一種利用dna熔解溫度分析水稻香味基因的功能標記及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用DNA熔解溫度分析水稻香味基因的功能標記及其應用，屬于生物【技術領域】。本發明根據水稻香味基因fgr與正常的等位基因BAD2在編碼區第7外顯子的序列差異設計香味基因功能標記BAD2-E7。利用該標記進行兩輪PCR擴增，第一輪PCR以基因組DNA為模板，利用外側引物擴增；第二輪PCR以稀釋的第一輪PCR擴增產物為模板，利用內側引物擴增。利用儀器檢測第二輪PCR擴增產物DNA熔解溫度，通過熔解溫度高低區分fgr和BAD2序列差異，從而判別水稻材料的基因型（香味或非香味）。
【專利說明】—種利用DNA熔解溫度分析水稻香味基因的功能標記及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，具體地涉及一種利用DNA熔解溫度分析水稻香味基因的功能標記及其應用。
【背景技術】
[0002]水稻是我國重要的農作物，香味是高品質稻米的一個重要特性，香型稻米的價格比非香型稻米的價格高，其育種工作得到了廣泛重視。選擇是香型稻米育種中最重要環節之一。傳統的香稻育種選擇方法，是通過表現型間接對香味基因型進行選擇，這種方法存在周期長、效率低、準確性較差等缺點。最有效的選擇，應是直接對香味基因型進行選擇，DNA分子標記的出現為這種 直接選擇提供了可能。
[0003]絕大多數香稻品種的香味性狀主要受位于第8染色體上的一對隱性基因fgr控制。Bradbury等研究認為，是編碼甜菜醛脫氫酶2的基因似似在第七外顯子發生8個堿基缺失和3處堿基變異，導致轉錄提前終止而使得BAD2酶喪失功能，進而使其的作用底物2-乙酰-1-卩比咯啉(2-acetyl-l-pyrroline, 2AP)的代謝途徑中斷，香味物質2AP不斷積累，致使水稻的葉片和籽粒產生香味。針對該功能變異位點，基于凝膠電泳的功能標記GRFM04已被開發并用于香型水稻種質的鑒定。
[0004]成本低、簡便實用、重復性好的共顯性標記，是有效開展香稻分子輔助選擇育種的重要基礎。傳統凝膠電泳的分辨率有限，無法滿足廣泛存在的SNP或Indel檢測需求；此外，傳統的凝膠電泳操作費時、具有一定毒性，要實現大批量分離群體的標記檢測難度較大。因此，繼續開發新型功能型分子標記，是水稻分子育種進步的必然需求。
[0005]DNA序列的差異會導致DNA熔解溫度的不同，如果能利用DNA熔解溫度檢測基因型，將可避免凝膠電泳的缺陷，實現批量化、自動化、全封閉的基因型檢測。利用DNA熔解溫度判別基因型在人類疾病的研究中已有報道，但是，該技術涉及環節較多、需詳盡的前期優化工作，目前在水稻上系統開展此技術研究的報道較少，這在一定程度上限制了其在水稻育種中的廣泛應用。
【發明內容】
[0006]本發明要解決的技術問題克服目前傳統水稻香味基因檢測技術的缺陷，提供了一種利用DNA熔解溫度分析水稻香味基因的功能標記。
[0007]本發明的另一個目的是提供一種利用DNA熔解溫度分析水稻香味基因的功能標記的應用。
[0008]本發明的目的通過以下技術方案予以實現:
一種水稻香味基因功能標記BAD2-E7，所述BAD2-E7由一對內側引物BAD2_E7-1n_F/BAD2-E7-1n-R 和一對外側引物 BAD2-E7-out-F/BAD2-E7_out-R 組成，BAD2-E7-1n_F、BAD2-E7-1n-R、BAD2-E7-out_F 和 BAD2-E7_out-R 引物序列如 SEQ ID NOl?4 所示。[0009]一種如上所述水稻香味基因功能標記BAD2-E7的應用，所述應用為用于區分香型水稻和非香型水稻。
[0010]一種區分香型水稻和非香型水稻的方法，包括以下步驟:
51.以待測水稻基因組DNA為模版，利用權利要求1所述的外側引物BAD2-E7-out-F/ BAD2-E7-out-R 進行 PCR 擴增；
