專利名稱：利用高產富硒功能雜交紅米米糠自發酵液生產松茸多糖的制作方法
技術領域：
利用高產富硒功能雜交紅米米糠自發酵液生產松茸多糖，屬于生物工程技術領域。涉及高產富硒功能雜交紅米611A/R319米糠自發酵液的制備和深層液體發酵法培養松茸菌絲體，其中高產富硒功能雜交紅米611A/R319米糠富含有適宜松茸菌生長所需的微量元素，利用其自身的酶類水解后制備成高產富硒功能雜交紅米611A/R319米糠自發酵液；發酵液體培養基中的土豆汁用高產富硒功能雜交紅米611A/R319米糠自發酵液替代，使松茸菌充分利用高產富硒功能雜交紅米611A/R319米糠中的營養元素，從而快速大量生長出
松茸菌絲體；然后收集菌絲體和發酵液，并分別用超聲波輔助熱水浸提法和乙醇醇提法從菌絲體和發酵液中提取松茸胞內粗多糖和胞外粗多糖，將二者合并得到產品松茸粗多糖。
二背景技術：
松茸(Tricholoma matsutake Sing)，又名松菌、松覃、松口蘑，屬擔子菌門(Basidiomycota)，擔子菌纟岡(Basidiomycetes)，傘菌目(Agaricales) ， 口蘑禾斗(Tricholomataceae) ， 口蘑屬(Tricholoma)。該菌菇體肥大，肉質細嫩，香味濃郁，別具風味，具有很高的營養價值和特殊的藥用效果。其子實體富含蛋白質、脂肪和人體必須的8種氨基酸，含有豐富的維生素Bl、維生素B2、維生素C及維生素PP，還含有菌類中少有的B-G酸、核酸衍生物、肽類、有機鍺、多糖等。是世界上享有很高聲譽的名貴食用菌。據分析，鮮松茸約含水分89.9%、在菌子中粗蛋白17%、純蛋白8.7%、粗脂肪5.8%、可溶性無氮化合物總量61.5%、粗纖維8.6%、灰分7. 1%。另外，松茸菌絲體中含有一種蒎稀(a-Pinene)的抗菌物質，能夠阻止病毒的繁殖。松口蘑具有強身、益腸胃、止痛、理氣化痰之功效。現代科學研究表明，松茸還具有治療糖尿病、抗癌等特殊作用，其主要藥理活性成分為多糖類物質。 松茸一般采用固體栽培法生產，但傳統的固體栽培法有周期長、質量不易控制等諸多弊端，而采用液體深層發酵技術，菌種經種子的多次擴大培養進入發酵罐，菌絲體在較短時間得以迅速擴增，比傳統的食用菌生產方法有明顯的優越性。而且研究表明，常以子實體用藥的真菌，在它們的菌絲體中亦含有與子實體相同的藥效成分和相似有效成分含量，這就給液體發酵法生產松茸多糖提供了理論依據。 米糠是稻谷加工的副產品，是稻谷脫殼后附著在糙米上的表皮層，由稻谷的種皮、外胚層、糊粉層、胚和少量胚乳構成，約占稻谷總量的5% -7%。國外最新研究證明，米糠含有稻米64%的營養成分及90%以上的人體所需元素，其中蛋白質含量約12% 18%、脂肪16% 20%、礦物質12%、膳食纖維約14%、碳水化合物總量約50%，另外還含有如膳食纖維、維生素、谷維素、礦物質、植酸和肌醇等多種功能物質，是極具開發潛力的一種高附加值資源。 有色稻米是由于在果皮和種皮上沉積色素而顯示出特定顏色的，它富含特殊的微量元素和營養物質，且其含量與色素密切相關。高產富硒功能雜交紅米611A/R319是四川大學與四川農業大學水稻研究所共同研究的高產雜交紅米，該雜交稻富含硒、鍺等有益微量元素；高產富硒功能雜交紅米611A/R319米糠是雜交紅米611A/R319在加工過程中的副產物，但富含有適宜大型真菌生長所需的微量元素，因此利用高產富硒功能雜交紅米611A/R319米糠發酵培養松茸并提取松茸粗多糖具有很高的應用價值。
發明內容
