檢測水稻香味等位基因的分子標記的引物和方法

檢測水稻香味等位基因的分子標記的引物和方法
【專利摘要】本發明公開了一種能夠針對多種類型香味基因的香型水稻進行篩選的分子標記及擴增與稻米香味形成直接有關的多種類型甜菜堿乙醛脫氫酶2基因（Badh2/badh2）分子標記的引物及檢測方法。檢測方法為：（1）提取水稻總DNA作為模板，加入上述引物進行PCR擴增；（2）取PCR產物進行限制性核酸內切酶Alu?Ⅰ消化；（3）酶切產物凝膠電泳檢測。本發明突破了以往對香味基因分子標記的檢測都只能針對一種突變類型的香味等位基因進行鑒定的局面，可輔助選擇含有不同類型香味基因的植株，無需在分子標記輔助進行香型水稻新品種育種前確定親本香稻品種的香味等位基因突變類型，簡化了分子標記輔助育種的前期操作步驟，從而快速有效地實現培育香型水稻新品種的育種目標。
【專利說明】檢測水稻香味等位基因的分子標記的引物和方法
【技術領域】
[0001]本發明涉遺傳學和植物育種領域，具體為篩選香型水稻的分子標記和分子標記的引物以及檢測方法，用于輔助常規育種快速、簡便、準確選育香型水稻。
【背景技術】
[0002]香米由于在蒸煮過程中能散發出宜人的香味受到廣大消費者的青睞。香米的價格普遍高于非香水稻品種。隨著人們生活水平的提高，目前市場對香米的需求量日益增加。這些都極大地促進了人們對水稻香型特性的遺傳研究，同時也加快了香稻新品種的選育進程。
[0003]盡管過去人們對于稻米香味遺傳研究結果存在分歧，但多數學者認為稻米香味是由位于水稻第八染色體上的一個隱性主基因(fgr)控制的(閔紹揩等，水稻育種學，中國農業出版社，1996，322-353 ;Sood等，Indian J Genet Plant Breed, 1978，38:268-271; Huang等，Rice Genet Newsl, 1994, 11:134-137 ；Lorieux 等，Theor Appl Genet, 1996,93:1145-1151 Jin 等，Plant Sci，2003，165:359-364)。
[0004]過去在香稻傳統育種過程中，育種者主要通過感官來區分香型水稻和非香型水稻。通過咀嚼來判斷谷粒香味(Reinke等，Int Rice Res Newsl, 1991,16:10-11)的方法不僅因連續品嘗舌尖易受損害，而且會因為嘗食過多導致味覺靈敏度下降而產生誤判，致使含有香味基因的優良雜合個體在多代的選擇過程中被淘汰，最終導致香味基因的丟失。通過1.7%K0H檢測水稻葉片和種子的方法(董彥君等，種子，1992 (3) 24-27 ;Sood等，Indian J Genet Plant Breeding, 1978, 38:268-271)來區分香稻和非香稻的方法操作簡單，由于KOH有助于選擇性地釋放香味，而排除了葉綠素氣味的干擾，使測定的精確度得到提高，但是這種方法對人的嗅`覺系統有很大的損害。近年來利用氣相色譜-質譜聯用儀(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)直接測量香味物質 2_ 乙酸-1-吡咯啉(2-Acetyl-l-pyrroline,簡稱2-AP)含量以檢測香米的方法也有被利用(Niu等,BMC PlantBiology, 2008,8:100-130 ;Fitzgerald 等，Plant Science, 2008,175:539_546)，但該方法費時且檢測費用非常昂貴。
[0005]隨著各種分子標記的發展，許多研究者利用與香味基因連鎖的標記對香稻育種進行輔助選擇。Ahn等(Ahn等，Theor Appl Genet, 1992,84:825-828)研究發現RFLP標記RG28與香味基因連鎖。Lorieux 等(Lorieux 等，Theor Appl Genet, 1996,93:1145-1151)通過遺傳作圖的方法確認RG28和水稻香味密切相關，并且計算它們之間的遺傳距離為5.ScM0Garland 等(Garland 等，Theor Appl Genet, 2000,101:364-371)在前人工作的基礎上建立了基于PCR技術的連鎖性分子標記RG28，同時他們利用RG28進行香稻輔助育種。Cordeiro等(Cordeiro 等，Mol Breed, 2002,9 (4):245-250)發現微衛星標記 SCU015RM 與香味基因的遺傳距離為4cM。李金華等(李金華等，分子植物育種，2006,4(1):54-58)通過設計SSR標記，找到與香味基因連鎖更加緊密的分子標記，遺傳距離為3.3cM。隨著發現的分子標記與香味基因的遺傳距離的縮小，盡管在一定程度上提高了香型水稻育種的速度和準確性，但是這些標記都只是與香味基因的連鎖標記，彼此之間還有一定的遺傳距離，在對雜交后代的篩選中，也有可能會因目的香味基因與標記之間存在一定遺傳距離而發生交換，導致對后代篩選中存在一定的誤差。對于香味基因分子標記鑒定，最理想和有效的方法是直接檢測香味基因，也就是將分子標記直接設計在香味基因內。