52.將步驟SIPCR擴增的產物稀釋，以之為模版，利用權利要求1所述的內側引物 BAD2-E7-1n-F/BAD2-E7-in-R 進行 PCR 擴增；
53.檢測步驟S2擴增所獲的DNA的熔解溫度，如果待測DNA的熔解溫度在79-79.6°C 之間，待測水稻為非香型水稻；如果待測DNA的熔解溫度在77.3-77.9°C之間，待測水稻為香型水稻。
[0011]本發明通過研究發現水稻香味基因的熔解溫度為77.6°C，正常的等位基因 BAD2的熔解溫度為79.3°C，水稻香味基因fgr的熔解溫度比正常的等位基因似似的熔解溫度低了 1.7°C，所以，通過熔解溫度就可以區分和似似序列差異，從而判別水稻材料的基因型(香味或非香味)。如果待測水稻的DNA的熔解溫度在79-79.6°C之間，可判斷待測水稻為非香型水稻，如果待測DNA的熔解溫度在77.3-77.9°C之間，可判斷待測水稻為香型水稻。
[0012]不同品種的香型水稻都含有水稻香味基因/gr，不同品種的香型水稻的fgr基因序列的相似度在99.5%以上，所以，只要是是香型水稻，無論是什么品種，通過BAD2-E7標記擴增的DNA序列的熔解溫度都會在77.6°C左右范圍，這個范圍前后不會超過0.3°C。
[0013]優選地，步驟S2所述的稀釋為稀釋15-20倍。
[0014]優選地，步驟SI所述PCR反應體系為:
2 X Power Taq PCR MasterMix 母液 5 U L ；
外側引物(10 U mol/L)各 0.3 u L ；
基因組DNA0.5 u L ；
雙蒸水補足10 ii L ;
PCR 擴增程序為 95°C，5min; 95°C , 20s; 57°C , 20s; 72°C , 10s; 25 個循環； 72 °C，5min。
[0015]優選地，步驟SI所述PCR反應體系為:
2X Power Taq PCR MasterMix 母液4 U L ；
內側引物(10 u mol/L)各 0.3 UL ；
20 X EvaGreen 染料0.5 u L ；
稀釋過的第一輪PCR產物0.5 UL ；
雙蒸水補足10 ii L ;
PCR 擴增程序為 95°C，2min; 95°C , 20s; 59°C , 20s; 72°C , 10s;共 25 個循環； 72 °C , 5min; 95 °C , 2min ；25°C , 2min。
[0016]優選地，步驟S3所述的熔解溫度曲線為6(T95°C的熔解曲線。
[0017]優選地，步驟S3所述的對比，熔解溫度曲線為75°C-82°C的熔解曲線。
[0018]比現有技術相比，本發明具有以下有益效果:
1.提供的檢測方法簡單，比原來的通過基因測序或凝膠電泳的方法來確定基因型更加的簡便、快捷；此外，此方法不接觸有毒試劑，對操作人員的健康有利。
[0019]2.本發明提供的功能標記通過兩次PCR擴增目的片段，顯著提高了目的片段產物的特異性，使結果的判讀更加準確。
[0020]3.本發明所提供的方法，檢測準確率高，可用于大規模的篩選目標基因。
[0021]說明書附圖
圖1.功能標記BAD2-E7的引物所在基因組位置及擴增片段和Zfer基因的功能變異位點分別以星號(*)標識。
[0022]圖2.利用BAD2-E7雛BAD2、fgr及其雜合型的DNA擴增片段熔解溫度。
圖3.利用BAD2-E7擴增產物的電泳結果；M.DNA ladder ；1-2 BAD2(日本晴);3-4 fgr(Basmati370) ;5-6 雜合型(日本晴+Basmati370)。
【具體實施方式】
[0023]下面結合附圖和具體實施例進一步說明本發明。實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為常規方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業途徑得到的試劑和材料。