本發明的目的是提供一種利用高產富硒功能雜交紅米米糠自發酵液生產松茸多糖的方法，采用先進的生物技術，制備出高產富硒功能雜交紅米611A/R319米糠自發酵液，再利用高產富硒功能雜交紅米611A/R319米糠自發酵液深層發酵培養松茸菌絲體，使松茸菌充分利用高產富硒功能雜交紅米611A/R319米糠中的營養元素，從而快速大量生長出松茸菌絲體，大大縮短了生產周期，本發明的生產周期為5-7天(傳統的固體培養子實體的周期一般在30-50天左右)。本發明全部采用糧食原料，污染小，技術含量高，松茸多糖得率高，產品附加值高。 本發明的技術方案利用高產富硒功能雜交紅米611A/R319米糠中自身的酶類水解后制成高產富硒功能雜交紅米611A/R319米糠自發酵液，用于松茸菌液體深層發酵培養；將松茸菌孢子接種至新鮮的試管斜面上進行培養，待斜面長好后接種至液體培養基中進行種子液的培養；再通過三級培養，最后轉至3000L發酵罐中進行深層液體發酵培養，其中發酵液體培養基中的土豆汁用高產富硒功能雜交紅米611A/R319米糠自發酵液替代，使松茸菌充分利用高產富硒功能雜交紅米611A/R319米糠中的營養元素，從而快速大量生長出松茸菌絲體；發酵結束后，收集菌絲體和發酵液，并分別用超聲波輔助熱水浸提法和乙醇醇提法從菌絲體和發酵液中提取松茸胞內粗多糖和胞外粗多糖，將二者合并得到產品松茸粗多糖。
步驟為 1)高產富硒功能雜交紅米611A/R319米糠自發酵液制備取一定量高產富硒功能雜交紅米611A/R319米糠，60目過篩，按1 : 15的料液比加水混合均勻，于4(TC水浴保溫3h，利用米糠自身的酶類水解淀粉和蛋白質等，后紗布過濾得紅米糠自發酵液。
2)菌種培養 出發菌株為松茸(Tricholoma matsutake Sing.);
①斜面培養 培養基配方以g/L計葡萄糖20，硫酸鎂2.38，氯化鈣1，磷酸二氫鉀0. 5，磷酸二
氫銨0. 4，硝酸鉀0. 5， 土豆汁200，麥芽汁120，維生素BA 01，瓊脂20， pH自然； 培養方法將保存的松茸菌種斜面接種到新鮮的空白斜面上，在2fC下培養7-10
天；②500mL —級搖瓶種子培養，裝液量200mL : 培養基配方以g/L計葡萄糖20，硫酸鎂2.38，氯化鈣1，磷酸二氫鉀0. 5，磷酸二氫銨O. 4，硝酸鉀0. 5，土豆汁200，麥芽汁120，維生素BA01，pH自然;
培養方法將培養好的菌種斜面接種至已滅菌的搖瓶中，在24t:，轉速120rpm下培養7天；③5000mL 二級搖瓶種子培養，裝液量2000mL :
培養基配方以g/L計葡萄糖20，硫酸鎂2. 38，氯化鈣l，磷酸二氫鉀0. 5，磷酸二
氫銨0. 4，硝酸鉀0. 5，土豆汁200，麥芽汁120，維生素BA 01， pH自然； 培養方法將培養好的一級種子按10%的接種量接種至已滅菌的搖瓶中，在
24°C ，轉速120rpm下擴大培養5天，即成搖瓶種子液； 3)三級發酵培養 ①50L —級發酵種子罐培養，裝液量25-30L : —級發酵種子罐培養基配方以g/L計高產富硒功能雜交紅米611A/R319米糠自發酵液200，葡萄糖10，磷酸二氫鉀1 ，硫酸鎂0. 5，黃豆20，黃豆浸泡后用膠體磨磨漿離心后取汁，玉米粉5，麩皮50，麩皮水煮后取水溶性麩皮汁，酵母粉3，豆油2， pH自然；在0. 1Mpa下滅菌30min，冷卻后按10%的接種量接入搖瓶種子，溫度24°C，罐壓0. 05Mpa，通氣量1 : 0. 3 (V/V)，攪拌轉速120rpm，轉罐標準發酵時間45_48h，菌絲球上浮三分之一，鏡檢有鎖狀聯合，無雜菌； ②500L 二級發酵種子罐培養，裝液量250-300L : 二級發酵種子罐培養基配方以g/L計高產富硒功能雜交紅米611A/R319米糠自發酵液200，葡萄糖10，磷酸二氫鉀1 ，硫酸鎂0. 5，黃豆20，黃豆浸泡后用膠體磨磨漿離心后取汁，玉米粉5，麩皮50，麩皮水煮后取水溶性麩皮汁，酵母粉3，豆油2， pH自然；在0. 1Mpa下滅菌30min，冷卻后按15 %的接種量接入一級種子，溫度24°C，罐壓0. 