用于米糠和麩皮全料液態發酵生產靈芝多糖的菌株的制作方法
【專利摘要】本發明屬于微生物應用技術和食品生物【技術領域】，公開了用米糠麩皮全料液態培養基生產多糖的靈芝菌株。靈芝JSU6161314已于2013年6月25日保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，編號為CCTCC?M2013287，名稱為靈芝CCTCC?M2013287(Ganoderma?lucidum?CCTCC?M2013287)。本發明通過附圖方法，由靈芝CFCC6043出發得到能高產靈芝多糖的所述新菌株。該新菌株在米糠麩皮全料液態新培養基中快速發酵并高產靈芝多糖，上罐發酵的菌絲干重和菌絲多糖產率較出發菌株增加了23.0％和45％。
【專利說明】用于米糠和麩皮全料液態發酵生產靈芝多糖的菌株
【技術領域】
[0001]本發明涉及食品微生物應用【技術領域】，尤其涉及一株適合在米糠和麩皮全料復合液態培養基中生長并高產靈芝多糖的靈芝菌株的新誘變菌株。
【背景技術】
[0002] 自從 Chihara 等人(參考文獻:Chihara G, MaedaY, Hamuro J, et al.1nhibitionof mouse sarcomal80by polysaccharides from Lentinus edodes(Berk.)sing[J].Nature, 1969，222 (5194):687-688.)于1969年在《Nature》上發表論文，揭示香菇多糖具有抗腫瘤活性以來，已經發現具有抗腫瘤活性的藥用真菌達兩百多種，其中一部分還是食用真菌，如灰樹花、猴頭菌、靈芝等。這些食用菌的菌絲體、子實體、菌核或孢子中能產生諸如氨基酸、蛋白質、維生素、多糖、苷類、黃酮類及抗生素等多種活性成分或富集微量元素硒、鋅等，具有提高人體免疫力、抗腫瘤、增強肝功能、抗氧化等多種功效。國內市場已有食用菌保健食品如靈芝膠囊、灰樹花膠囊及冬蟲夏草膠囊等在熱銷。國際上新西蘭、日本、美國等均產有類似的產品。新西蘭的“GanoPoly”系列產品由靈芝、云芝等提取的多糖復合殼聚糖而成，主要用于提高免疫力、輔助抗腫瘤治療等方面。就靈芝多糖而言，針對其的研究表明:靈芝多糖具有良好的提聞免疫力、輔助抗腫瘤治療等療效，例如Huang、Seto等從靈芝菌體中提取靈芝多糖的藥效試驗表明，靈芝多糖具有免疫調節作用和抗腫瘤作用(參考文獻見
①Huang S.Q.,Ning Z.X.Extraction of polysaccharide from Ganoderma lucidum andits immune enhancement activity[J].1nt J Biol Macromol，2010，47 (3):336 ~341 ;
②Seto S.ff., Lam T.Y, Tam H.L., et al.Novel hypoglycemic effects of Ganodermalueidum water-extract in obese/diabetic(db/+db)mice[J].Phytomedicine,2009,
(16):426 ~436 ;③ Hikino H, Konno C, Mirin Y, et al.1solation and hypoglycemicactivity of ganoderans A and B, glycans of Ganoderma lucidum fruit bodies[J]。Planta Med，1985， (12):339 ~340)