[0024]實施例1
S1.香稻品種Basmati370、非香稻品種日本晴基因組DNA的提取。
[0025]具體方法:
511.取少量水稻插秧后一月幼葉置于液氮冷凍的2.0 mL滅菌離心管中攪拌至粉末狀，加1000 μ L 2 X CTAB-DNA提取(質量分數(W/V)為2%的CTAB，pH8.0 ;質量分數(W/V)為1%的PVP ；100 mmol/L Tris-HCl，ρΗ8.0 ；1.4 mol/L NaCl ；20 mmol/L EDTA，pH8.0 ;體積分數(V/V )為0.2%的巰基乙醇)；
512.置于65°C恒溫水浴鍋中每隔10 min搖動一次，30-45 min后取出；
513.冷卻2min后加1000 μ L氯仿-異戊醇(體積比24:1 )，上下劇烈充分搖動，使兩者混合均勻；
514.10000 rpm離心10 min,輕取上清至1.5 ml滅菌新離心管中，加入600 μ L預冷異丙醇上下輕搖均勻；
515._20°C放置30 min使DNA沉淀；10000 rpm離心6 min,立即倒掉上清倒立離心管于紙巾上；
516.1 min后直立離心管，加入800 μ L 70%乙醇和3 M NaAc (體積比9:1),輕搖使DNA懸浮放置30 min ；
517.10000 rpm離心6 min,立即倒掉上清加入800 μ L 70%乙醇將DNA再次漂洗30
min ；
518.10000 rpm 離心 3 min，通風櫥內烘干；加入 100-200 μ LlXTB Buffer (10 mMTris-HCl, ρΗ8.0 ；1 mM EDTA, ρΗ8.0)溶解，4 °C保存備用。
[0026]S2.香稻品種Basmati370、非香稻品種日本晴香味鑒定方法。
[0027]具體方法:將2g左右供試材料的綠葉剪成碎片，放入小錐形瓶中，在每個瓶中加IOmL 17g/L的氫氧化鉀溶液,立即蓋上瓶蓋,置于室溫下1Omin,然后逐一打開瓶蓋,立即用鼻嗅之，鑒別香味。[0028]S3.香稻品種Basmati370、非香稻品種日本晴香味基因標記BAD2-E7開發及擴增。
[0029]S31.比較Basmati370、日本晴BAD2基因第7外顯子序列差異，設計涵蓋差異位點的功能標記BAD2-E7(圖1)。相比日本晴該區段，Basmati370在第七外顯子發生8個堿基缺失和3處堿基變異，導致該區段DNA熔解溫度比日本晴降低了 1.5°C。所述的BAD2-E7由一對內側引物 BAD2-E7-1n-F/BAD2-E7-1n-R 和一對外側引物 BAD2-E7-out-F/BAD2-E7_out-R 組成，引物序列如下:
BAD2-E7-out-F 引物序列(5，-3’ ) TACCAGGACTTGTTTGGAGCTT,如 SEQ ID NO:1 所示； BAD2-E7-out-R 引物序列(5，-3’ ) AAACCTTAACCATAGGAGCAGC,如 SEQ ID NO:2 所示；。
[0030]BAD2-E7-1n-F 引物序列(5，_3’)TGTTAGGTTGCAITTACTGGGAGT，如 SEQ ID NO:3 所示；BAD2-E7-1n-R 引物序列(5，-3，)CAAACCTTAACCATAGGAGCAGC，如 SEQ ID NO:4 所示。
[0031]利用功能標記BAD2-E7進行兩輪PCR擴增，第一輪PCR以基因組DNA為模板，利用 BAD2-E7-out-F/BAD2-E7-out-R引物擴增;第二輪PCR以稀釋的第一輪PCR擴增產物為模板，利用 BAD2-E7-1n-F/BAD2-E7-1n-R 引物擴增。