05Mpa，通氣量1 : 0. 3 (V/V)，攪拌轉速120rpm，轉罐標準發酵時間35_40h，菌絲球上浮三分之一，鏡檢有鎖狀聯合，無雜菌； ③3000L發酵罐培養，裝液量1800L : 發酵培養基配方以g/L計高產富硒功能雜交紅米611A/R319米糠自發酵液200，葡萄糖10，磷酸二氫鉀1，硫酸鎂0. 5，黃豆20，黃豆浸泡后用膠體磨磨漿離心后取汁，玉米粉5，麩皮50，麩皮水煮后取水溶性麩皮汁，酵母粉3，豆油2， pH自然；在O. 1Mpa下滅菌30min，冷卻后按15X的接種量接入二級種子，溫度24t:，罐壓0. 05Mpa，通氣量l : 0. 3 (V/V)，攪拌轉速120rpm，轉罐標準發酵時間55_60h， pH5. 0，平板無雜菌，菌絲球上浮二分之一，鏡檢有鎖狀聯合，菌絲球不能自溶； 4)松茸多糖的提取將培養好的發酵液在5000-6000rpm下離心處理，分別收集好發酵液和菌絲體，菌絲體凍干保存； ①胞內粗多糖的獲取將收集到的菌絲體粉末按1 : 30的料液比加入蒸餾水，用頻率25Hz、功率400W的超聲波處理30min，后于90。C水浴中浸提多糖1. 5h，然后于4800rpm離心15min，棄沉淀，上清液在0. 095MPa， 5(TC下濃縮至原體積的1/2，再將濃縮液與95%乙醇按1 : 3 (v/v)混合，置4"下沉淀12h，在4800rpm離心15min，棄上清液，沉淀中加50mL蒸餾水使其重新溶解，按5 : l加入Sevag試劑(即氯仿異戊醇二4 : l)脫蛋白，然后加3倍體積的乙醇在fC下沉淀12h， 4800rpm離心15min，沉淀經真空冷凍干燥后得松茸胞內粗多糖； ②胞外粗多糖的獲取將收集到的離心后的發酵液減壓濃縮為原體積的五分之一后，用3倍體積的95%乙醇醇提12-16h，然后用5000-6000rpm離心20-30min，收集沉淀，將沉淀用少量蒸餾水復溶后冷凍干燥，即得松茸胞外粗多糖； ③產品的獲得將提取得到的松茸胞內粗多糖和松茸胞內粗多糖二者合并，即得
6產品松茸粗多糖。
5)檢驗檢驗標準如下
①多糖含量^20X
@蛋白質含量>4%
水分《8% 菌落總數《1000cfu/g，大腸桿菌《40npn/100g，酵母《25cfu/g，霉菌《25cfu/g，致病菌不得檢出，LD50為陰性。
⑤鉛《1. 5mg/kg，石申《1. Omg/kg。 本發明的有益效果本發明采用先進的生物技術，利用高產富硒功能雜交紅米611A/R319米糠自發酵液深層發酵培養松茸菌絲體，使松茸菌充分利用高產富硒功能雜交紅米611A/R319米糠中的營養元素，從而快速大量生長出松茸菌絲體，大大縮短了生產周期，本發明的生產周期為5-7天(傳統的固體培養子實體的周期一般在30-50天左右)。本發明全部采用糧食原料，污染小，技術含量高，松茸多糖得率高，產品附加值高。
具體實施例方式
1.高產富硒功能雜交紅米611A/R319米糠自發酵液制備取一定量高產富硒功能雜交紅米611A/R319米糠，60目過篩，按l : 15的料液比加水混合均勻，于4(TC水浴保溫3h，利用米糠自身的酶類水解淀粉和蛋白質等，后紗布過濾得紅米糠自發酵液。