[0006]在2005年，Bradbury等首次提出位于水稻8號染色體上的甜菜堿醛脫氫酶2基因(Badh2)與水稻香味直接相關(Bradbury 等,Plant Biotechnol J, 2005, 3 (3):363_370)。Chen等(Chen等，Plant Sci, 2006,171:505-514)進行的互補試驗直接證明了 Badh2基因控制水稻的香味。甜菜堿醛脫氫酶2基因有15個外顯子和14個內含子。Bradbury等首次發現能使稻米呈現香味的甜菜堿醛脫氫酶2第一個等位基因badh2-E7，與非香水稻比較，在其第七外顯子上有8個堿基缺失和3個核苷酸多態性變化。在2008年，我國學者又報道了第二個香型等位基因 badh2-E2 (Shi 等，Mol Breed, 2008，22 (2): 185-192)。與非香水稻比較，badh2-E2等位基因第七外顯子核苷酸序列與非香水稻相同，但在第二外顯子處缺失7個核苷酸。以后又有關于編碼鏈不同外顯子突變(Amarawathi等，MolBreed, 2008，21(1):49-65 ；Kovach 等，PNAS, 2009，106(34): 14444-14449 ；Shao 等，PlantBreeding, 2011, 130 (2): 172-176)以及外顯子沒有突變(徐小龍等，植物分類與資源學報，2011，33 (6):667-673)的香味等位基因的報道。
[0007]在培育香型水稻新品種過程中香味基因的分子標記是非常有效的工具，為此開發簡單、準確、便于操作使用的分子標記一直是研究者們努力的方向。香味基因的確定，為在香味基因內部設計分子標記輔助選育香稻新品種研究奠定了非常重要的基礎。Bradbury等在2005年首次報道badh2-E7等位基因的同一年，就針對badh2_E7等位基因建立的分子標記設計了用于檢測其分子標記的兩對引物(Bradbury等，Molecular Breeding,16:279-283)。將這兩對引物對基因組DNA進行擴增，PCR產物進行電泳檢測，即可區別甜菜堿醛脫氫酶2基因第七外顯子有突變的香味基因和非香基因的水稻。2008年，Amarawathi等針對badh2_E7類型等位基因設計了分子標記和一對引物，建立了能夠穩定篩選，并且比Bradbury等建立的方法略微簡便一些篩選badh2_E7類型等位基因的方法(Amarawathi 等，Molecular Breeding, 2008, 21(1):49-65)。2008 年，Shi 等(Shi 等，Molecular Breeding, 2008，22(2):185-192)和王豐等(王豐等，中國水稻科學，2008，22
(4):347-352)也報道了針對badh2_E7類型等位基因檢測設計了一對引物，用于鑒定是否含有badh2_E7類型的香稻或非香稻。Sakthivel等通過調整一對引物在badh2_E7突變位點兩側的位置，又一次針對badh2-E7類型等位基因建立了較易區別香味基因和非香味基因的檢測方法(Sakthivel 等,Molecular Breeding, 2009, 24:185-190)。本實驗室曾經綜合考慮了 badh2-E7類型等位基因內含子和外顯子兩部分序列，設計了兩對引物用于區分是否含有badh2-E7類型等位基因的香稻或非香稻(李建粵等，專利授權號:ZL201010181087.9 ；徐小龍等，植物分類與資源學報，2011，33(6):667-673)。在Shi等2008年的報道中，還針對badh2-E2類型等位基因設計了分子標記及一對引物，用于鑒定是否含有badh2-E2類型香稻或非香稻(Shi 等，Molecular Breeding, 2008, 22 (2): 185-192)。