[0032]第一輪PCR:反應體系依次加入2 X Power Taq PCR MasterMix母液(百泰克,北京) 5 yL、外側引物(10 iimol/L)各0.3 y L以及0.5 U L基因組DNA，最后以雙蒸水補足10 U L0 在 GeneAmp 9700 型 PCR 儀(Applied Biosystems, USA)上進行 PCR 擴增,擴增程序為 95°C, 5min; 25 X (95°C , 20s; 57°C , 20s; 72°C , 10s) ; 72°C , 5min。反應完成后，向PCR管加入200 u L雙蒸水，以稀釋第一輪PCR產物(約20倍)。
[0033]第二輪PCR:反應體系依次加入2 X Power Taq PCR MasterMix母液(百泰克，北京) 4 UL、內部引物(10 iimol/L)各 0.3 u L,0.5 y L 20XEvaGre en 染料(Biotium, USA)、 以及0.5 UL稀釋過的第一輪PCR產物，最后以雙蒸水補足10 yL。PCR擴增程序為95°C， 2min; 25 X (95°C , 20s; 59°C , 20s; 72°C , 10s) ; 72°C , 5min; 95°C , 2min ；25°C , 2min。
[0034]S4.功能標記BAD2-E7擴增產物DNA熔解溫度檢測方法。
[0035]第二輪擴增產物分 別全部轉移至帶裙邊、白底不透明的96孔板，加入20 u L礦物油(SIGMA’USA),離心(1000 rpm, I min)以消除氣泡。將待測的檢測板放入LightScanner 96 (Idaho Technology, USA)分析系統,讀取60°C-95°C的熔解曲線。所采集的原始數據用 LightScanner Call IT 軟件(Idaho Technology,USA)進行分析，選用 Small Amplicon 模式進行自動化分析，結果見圖2，從圖2可知，水稻香味基因fgr的熔解溫度為77.6°C，正常的等位基因似似的熔解溫度為79.3°C，水稻香味基因的熔解溫度比正常的等位基因似似的熔解溫度低了 1.7°C，所以，通過熔解溫度就可以區分和似似序列差異，從而判別水稻材料的基因型(香味或非香味)。如果待測水稻的DNA的熔解溫度在79-79.6°C之間， 可判斷待測水稻為非香型水稻，如果待測DNA的熔解溫度在77.3-77.9°C之間，可判斷待測水稻為香型水稻。
[0036]不同品種 的香型水稻都含有水稻香味基因/gr，不同品種的香型水稻的fgr基因序列的相似度在99.5%以上，所以，只要是是香型水稻，無論是什么品種，通過BAD2-E7標記擴增的DNA序列的熔解溫度都會在77.6°C左右范圍，這個范圍前后不會超過0.3°C。
[0037]S5.功能標記BAD2-E7擴增產物的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測方法。
[0038]具體方法:擴增產物經8.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(電泳緩沖液I X TBE，電壓110 V，時間2.5 h)，通過0.1% AgNO3染色，利用BIORAD凝膠成像系統觀察、拍照及讀帶。
[0039]實施例2:利用BAD2-E7檢測水稻香味基因型。
[0040]1.供試材料:本實驗所研究材料為香稻品種Basmati370、非香稻品種日本晴。
[0041]2.2份供試材料香味鑒定:香味鑒定方法同實施例1所述。
[0042]3.結果表明，Basmati370葉片表現出香味，日本晴葉片無香味。
[0043]4.2份供試材料DNA提取，PCR擴增分析:DNA提取和PCR擴增方法同實施例1所述。
[0044]5.功能標記BAD2-E7擴增產物DNA熔解溫度檢測:熔解溫度檢測方法同實施例1所述。