[0003]靈芝(Ganoderma Iuccidum)別名芝草、瑞草,是真菌門,擔子菌亞門,層菌綱,非裙菌目，靈芝菌科，靈芝屬真菌，主要分布于亞洲、澳洲、非洲和美洲的熱帶及亞熱帶地區，少數也分布于溫帶地區，地處北半球溫帶的歐洲僅有靈芝屬的4種，而北美洲大約5種。中國地跨熱帶至寒溫帶，靈芝科種類多而分布廣，是世界靈芝屬真菌物種多樣性最豐富的國家之一。傳統上，靈芝的獲取方式主要是人工栽培或野外采集，以子實體或孢子粉入藥。但人工栽培靈芝周期長、生產效率低、勞動強度大，又受季節、環境等限制，易遭病蟲害，質量與產量不穩定，而野外采集靈芝數量有限，難以滿足大生產要求。食用菌液體深層發酵技術，比傳統的子實體栽培法具有明顯的優勢。為高效生產靈芝多糖，研究人員十分重視對促進工業化生產的液體培養方法的研究，獲得了許多研究成果。組曉艷、曾曉希等對靈芝液態培養的條件進行了研究，此類研究的主要內容涉及生產菌種、培養基成分和發酵工藝參數，將降低生產成本以及提高多糖產量作為研究重點。其中多數工藝采用如淀粉、馬鈴薯、葡萄糖等作為培養基成分，即便利用到農產品加工副產品如米糠或者麩皮，也是將其作為次要成分，仍是以糧食類原料、葡萄糖、或其他原料為主要碳源和氮源。[0004]中國是農業大國，農副產品來源豐富。米糠、麩皮作為稻谷和小麥加工的副產物，不但其營養成分豐富，而且價格低廉。米糠中富含淀粉、纖維素等物質，而麩皮富含蛋白、纖維素等物質。從理論上講，米糠和麩皮復合已經具備了靈芝生長所需要的碳源和氮源物質。在靈芝自身纖維素酶及其他酶的作用下，靈芝可將米糠和麩皮轉化成自身的營養物質進行生長，生產靈芝多糖。因此，運用米糠、麩皮等廉價農副產品，完全替代葡萄糖等靈芝液體發酵所需的營養物質，生產具有輔助腫瘤治療的靈芝糖，對低端原料的高值化應用具有重要意義，具有極高的經濟價值。
[0005]根據本專利發明人劉偉民課題組多年的研究經驗，一些食用菌菌株在不添加葡萄糖或者其他糧食類原料的米糠或麩皮液態培養基上生長狀況并不太理想，需要作特殊處理如菌種誘變以獲得良好的生長。例如，劉偉民指導多名碩士研究生對食用菌灰樹花液態發酵米糠或麩皮進行過深入的研究，獲得了一些成果，形成如下文獻:(I)楊鎖華.灰樹花發酵米糠制備多糖[D].碩士學位論文.鎮江:江蘇大學.2006 ; (2)顧慧敏.灰樹花在米糠培養基中液態培養產多糖和富集有機硒的研究[D].碩士學位論文.鎮江:江蘇大學.2009 ；
(3)張建.物理法誘變灰樹花液體發酵米糠麩皮產多糖的研究[D].碩士學位論文.鎮江:江蘇大學，2010 ; (4)郭春梅.灰樹花的菌種誘變、液體發酵米糠麩皮產多糖及富硒研究[D].碩士學位論文.鎮江:江蘇大學，2011 ; (5)李永轉.轉化米糠和麩皮高產多糖的灰樹花菌株誘變和已有菌的發酵試驗[D].碩士學位論文.鎮江:江蘇大學，2012 ; (6)劉偉民，張建，郭春梅，等.用于米糠和麩皮復合原料生產多糖的灰樹花菌株[P]，10579078.5，2010 ； (7)劉偉民，張建，郭春梅，等.使用米糠麩皮復合原料和灰樹花誘變菌株生產多糖的方法[P] ,1010579048.4，2010 ; (7)劉偉民，郭春梅，張建，等.用于發酵米糠和麩皮提取液生產灰樹花多糖的菌株[P]，10150888.3，2011(申請)；(8)李亞楠.灰樹花菌種誘變及發酵和產物性能研究[D].碩士學位論文.鎮江:江蘇大學，2013 (該論文
【公開日】期為2013年6月，與本專利的申請提交年月相同)；(9)趙莉.灰樹花在米糠麩皮復合培養基中液態發酵富集錳的研究[D].碩士學位論文.鎮江:江蘇大學，2012 ; (10)劉麗麗.高值轉化米糠麩皮的靈芝液體發酵及菌種誘變[D].碩士學位論文。鎮江:江蘇大學，2012 ; (11)郭天龍.靈芝菌種誘變及液態發酵高值化轉化全米糠麩皮研究[D].碩士學位論文.鎮江:江蘇大學，2013(該論文
【公開日】期為2013年6月，與本專利的申請提交年月相同)。
[0006]由上述參考文獻可知，本專利發明人劉偉民一直圍繞米糠麩皮高效高值化轉化為珍稀食用菌多糖這一專題進行研究，實現多個發明創造設想，并提出了用靈芝進行米糠麩皮全料液體發酵，高效高值化轉化米糠麩皮為靈芝多糖的研究思路，對原始菌株加以誘變處理，在指導劉麗麗誘變試驗不成功(為負誘變，見劉麗麗碩士論文P46對表5.2的分析，劉麗麗的碩士論文全部采用米糠麩皮過濾取汁作培養基，不是本發明的米糠麩皮全料液態培養基)的基礎上，總結經驗，再指導郭天龍進行系統的研究，得到了正誘變菌株，并新提出了誘變菌株液態發酵米糠麩皮全料，高效高值化轉化米糠麩皮為靈芝多糖的方法，形成了本發明專利和同時申報的另一個發明專利的內容。郭天龍的碩士論文
【公開日】期為2013年6月，與本專利的申請提交年月相同，不影響本發明的新穎性。