王軍等(王軍等,分子植物育種，2008，6 (6):1209-1212)以及本實驗的徐小龍等(徐小龍等，植物分類與資源學報，2011，33 (6):667-673)也都采用類似Shi等的方法，設計了鑒定第二外顯子有突變的badh2-E2類型香味等位基因的引物，用于鑒定是否含有badh2-E2類型等位基因香稻或非香稻。Shao等對于新發現的第四和第五外顯子之間具有803bp大片段缺失的badh2等位基因篩選，也建立了分子標記檢測的引物(Shao等，Plant Breeding, 2011，130 (2): 172-176)。Myint 等(Myint 等,Theor Appl Genet, 2012，125 (5): 887-896)針對在第十三外顯子處的一個3bp插入形成的badh2等位基因，也建立能夠進行篩選的分子標記及引物。我們實驗室曾根據在“上師香2號”水稻中發現的只有在甜菜堿醛脫氫酶2基因編碼鏈上游序列有突變的新甜菜堿醛脫氫酶2基因設計了能夠鑒定該新基因的分子標記及檢測的引物。
[0008]目前國內外對由于甜菜堿醛脫氫酶2基因不同突變形成的香味基因，大多都已建立了能夠鑒定是否分別含有某種特定等位基因的香稻和非香稻的分子標記及檢測的引物。這些香味等位基因分子標記的建立及進行相應檢測的引物設計，比原先使用連鎖標記進行香稻分子標記輔助選育，已經有了非常大的進步，使分子標記輔助選育香型水稻新品種準確性得到了極大地提高。但是，目前報道對于香味基因設計的各種分子標記及引物，都只能針對一種香味等位基因突變類型進行鑒定。如果發明能夠針對各種香味等位基因鑒定的分子標記及相應的檢測引物和方法，將能夠減少育種家們在采用分子標記技術進行香型水稻新品種選育前，對被選為香稻親本的甜菜堿醛脫氫酶2基因究竟是屬于什么樣的突變類型進行分析這一繁瑣的操作步驟。目前已發現由甜菜堿醛脫氫酶2基因突變形成的香味基因的等位基因類型就有13種，因此要探索被選為香稻親本的甜菜堿醛脫氫酶2基因屬于什么樣的突變類型的工作量還是非常大的。因此，發明無需提前知道被選為香稻親本的甜菜堿醛脫氫酶2基因屬于什么樣的突變類型就能夠用于鑒定各種類型的香味基因的分子標記，對于采用分子標記進行香型水稻新品種選育將會是一項非常有實用價值的發明。

【發明內容】

[0009]本發明提供了一種篩選香型水稻的新的分子標記CAPS(Alu I )以及檢測該分子標記的引物及方法，能夠快速并準確地鑒定由甜菜堿醛脫氫酶2基因不同位點突變形成的多種不同類型香味等位基因。
[0010]新的分子標記CAPS (Alu I )位于各種香型水稻甜菜堿醛脫氫酶2基因編碼鏈起始密碼子第一個核苷酸下游+896至+899位點。該位點的4個核苷酸序列“AGCT”能夠被限制性核酸內切酶Alu I識別并剪切，而非香水稻品種在+896至+899位點的核苷酸序列為“AGTT”，不能被限制性核酸內切酶Alu I識別并剪切，由此可以快速和準確地區分出香稻和非香水稻品種中的香味基因和非香味基因。
[0011]新的分子標記CAPS (Alu I )的引物包括如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。更優選的，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示。
[0012]SEQ ID N0.1: GATGGGTTCAAGCGGAGA
[0013]SEQ ID N0.2: GCACTGGTCACTGTTTTAC
[0014]在距離甜菜堿醛脫氫酶2基因編碼鏈起始密碼子第一個核苷酸+896上游的第二內含子序列中，設計與甜菜堿醛脫氫酶2基因反義鏈同源配對的正義引物F，序列為:GATGGGTTCAAGCGGAGA ；
[0015]在距離甜菜堿醛脫氫酶2基因編碼鏈起始密碼子第一個核苷酸+899bp下游的第二內含子序列中，設計與甜菜堿醛脫氫酶2基因正義鏈同源配對的反義引物R，序列為:GCACTGGTCACTGTTTTAC。[0016]新的分子標記CAPS (Alu I )檢測方法包括如下步驟:
[0017](I)提取水稻基因組DNA作為模板(可采用CTAB法和TPS法)，加入上述2種引物進行PCR擴增。PCR擴增程序為:93~95°C預變性4~7min ；93~95°C變性42~50s、51~54°C退火42~50s、70~73°C延伸25~35s，共30~35個循環；最后70~73°C延伸9~12min。優選的，PCR擴增程序為:94°C預變性5min ;94°C變性45s、52°C退火45s、72°C延伸30s，共32個循環；最后72°C延伸IOmin ；