[0045]結果表明，Basmati370擴增產物DNA熔解溫度為TL 6°C，說明Basmati370含有香味基因/#，所以可以判定Basmati370為香型水稻；日本晴擴增產物DNA熔解溫度為79.3°C，日本晴為野生型基因似似，可以判定日本晴為非香型水稻，以上結果表明利用功能標記BAD2-E7可以區分香與非香的水稻品種，準確率達100%。
[0046]6.功能 標記BAD2-E7擴增產物聚丙烯酰胺凝膠電泳:聚丙烯酰胺凝膠檢測方法同實施例1所述。結果表明，Basmati370較日本晴的擴增產物缺少數個堿基，與預期結果完全一致(圖3)。說明所熔解溫度檢測與常規凝膠電泳結果一致，可代替凝膠電泳檢測香味基因型，提聞檢測效率。
【權利要求】
1.一種水稻香味基因功能標記BAD2-E7，其特征在于，所述BAD2-E7由一對內側引物 BAD2-E7-1n-F/BAD2-E7-1n-R 和一對外側弓丨物 BAD2-E7-out-F/BAD2-E7_out-R 組成， BAD2-E7-1n-F、BAD2-E7-1n-R、BAD2-E7-out-F 和 BAD2-E7_out-R 引物序列如 SEQ ID NOl?4所示。
2.—種權利要求1所述水稻香味基因功能標記BAD2-E7的應用，其特征在于，所述應用為用于區分香型水稻和非香型水稻。
3.—種區分香型水稻和非香型水稻的方法，其特征在于，包括以下步驟:51.以待測水稻基因組DNA為模版，利用權利要求1所述的外側引物BAD2-E7-out-F/ BAD2-E7-out-R 進行 PCR 擴增；52.將步驟SIPCR擴增的產物稀釋，以之為模版，利用權利要求1所述的內側引物 BAD2-E7-1n-F/BAD2-E7-1n-R 進行 PCR 擴增；53.檢測步驟S2擴增所獲的DNA的熔解溫度，如果待測DNA的熔解溫度在79?79.6°C 之間，待測水稻為非香型水稻，如果待測DNA的熔解溫度在77.3-77.9°C之間，待測水稻為香型水稻。
4.根據權利要求3所述區分香型水稻和非香型水稻的方法，其特征在于，步驟S2所述的稀釋為稀釋15?20倍。
5.根據權利要求3所述區分香型水稻和非香型水稻的方法，其特征在于，步驟SI所述 PCR反應體系為:2 X Power Taq PCR MasterMix 母液 5 U L ；外側引物(10 U mol/L)各 0.3 u L ；基因組DNA0.5 u L ；雙蒸水補足10 ii L ;PCR 擴增程序為 95°C，5min; 95°C , 20s; 57°C , 20s; 72°C , 10s; 25 個循環； 72 °C，5min。
6.根據權利要求3所述·區分香型水稻和非香型水稻的方法，其特征在于，步驟SI所述 PCR反應體系為:2 X Power Taq PCR MasterMix 母液4 U L ；內側引物(10 u mol/L)各 0.3 UL ；20 X EvaGreen 染料0.5 u L ；稀釋過的第一輪PCR產物0.5 UL ；雙蒸水補足10 ii L ;PCR 擴增程序為 95°C，2min; 95°C , 20s; 59°C , 20s; 72°C , 10s;共 25 個循環； 72 °C , 5min; 95 °C , 2min ；25°C , 2min。
7.根據權利要求3所述區分香型水稻和非香型水稻的方法，其特征在于，步驟S3所述的熔解溫度曲線為6(T95°C的熔解曲線。
8.根據權利要求3所述區分香型水稻和非香型水稻的方法，其特征在于，步驟S3所述的對比，熔解溫度曲線為75?82°C的熔解曲線。
【文檔編號】C12Q1/68GK103436530SQ201310238700
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年6月17日 優先權日:2013年6月17日
【發明者】郭濤, 羅文龍, 陳志強, 王慧, 黃翠紅, 劉永柱, 張建國 申請人:華南農業大學