/表示缺失突變)。6.改組突變的甘藍型油菜ERF-B3轉錄因子基因Mu&iaERF_B3和野生型基因功能 分析通過對甘藍型油菜野生型&iaERF_B3與改組突變功能增強的甘藍型油菜轉錄因 子Mu&iaERF-B3酵母體內結合活性中β _半乳糖苷酶活性測定，在pH = 7. 0，25°C時，改組 突變功能增強的新型甘藍型油菜轉錄因子Mu&iaERF-B3的β _半乳糖苷酶活性較甘藍型油 菜野生型&iaERF-B3活性顯著增強，提高了近20倍(參見圖2)。
圖1為改組突變功能增強的甘藍型油菜轉錄因子Mu&iaERF-B3和野生型的功能表 現，其中A為甘藍型油菜野生型&iaERF-B3，B為甘藍型油菜轉錄因子Mu&iaERF-B3。圖2為改組突變功能增強的甘藍型油菜轉錄因子Mu&iaERF-B3和甘藍型油菜野生 型的活性測定。
具體實施例方式以下結合具體實施例進一步詳細描述本發明的技術方案。其中，本發明所用的試驗材料及其來源分別如下雙低甘藍型油菜滬油15(Brassica napus L. Huyou 15)的種子經過(ν/ν) NaOCl消毒后種植在黑土 珍珠巖蛭石(1 1 1)的基質中，22°C，培養(16h光照，8h 黑暗，冷光源)生長20天。大腸桿菌(Escherichia coli)DH5 α和釀酒酵母菌株由上海市農業科學院生物技 術研究所植物基因工程研究室保存。克隆載體pMD-18-Simple Τ、各類限制性內切酶、Taq 聚合酶、連接酶、dNTP、10XPCR buffer和DNAmarker購自寶生物工程大連有限公司。所有 的化學試劑都從美國西格瑪化學公司和上海國藥化學試劑公司購買。ABI PRIAM Big-Dye Terminator DNA測序試劑盒購自美國應用系統公司。本發明常規的基因操作參照文獻Sambrook J,Frets E F, Mannsdes T etal. In Molecular Cloning. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。β-半乳糖苷酶酶活的測定參照文獻Sambrook J，Frets E F，Mannsdes Tet al. In :Molecular Cloning. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。實施例1
雙低甘藍型油菜滬油15幼苗RNA的抽提和cDNA合成(一 )試驗方法1. RNA 的抽提加入IOOmL提取緩沖液(油菜RNA提取緩沖液配方CTAB 3% (ff/V) ；PVP 3% (W/ V) (Mw 4000) ；EDTA 25mM ；NaCl 2. OM ；Tris-HCl IOOmM, pH8. 0 ；Spermidine 0.5g/L ；DEPC 0. 1% (V/V) ；0. 1% DEPC 處理的 SDS 0. 5% (W/V) ；0. 1% DEPC 處理的 LiCl 10Μ)到 50mL 聚丙烯管，65°C預熱。稱取5g植物材料倒入液氮使材料始終保持凍結和易碎的狀態，研磨。研磨后細粉轉移至預先加入65°C預熱的提取緩沖液的50mL離心管。將離心管放入65°C水浴45min，并偶爾搖動以混合各成分。加入等體積氯仿-異戊醇混合液，輕柔地上下顛倒混合約lOmin。在18°C，于12000g離心IOmin ；吸取上清液。重復5，6步驟操作。吸取上清液，加入1/4體積的IOM LiCl溶液，徹底混勻，4°C放置12h。在4°C，12000g 離心 30min。RNA沉淀用500 μ L 0. 5% SDS輕柔溶解，用氯仿-異戊醇混合液抽提，4°C，12000g 離心30min。上清液轉移至另一新的管子，加入2倍體積-20°C冰冷的無水乙醇，充分混合，放 置在_20°C條件下2h，沉淀總RNA。12000g，4°C離心30min，用75%乙醇漂洗兩次，保留RNA，真空風干。用200yL DEPC處理的去離子水重新溶解，取少量用于RNA質量和濃度的檢測，其 余儲存于_70°C，備用。2. cDNA 合成WA01igo(dT)20(10pmol/yL)lyl ；總 RNA :10 IOOng ；補足 RNaseFree H20 到 12μ Lo65°C，5min后，立即置于冰上。