2.種子液的制備將保存的松茸菌種斜面接種到新鮮的空白斜面上，在2fC下培養7-10天后將斜面上的菌體刮入事先滅好菌的裝有適量無菌水和玻璃珠的三角瓶中，振蕩10分鐘，制成菌懸液。吸4ml該菌懸液于事先滅好菌的2只500mL三角瓶中(按上述一級搖瓶配方配制的培養基，裝液量為200mL)，在2fC，轉速120rpm下培養7天得一級搖瓶種子；無菌條件下，將培養好的一級搖瓶種子一瓶倒入事先滅好菌的用上述二級搖瓶種子配方配制的5000mL (裝液量為2000mL)三角瓶中，在24°C ，轉速120rpm下培養5天，長好后將兩瓶種子液合并即成搖瓶種子液。 3. —級種子罐培養按上述一級種子罐培養基配方，在0. 1Mpa下滅菌30分鐘冷卻后接入搖瓶種子。按上述一級種子罐培養參數培養。采用50L全自動發酵罐，裝液量為25-30L。 4. 二級種子罐培養按上述二級種子罐培養基配方，在0. 1Mpa下滅菌30分鐘冷卻后接入一級種子。按上述二級種子罐培養參數培養。采用500L全自動發酵罐，裝液量為250-300L。 5.深層液體發酵培養采用3000L發酵罐，裝液量為1800L。按上述發酵培養基配方，相同條件滅菌后接入二級液體種子。按上述發酵罐的培養參數培養。
6.胞內粗多糖的獲取將培養好的發酵液用上述胞內粗多糖的提取方法，收集菌絲體，得到25kg干菌絲體，提取多糖后得到2. 2kg胞內粗多糖。 7.胞外粗多糖的獲取按上述胞外粗多糖的提取方法，得到260L濃縮液，提取多糖后得到5kg胞外粗多糖。 8.將二者合并得到松茸粗多糖7. 2kg。
權利要求
利用高產富硒功能雜交紅米米糠自發酵液生產松茸多糖，其特征是高產富硒功能雜交紅米611A/R319米糠自發酵液的制備和深層液體發酵法培養松茸菌絲體，其中高產富硒功能雜交紅米611A/R319米糠富含有適宜松茸菌生長所需的微量元素，利用其自身的酶類水解后制備成高產富硒功能雜交紅米611A/R319米糠自發酵液；將松茸菌孢子接種至新鮮的試管斜面上進行培養，待斜面長好后接種至液體培養基中進行種子液的培養；再通過三級培養，最后轉至3000L發酵罐中進行深層液體發酵培養，其中發酵液體培養基中的土豆汁用高產富硒功能雜交紅米611A/R319米糠自發酵液替代，使松茸菌充分利用高產富硒功能雜交紅米611A/R319米糠中的營養元素，從而快速大量生長出松茸菌絲體；發酵結束后，收集菌絲體和發酵液，并分別用超聲波輔助熱水浸提法和乙醇醇提法從菌絲體和發酵液中提取松茸胞內粗多糖和胞外粗多糖，將二者合并得到產品松茸粗多糖；步驟為1)高產富硒功能雜交紅米611A/R319米糠自發酵液制備取一定量高產富硒功能雜交紅米611A/R319米糠，60目過篩，按1∶15的料液比加水混合均勻，于40℃水浴保溫3h，利用米糠自身的酶類水解淀粉和蛋白質等，后紗布過濾得紅米糠自發酵液；2)菌種培養出發菌株為松茸(Tricholoma matsutake Sing.)；①斜面培養培養基配方以g/L計葡萄糖20，硫酸鎂2.38，氯化鈣1，磷酸二氫鉀0.5，磷酸二氫銨0.4，硝酸鉀0.5，土豆汁200，麥芽汁120，維生素B10.01，瓊脂20，pH自然；培養方法將保存的松茸菌種斜面接種到新鮮的空白斜面上，在24℃下培養7-10天；②500mL一級搖瓶種子培養，裝液量200mL培養基配方以g/L計葡萄糖20，硫酸鎂2.38，氯化鈣1，磷酸二氫鉀0.5，磷酸二氫銨0.4，硝酸鉀0.5，土豆汁200，麥芽汁120，維生素B10.01，pH自然；培養方法將培養好的菌種斜面接種至已滅菌的搖瓶中，在24℃，轉速120rpm下培養7天；③5000mL二級搖瓶種子培養，裝液量2000mL培養基配方以g/L計葡萄糖20，硫酸鎂2.38，氯化鈣1，磷酸二氫鉀0.5，磷酸二氫銨0.4，硝酸鉀0.5，土豆汁200，麥芽汁120，維生素B10.01，pH自然；培養方法將培養好的一級種子按10％的接種量接種至已滅菌的搖瓶中，在24℃，轉速120rpm下擴大培養5天，即成搖瓶種子液；3)三級發酵培養①50L一級發酵種子罐培養，裝液量25-30L一級發酵種子罐培養基配方以g/L計高產富硒功能雜交紅米611A/R319米糠自發酵液200，葡萄糖10，磷酸二氫鉀1，硫酸鎂0.5，黃豆20，黃豆浸泡后用膠體磨磨漿離心后取汁，玉米粉5，麩皮50，麩皮水煮后取水溶性