[0007]本發明的關鍵問題之一為必須得到一種靈芝新菌株，此新菌株能在米糠麩皮全料液態培養基上有效生長并高效轉化米糠麩皮全料為靈芝多糖。新菌株的建立及新菌株對米糠麩皮的新利用方式都需要創新，適合于新靈芝菌株的米糠和麩皮組成液體培養基的配比及液態發酵的工藝條件均需新研究得出，還未見報道，因此本發明具有獨特、創新和實用性，具備發明專利的基本特征。
[0008]目前微生物的物理選育方法主要有紫外誘變、微波誘變、離子束誘變等。為了誘變篩選出適合在全米糠麩皮復合培養基上生長并產多糖的靈芝菌株，本發明采用簡單的物理誘變方法，同時進行紫外誘變和微波誘變試驗，擴大被試靈芝出發菌株突變的位點范圍，提高得到正突變菌株的可能性。本發明誘變得到的適合在全米糠麩皮復合培養基上生長并產靈芝多糖的菌株為首次發明得到。
【發明內容】
[0009] 本發明為了減少使用土地和降低生產周期，降低生產成本，將低端原料加以高值化轉化利用，最終能降低靈芝多糖產品價格，惠及大眾，考慮采用大宗農產品稻谷和小麥加工的副產品米糠和麩皮作為培養基，不再添加其他碳源如葡萄糖和氮源，進行靈芝的液體發酵，生產靈芝多糖。要實現此目的，需要誘變篩選出在米糠麩皮全料液態培養基上適宜生長的靈芝菌株。因此，本發明將通過紫外、微波誘變的方法，以高產多糖為指標，定向轉化米糠麩皮為基礎，選育出高產、低成本的靈芝菌株。通過一系列的穩定性、遺傳性等篩選方法的建立，保證靈芝的優良性狀，為進一步大規模利用低成本的米糠和麩皮生產高價值的靈芝多糖奠定基礎。
[0010]本發明所采取的技術方案如下:
[0011]本發明由中國林業微生物菌種保藏管理中心(CFCC)的靈芝CFCC6043 (Ganodermalucidum CFCC6043)出發，通過紫外和微波的誘變篩選，提供一種新靈芝誘變菌株靈芝JSU6161314 (Ganoderma lucidum JSU6161314)，可以在不加其他碳源和氮源的米糠麩皮全料液態培養基上具有高生長速率和高多糖產量；該靈芝JSU6161314已經于2013年6月25日保藏在中國武漢武漢大學中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏菌株編號為CCTCCM2013287，名稱為靈芝CCTCC M2013287 (拉丁名為 Ganoderma lucidum CCTCC M2013287)。
[0012]在本發明的一個方面中，提供上述靈芝CCTCC M2013287的用途，用于發酵米糠麩皮全料液態培養基生產靈芝多糖。
[0013]本發明的有益效果
[0014]本發明采用簡單的物理誘變技術紫外和微波誘變技術選育靈芝高產菌株，由實驗室現有的靈芝CFCC6043出發，進行紫外和微波并行誘變，以生長速率、菌絲干重和胞外多糖為指標進行篩選，最終獲得靈芝CCTCC M2013287，在不加其他碳源和氮源的米糠麩皮全料液態培養基中生產靈芝產多糖，與原始菌株靈芝CFCC6043相比產量更高，由微波誘變菌株所得菌株靈芝CCTCC M2013287上罐發酵時菌絲干重和菌絲多糖產率產量為
6.3g/100mL培養基和0.203mg/100mL培養基，出發菌株靈芝CFCC6043菌絲干重和菌絲多糖產量為5.12g/100mL培養基和0.14mg/100mL培養基，誘變菌株靈芝CCTCC M2013287發酵的菌絲干重和菌絲多糖產率比出發菌株靈芝CFCC6043的菌絲干重和菌絲多糖產量分別增加了 23.0%和45%。經過靈芝CCTCC M2013287與出發菌株靈芝CFCC6043的拮抗試驗證明誘變后的菌株與出發菌株在遺傳特性上有所不同，篩選時誘變菌株靈芝CCTCC M2013287生長特性明顯快于出發菌株靈芝CFCC6043，從而可以判定誘變菌株為所希望的新菌株。此新菌株靈芝CCTCC M2013287為首創得到，屬于一種新的微生物資源，具有獨特性、創新性。以新菌株靈芝CCTCC M2013287為基礎，形成了新的發酵米糠麩皮全料液態培養基的方法，該方法改變了以往米糠麩皮過濾取汁或纖維素酶處理后取汁使得米糠麩皮利用率低的缺點，高效利用了廉價的米糠麩皮，可以降低生產成本，減少資源消耗，增加產量。所述誘變株靈芝CCTCC M2013287在相同的米糠麩皮使用量條件下，誘變菌株靈芝CCTCC M2013287發酵的菌絲干重和菌絲多糖產率比出發菌株靈芝CFCC6043的菌絲干重和菌絲多糖產量分別增加了 23.0%和45%，增產效果顯著。本發明產生了技術進步的有益效果。[0015]最終產品為具有增強免疫力、輔助腫瘤治療等功效的靈芝多糖，可以成為大眾保健的有益產品。將低端原料高值化轉化利用，節約了成本和資源。因此，本發明具有良好的社會效益。