再加入5 X RT Buffer 4 μ L ；dNTP Mixture (各 IOmM) 2 μ L ；RNaseInhibitor (IOU/ yL)lyL;反轉錄酶IyL0反轉錄反應過程為30°CIOmin ；42°C 20min ；85°C 5min ；4°C 5min。瞬間離心，保存。( 二)試驗結果采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA產物，結果可見明顯的RNA條帶。實施例2PCR方法獲得甘藍型油菜ERF-B3家族轉錄因子基因野生型&iaERF_B3基因片段(一 )試驗方法本發明設計一對正向和反向引物，為了克隆鑒定等構建的需要，引物兩端分別引 Λ Bam HI和Sac I的酶切位點。PCR 反應體系10 XPCR buffer 5. 0 μ L ;dNIPs (各 2. 5mM) 4 μ L ；雙低甘藍型油菜 滬油 15 的 cDNA模板 lyU20ng)；引物 &iaERFBl-2_F 0. 5 μ L ；引物&iaERFBl-2_R 0. 5 μ L ；
6Ex-Taq 0. 4 μ L (預變性后加入)；加無菌水定容至50 μ L。PCR反應程序94°C變性30s， 55°C退火30s，72°C延伸lmin，共擴增30個循環，再72°C延伸IOmin0( 二)試驗結果經過1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物為一條約600bp的片段。實施例3甘藍型油菜ERF-B3轉錄因子基因&iaERF_B3突變體庫的構建(一 )試驗方法1.甘藍型油菜ERF-B3轉錄因子&iaERF_B3基因DNA片段的DNase I降解及回收l)DNase I 降解用100 μ L DNase I緩沖液溶解實施例2所回收的甘藍型ERF-B3油菜轉錄因子 &iaERF-B3 基因 DNA 片段，加入 0. IU DNase I，25°C處理 15min 后 70°C處理 IOmin (失活 DNA 酶)。采用10%丙烯酰胺凝膠電泳鑒定降解產物。本步驟中，DNase I緩沖液的組成為 50mmol/L Tris-Cl pH7. 4+lmmol/LMgCl22)降解產物回收用透析袋法回收得到30_50bp的小片段。用IOyL IOX無引物PCR緩沖液 (50mmol/L KCl+10mmol/LTris-Cl pH9. 0+1% Triton)溶解沉淀。2.降解產物的無引物PCR擴增反應體系降解小片段 DNA 模板5μ L ;dNTPs(2. 5mmol/L) :4μ L ；MgCl2 (2. 5mmol/L) 4. 5 μ L ；Ex-Taq聚合酶:2U ；加ddH20至終體積為50 μ 1。反應程序為94°C30s,40°C 30s，72°C 30s，共 45 個循環。采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結果，用透析袋法回收DNA。3.無引物PCR擴增產物的引物PCR擴增無引物PCR擴增產物模板5 μ L ；正向引物0. 2ng ；反向引物0. 2ng ； 10XPCR buffer :5μ 1 ； dNTPs (2. 5mmol/L) :4 μ L ； Taq 聚合酶:2U ；加 ddH20 至終體積為 50 μ L。反應程序為94°C30s, 70°C 30s，72°C lmin，共；35 個循環。1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收DNA。(二)試驗結果1.采用丙烯酰胺凝膠電泳鑒定降解產物的結果可以看出甘藍型油菜ERF-B3轉 錄因子&iaERF-B3基因DNA片段經DNase I降解后，形成長度為10 200bp的彌散小片段。2.用瓊脂糖凝膠電泳檢測引物PCR擴增結果可以看出，無引物擴增產物經過引物 PCR擴增后，得到長度為600bp的片段，此片段即為甘藍型油菜ERF-B3轉錄因子&iaERF_B3 基因的突變體庫。實施例4含甘藍型油菜ERF-B3轉錄因子&iaERF_B3基因DNA片段的突變體庫的構建和篩 選(一 )試驗方法1.突變體酵母表達質粒庫的構建按 Sambrook分子生物學基本操作Sambrook J,Frets E F, Mannsdes Tet al. In Molecular Cloning. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.。本步驟是 將回收的改組突變的甘藍型油菜ERF-B3轉錄因子基因DNA片段經過Bam HI和Mc I雙酶 切后，植入同樣經過Bam HI和Me I雙酶切含有氨芐青霉素抗性基因的載體 Π304中，再 用Ml I和Mc I酶切回收片段連接入pPC86載體。2.突變體庫轉化子的構建將構建好的含改組突變的甘藍型油菜ERF-B3轉錄因子基因DNA片段酵母表達質 粒庫，轉化子影印在含有底物X-Gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖苷)的培養基上，挑 取顯色快且深的個體。(二)試驗結果獲得一個蘭色顯色快且深的個體，MuBnaERF-B3 (參見圖1)。實施例5克隆鑒定、序列測定(一)試驗方法將Mu&iaERF_B3陽性克隆進行總DNA抽提，轉化大腸桿菌DH5 α，進行質粒抽提，電 泳鑒定后進行突變個體為Mu&iaERF-B3基因的測序與分析。本發明通過核苷酸序列測定分析，最終獲得改組突變的甘藍型油菜ERF-B3轉錄 因子基因Mu&iaERF-B3，具有如下的堿基和氨基酸序列信息。(二)試驗結果測序分析結果顯示改組突變的甘藍型ERF-B3油菜轉錄因子基因Mu&iaERF-B3編 碼閱讀框由603bp組成，編碼一個200個氨基酸的蛋白質。實施例6改組突變的甘藍型油菜ERF-B3轉錄因子基因Mu&iaERF-B3和野生型基因功能分 析(一)試驗方法β-半乳糖苷酶酶活的測定參照文獻進行Sambrook J，Frets E F，Mannsdes T et al. In :Molecular Cloning. 2nd ed. Cold Spring HarborLaboratory Press，1989J0(二)試驗結果在pH= 7. 0，25°C時，改組突變功能增強的新型甘藍型油菜轉錄因子Mu&iaERF_B3 的半乳糖苷酶活性較甘藍型油菜野生型&iaERF-B3活性顯著增強，提高了近20倍(參 見圖2)。最后應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管參 照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對發明的 技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范圍，其均應涵蓋在 本發明的權利要求范圍中。序列表<110>上海市農業科學院<120> 一種甘藍型油菜ERF-B3家族轉錄因子基因及其制備方法<160>2 <170>PatentIn version 3. 3
<210>SEQ ID No 1<211>603<212>DNA<213> 甘藍型油菜(Brassica napus)<400>ATGGCAACTATTGAGGAAATCTCTGATTTGGAGAAGCATCTCTTTGAAGACTTGTTGATCCCTGATGGTTTCATGGAAGATTTTGTCTTTGATGACGCTGCTTTTTTCTCAGGACTCTGGTCTCTAGAACCCTTAAACCAAGTTCCTAAACTGGAGCCTAGTTCACCTGTTCTTGATCCAGATTCGTATGTCCAAGAGTTTCTCCAAACAGAAGCAGAATCATCATCATCAACAACAACA
ACAACAACAACATCACCTGAGGTTGAAACTGTCTCAAACCGGAAAAGATCAAAGAGAGCTGAAGAGACAAGGCATTACAGAGGCGTGAGAAGGAGGCCATGGGGCAAATTCGCAGCAGAGATTCGAGATCCGGCTAAGAAAGGATCAAGGATTTGGCTAGGCACTTTTGAGAGTGATATTGATGCTGCAAGAGCTTATGACCATGAAGCTTTTAAGCTCAGGGGAAGAAAAGCTGTGCTCAACTTTCCTTTGGACGCAGGAAAGTATGATGCTCCGGTCAATTCTTGCCGGAAGAGGAGAAGATGCGATGTACCGGAGCCTCAAGGAATAGCTACGAGCAATTCATCATCAAAC<210>SEQ ID No 2<211>200<212>PRT<213> 甘藍型油菜(Brassica napus)<400>MATIEEISDLEKHLFEDLLIPDGFMEDFVFDDAAFFSGLWSLEPLNQVPKLEPSSPVLDPDSYVQEFLQTEAESSSSTTTTTTTSPEVETVSNRKRSKRAEETRHYRGVRRRPWGKFAAEIRDPAKKGSRIWLGTFESDIDAARAYDHEAFKLRGRKAVLNFPLDAGKYDAPVNSCRKRRRCDVPEPQGIATSNSSSNEF