麩皮汁，酵母粉3，豆油2，pH自然；在0.1Mpa下滅菌30min，冷卻后按10％的接種量接入搖瓶種子，溫度24℃，罐壓0.05Mpa，通氣量1∶0.3(V/V)，攪拌轉速120rpm，轉罐標準發酵時間45-48h，菌絲球上浮三分之一，鏡檢有鎖狀聯合，無雜菌；②500L二級發酵種子罐培養，裝液量250-300L二級發酵種子罐培養基配方以g/L計高產富硒功能雜交紅米611A/R319米糠自發酵液200，葡萄糖10，磷酸二氫鉀1，硫酸鎂0.5，黃豆20，黃豆浸泡后用膠體磨磨漿離心后取汁，玉米粉5，麩皮50，麩皮水煮后取水溶性麩皮汁，酵母粉3，豆油2，pH自然；在0.1Mpa下滅菌30min，冷卻后按15％的接種量接入一級種子，溫度24℃，罐壓0.05Mpa，通氣量1∶0.3(V/V)，攪拌轉速120rpm，轉罐標準發酵時間35-40h，菌絲球上浮三分之一，鏡檢有鎖狀聯合，無雜菌；③3000L發酵罐培養，裝液量1800L發酵培養基配方以g/L計高產富硒功能雜交紅米611A/R319米糠自發酵液200，葡萄糖10，磷酸二氫鉀1，硫酸鎂0.5，黃豆20，黃豆浸泡后用膠體磨磨漿離心后取汁，玉米粉5，麩皮50，麩皮水煮后取水溶性麩皮汁，酵母粉3，豆油2，pH自然；在0.1Mpa下滅菌30min，冷卻后按15％的接種量接入二級種子，溫度24℃，罐壓0.05Mpa，通氣量.1∶0.3(V/V)，攪拌轉速120rpm，轉罐標準發酵時間55-60h，pH5.0，平板無雜菌，菌絲球上浮二分之一，鏡檢有鎖狀聯合，菌絲球不能自溶；4)松茸多糖的提取將培養好的發酵液在5000-6000rpm下離心處理，分別收集好發酵液和菌絲體，菌絲體凍干保存；①胞內粗多糖的獲取將收集到的菌絲體粉末按1∶30的料液比加入蒸餾水，用頻率25Hz、功率400W的超聲波處理30min，后于90℃水浴中浸提多糖1.5h，然后于4800rpm離心15min，棄沉淀，上清液在0.095MPa，50℃下濃縮至原體積的1/2，再將濃縮液與95％乙醇按1∶3(v/v)混合，置4℃下沉淀12h，在4800rpm離心15min，棄上清液，沉淀中加50mL蒸餾水使其重新溶解，按5∶1加入Sevag試劑(即氯仿∶異戊醇＝4∶1)脫蛋白，然后加3倍體積的乙醇在4℃下沉淀12h，4800rpm離心15min，沉淀經真空冷凍干燥后得松茸胞內粗多糖；②胞外粗多糖的獲取將收集到的離心后的發酵液減壓濃縮為原體積的五分之一后，用3倍體積的95％乙醇醇提12-16h，然后用5000-6000rpm離心20-30min，收集沉淀，將沉淀用少量蒸餾水復溶后冷凍干燥，即得松茸胞外粗多糖；③產品的獲得將提取得到的松茸胞內粗多糖和松茸胞內粗多糖二者合并，即得產品松茸粗多糖。
全文摘要
利用高產富硒功能雜交紅米米糠自發酵液生產松茸多糖，屬于生物工程技術領域。本發明主要包括高產富硒功能雜交紅米611A/R319米糠自發酵液的制備，松茸菌種的培養，發酵工藝，菌絲體和發酵液的收集，松茸胞內粗多糖和胞外粗多糖的提取，并將二者合并得到產品松茸粗多糖。其中高產富硒功能雜交紅米611A/R319米糠是雜交紅米611A/R319在加工過程中的副產物，但富含有適宜松茸菌生長所需的微量元素，利用其自身的酶類水解后制備成米糠自發酵液，再用于松茸菌的深層液體發酵培養，使松茸菌充分利用該紅米米糠中的營養元素，從而快速大量生長出松茸菌絲體。用本發明方法生產松茸多糖，周期短，成本低，工藝簡便，有效成分含量高，附加值高，適宜工業化生產。
文檔編號C12P1/00GK101748153SQ20101010120
公開日2010年6月23日 申請日期2010年1月26日 優先權日2010年1月26日
發明者曹玫, 朱建清, 聶遠洋, 趙建, 顏亮 申請人:四川大學