[0016]終端產品靈芝多糖目前在市場上價格較高，為高值化產品，本發明具有良好的經濟價值。
[0017]綜上，本發明已經具備了發明專利的獨特性、創造性和實用性，產生了有益技術、社會和經濟效果。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1為本發明菌株紫外微波并行誘變選育方法的流程圖；
[0019]圖2為紫外照射效果，其中注:左邊為照射Os，右邊為照射90s ；
[0020]圖3為微波照射效果，其中注:左邊為照射Os，右邊為照射IOs ；
[0021]圖4為菌株生長狀態，其中注:從左至右依次為紫外9號、靈芝CCTCC M2013287、出發菌株；
[0022]圖5為菌株液體種子形態比較，其中注:從左至右依次為出發菌株、紫外9號、靈芝CCTCC M2013287 ；
[0023]圖6為誘變株靈芝CCTCC M2013287與出發菌株靈芝CFCC6043的拮抗圖，其中注:左邊為原始菌株靈芝CFCC6043，右邊為誘變株靈芝CCTCC M2013287。
【具體實施方式】
[0024]本發明按照說明書附圖1所示的流程，提供了紫外和微波誘變選育在不加其他碳源和氮源的米糠麩皮復合培養基上具有高生長速率和高多糖產量的靈芝菌株的方法，所述方法包括下列步驟:
[0025]?取實驗室現有的靈芝為出發菌株；
[0026]?將靈芝菌株接種于固體斜面培養基上進行正常培養；
[0027]?菌體培養后生理鹽水洗脫制得孢子懸液；
[0028]?將上述得到的孢子懸液在紫外燈下照射以及微波輻射進行誘變后，無光暗培養，一次篩選出生長速率較快、比較穩定的菌株；
[0029]?在全米糠、麩皮液體發酵培養基上進行發酵，二次篩選高生長速率和高多糖產量的菌株；
[0030]?進行穩定性和遺傳性分析和鑒定；
[0031 ] 在一個實施方案中，所用的固體斜面培養基為馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，硫酸鎂0.75g/L，維生素BJOmg/L，瓊脂20g/L，pH自然。
[0032]在一個實施方案中，所述恒溫為28 °C。
[0033]在一個實施方案中，所述紫外誘變采用紅光暗操作，以二個功率為30W的紫外燈管作為紫外誘變的光源，距離20cm，照射30s。
[0034]在一個實施方案中，所述無光暗培養為在28°C下無光培養2-3天。[0035]在一個實施方案中，所述無光暗培養所用培養基為米糠、麩皮固體平板培養基:米糠 20g/L，麩皮 30g/L，磷酸二氫鉀 1.5g/L，硫酸鎂 0.75g/L，維生素 B1IOmgzUI^g 20g/L，pH自然。
[0036]在一個實施方案中，所述篩選方法為平板直徑測定法。
[0037]在一個實施方案中，所述微波誘變采用紅光暗操作，微波功率700W，脈沖頻率2450Hz，誘變時間20s。
[0038]在一個實施方案中，所述一次篩選步驟為:從紫外誘變、微波誘變無光暗培養平板上挑取生長良好的單菌落分別接種至新的米糠麩皮固體平板培養基中，挑選出10株生長速度快且濃密的誘變株，對其傳代培養，從中選出3株相對于出發菌株生長快、形狀好、穩定性高的菌株。
[0039]在在一個實施方案中，所述二次發酵篩選步驟為:初次生長確定的高生長速率變異株作為二次篩選的對象，與出發菌株一起進行發酵篩選從而確定變異株優良性狀穩定表達的菌株。將初次篩選菌株和出發菌株進行搖瓶發酵試驗，連續發酵5代，按指標確定目的誘變株。
[0040]在一個實施方案中，所述搖瓶為250mL錐形瓶。