權利要求
1.一種甘藍型油菜ERF-B3家族轉錄因子基因，其特征在于，所述轉錄因子基因的堿基 序列為SEQ ID No 1，具體如下 ATGGCAACTATTGAGGAAATCTCTGATTTGGAGAAGCATCTCTTTGAAGACTTGTTGATC CCTGATGGTTTCATGGAAGATTTTGTCTTTGATGACGCTGCTTTTTTCTCAGGACTCTGG TCTCTAGAACCCTTAAACCAAGTTCCTAAACTGGAGCCTAGTTCACCTGTTCTTGATCCA GATTCGTATGTCCAAGAGTTTCTCCAAACAGAAGCAGAATCATCATCATCAACAACAACA ACAACAACAACATCACCTGAGGTTGAAACTGTCTCAAACCGGAAAAGATCAAAGAGAGCT GAAGAGACAAGGCATTACAGAGGCGTGAGAAGGAGGCCATGGGGCAAATTCGCAGCAGAG ATTCGAGATCCGGCTAAGAAAGGATCAAGGATTTGGCTAGGCACTTTTGAGAGTGATATT GATGCTGCAAGAGCTTATGACCATGAAGCTTTTAAGCTCAGGGGAAGAAAAGCTGTGCTC AACTTTCCTTTGGACGCAGGAAAGTATGATGCTCCGGTCAATTCTTGCCGGAAGAGGAGA AGATGCGATGTACCGGAGCCTCAAGGAATAGCTACGAGCAATTCATCATCAAAC。
2.如權利要求1所述的甘藍型油菜ERF-B3家族轉錄因子基因，其特征在于，所述轉錄 因子基因編碼的蛋白質，其氨基酸序列為SEQ ID No 2，具體如下MATIEEISDLEKHLFEDLLIPDGFMEDFVFDDAAFFSGLWSLEPLNQVPKLEPSSPVLDP DSYVQEFLQTEAESSSSTTTTTTTSPEVETVSNRKRSKRAEETRHYRGVRRRPWGKFAAE IRDPAKKGSRIWLGTFESDIDAARAYDHEAFKLRGRKAVLNFPLDAGKYDAPVNSCRKRR RCDVPEPQGIATSNSSSNEF。
3.如權利要求1或2所述的甘藍型油菜ERF-B3家族轉錄因子基因，其特征在于，所述 轉錄因子基因為MuBnaERF-B3基因。
4.一種制備權利要求1所述的甘藍型油菜ERF-B3家族轉錄因子基因的方法，其特征在 于，通過體外分子進化獲得該轉錄因子基因，具體步驟如下1)通過野生型基因的改組突變獲得突變群體；2)通過突變群體的篩選，獲得一種新型甘藍型油菜ERF-B3家族轉錄因子基因；3)對活性增強基因的序列分析。
5.如權利要求1所述的甘藍型油菜ERF-B3家族轉錄因子基因，其特征在于，所述轉錄 因子基因的活性較甘藍型油菜野生型&iaERF-B3強。
全文摘要
本發明公開了一種甘藍型油菜ERF-B3家族轉錄因子基因，其堿基序列為SEQ ID No 1，其編碼的蛋白質的氨基酸序列為SEQ ID No 2。所述轉錄因子基因為MuBnaERF-B3基因，是通過體外分子進化制備而成。通過對甘藍型油菜野生型BnaERF-B3與本發明所述的甘藍型油菜轉錄因子MuBnaERF-B3酵母體內結合β-半乳糖苷酶活性測定，在pH＝7.0，25℃時，本發明的轉錄因子基因的β-半乳糖苷酶活性較甘藍型油菜野生型BnaERF-B3活性顯著增強，提高了近20倍。
文檔編號C12N15/10GK102094006SQ20091020101
公開日2011年6月15日 申請日期2009年12月11日 優先權日2009年12月11日
發明者付曉燕, 姚泉洪, 彭日荷, 朱波, 熊愛生, 田永生, 趙偉, 金曉芬, 高峰 申請人:上海市農業科學院