[0041]在一個實施方案中，所述米糠、麩皮液體發酵培養基為:米糠20g/L，麩皮30g/L(米糠、麩皮水煮4h不取汁即全利用)，磷酸二氫鉀1.5g/L，硫酸鎂0.75g/L，維生素BJOmg/L, pH 自然。
[0042]在一個實施方案中，所述指標為胞外多糖、菌絲(混合少量原料)干重和菌絲多糖。
[0043]本發明中轉化米糠和麩皮復合原料的靈芝突變株的分析鑒定方法，所述方法包括下列步驟:
[0044]?菌落形態比對；
[0045]?穩定性分析；
[0046]在一個實施方案中，所述為菌落形態比對，將斜面上的出發靈芝菌株和JSU61613菌株接種到固體斜面培養基上，各6個重復，在28 °C恒溫培養箱中培養7天，每天觀察一次，觀察包括菌落的生長速度、顏色、菌落形狀、氣味等。
[0047]在一個實施方案中，所述穩定性分析為以菌絲生長速度為指標考察穩定性,對最終篩選出10株較優的變異菌株，經5次傳代，選出最優的JSU6161314菌株，將該株變異菌株再傳代3代，觀察菌絲生長速度的變化，從而確定穩定性，并與出發菌株對比。
[0048]在一個實施方案中,所述遺傳性分析為拮抗分析。
[0049]實施例1靈芝紫外線-微波誘變
[0050]①孢子懸液的制備
[0051]將靈芝接種在9cm滅好菌的固體培養基平板上培養4d后用IOmL無菌生理鹽水沖洗，用滅菌的毛筆來回掃刷營養體，收集洗液即得。
[0052]②紫外誘變效應曲線及紫外線誘變劑量的選擇
[0053]取20個9cm平皿，每皿分別裝有新制備的孢子懸液5mL。每兩個為一組，共分為10組。分別照射0、5、10、15、20、25、30、45、60、150s(90s照射效果見附圖2)，然后每皿取ImL適當稀釋后涂平板。平板用黑布包裹后置于黑暗閉光的28°C恒溫箱培養。待平板長出菌落后，菌落計數。每組以兩個皿菌落數的平均值作為該組的菌落數。計算誘變致死率，以誘變致死率為指標選擇紫外線誘變劑量。
[0054]
誘變致死率=X100%
B
[0055] 式中，A為誘變后菌落再生數；B為誘變前菌落數。
[0056]③紫外誘變
[0057]打開紫外線預熱約20min，取直徑9cm無菌培養皿2套，分別加入上述調整好的孢子懸液5mL，并放入震動器上，打開板蓋，在距離為20cm，功率為30W的紫外燈下按上述選擇最佳照射劑量分別照射。蓋上皿蓋，關閉紫外燈。照射計時從開蓋起，加蓋止。先開震動器開關，再開蓋照射，使孢子懸液中的細胞接受照射均勻等。
[0058]④微波誘變
[0059]吸取制得的孢子懸液，注入底部平整的平皿中，每個平皿的懸液量為10mL，調整微波功率為700W，脈沖頻率為2450Hz，按照不同的處理時間，對孢子懸液進行輻照處理(IOs照射效果見附圖3)。吸取孢子懸液0.3mL，涂布米糠、麩皮固體平板培養基，然后置于28°C恒溫箱培養3d。活菌計數，計算致死率。連續誘變10批，挑選在米糠麩皮培養基上能最先生長出來、健壯、純正的菌株。
[0060]④誘變菌株的篩選
[0061]取紫外照射、微波輻射的菌懸液0.2mL，用無菌玻璃涂棒均勻地涂滿米糠、麩皮固體平板培養基表面，每批涂5個平皿，誘變10批，將再生的單菌落分別接種至新的平皿中，挑選出10株生長速度快且濃密的誘變株,對其傳代培養,從中選出3株相對于出發菌株生長快、形狀好、穩定性高的菌株。
[0062]將上述靈芝誘變株進行搖瓶發酵試驗，以胞外多糖、菌絲混合干重為指標，篩選出目的誘變株。
[0063]表1選出菌株各代發酵菌絲混合干重
[0064]
【權利要求】
1.用于米糠和麩皮全料液態發酵生產靈芝多糖的菌株，其特征在于保藏于武漢中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC)的靈芝CCTCC M2013287 (Ganoderma lucidum CCTCCM2013287)。
【文檔編號】A01G1/04GK103477994SQ201310274915
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年6月28日 優先權日:2013年6月28日
【發明者】劉偉民, 郭天龍, 沈國棟, 張笑飛, 周文彪, 趙杰文, 馬海樂 申請人:江蘇大學