[0018](2)PCR產物用Alu I進行酶切反應。反應體系為:10 X快酶反應緩沖液(購自Fermentas 公司)2ul,PCR 產物 14ul ? 0.2 μ g), Alu I 快酶(購自 Fermentas 公司)Iul(10個酶活單位)，滅菌水13ul。反應條件為:37°C水浴4小時；
[0019](3)取酶切產物用凝膠電泳檢測，優選在0.8%~1.5%的瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測；更優選用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。
[0020]檢測結果顯示，各種類型的香稻均含有分子量分別約為320bp和160bp的兩條帶，而非香稻都含有分子量約為480bp的條帶。
[0021]上述方法可用于篩選鑒定分別含有不同類型香味等位基因的香稻與非香水稻雜交后代，以及分別含有不同類型香味等位基因的香稻與非香水稻雜交后的自交后代，或者分別含有不同類型香味等位基因的香稻與非香水稻雜交后又與非香型水稻回交的后代。所檢測的水稻為溫帶非香粳型水稻、香型水稻、溫帶非香粳型水稻與香型水稻的雜交后代及其再自交或回交后代；其中的溫帶非香粳型水稻不包括甜菜堿醛脫氫酶2基因(Badh2)編碼鏈第一個核苷酸下游+898處位點為胞嘧啶脫氧核苷酸(C)的溫帶非香粳型水稻。
[0022]香味基因是指不論突變發生在編碼鏈還是非編碼鏈的甜菜堿醛脫氫酶2基因各種隱性等位基因(badh2)， 與稻米香味形成直接有關。香型水稻指具有不同突變類型甜菜堿醛脫氫酶2基因的水稻。
[0023]非香味基因是指編碼鏈第一個核苷酸下游+898處位點為不包括胞嘧啶脫氧核苷酸(C)的甜菜堿醛脫氫酶2基因的顯性等位基因(Badh2)，也與稻米香味形成直接有關。非香型水稻為溫帶非香粳型水稻中含有該非香味基因的品種。
[0024]如模板總DNA由純合香型水稻提取，酶切后的產物均含有分子量分別約為320bp和160bp的兩種條帶。
[0025]如模板總DNA由非香型水稻提取，酶切后的產物均含有分子量約為480bp的條帶。
[0026]如模板總DNA由香型與非香型水稻雜交后代的雜合子水稻提取，酶切后的產物均含有分子量約為480bp、320bp和160bp的三種條帶。
[0027]如模板總DNA由香型與非香型水稻雜交Fl植株再自交的后代水稻提取，不同植株酶切后的產物應該有三種類型的帶型:對于純合型香稻含有分子量約為320bp和160bp兩種條帶；對于雜合子含有分子量約為480bp、320bp和160bp三種條帶；對于純合型非香稻含有分子量約為480bp —種條帶。
[0028]如模板總DNA由香型與非香型水稻雜交Fl植株再與非香型水稻回交的后代水稻提取，不同植株酶切后的產物應該有兩種類型的帶型:對于純合非香稻含有分子量約為480bp 一種條帶；對于雜合子含有分子量約為480bp、320bp和160bp三種條帶。
[0029]對于鑒定非香稻中是否含有如上所述的非香味基因，即編碼鏈第一個核苷酸下游+898處位點為不包括胞嘧啶脫氧核苷酸(C)的甜菜堿醛脫氫酶2基因的顯性等位基因(Badh2)，的操作方法與本發明操作方法相同。如果在電泳后的凝膠中顯示分子量約為480bp條帶，表明在該非香稻中即含有與部分溫帶非香粳型水稻品種相同的非香味基因。
[0030]本發明除了與其他設計在香味基因內的分子標記具有同樣的先進性特點外，還具有兩大突出的優點:一是克服了目前已建立的所有分子標記及檢測方法都只能針對一種突變類型的香味等位基因進行鑒定的局限。可輔助選擇含有不同類型香味基因的植株，從而使育種家們在利用分子標記輔助將部分溫帶非香粳型水稻品種培育成香型水稻新品種時，不需要提前對用作香型親本水稻究竟屬于哪一種甜菜堿醛脫氫酶2基因突變類型進行大量的前期研究工作，簡化了分子標記輔助育種的前期操作步驟，從而快速有效地實現培育香型水稻新品種的育種目標。
[0031]本發明的CAPS(Alu I)分子標記檢測操作簡便，結果容易判斷。目前大多研究者，如 Amarawathi 等(Amarawathi 等，Molecular Breeding, 2008, 21 (I):49-65)、Sakthivel等(Sakthivel 等，Molecular Breeding,2009，24:185-190)、Shi 等(Shi 等，MolecularBreeding, 2008，22(2): 185-192)、王豐等(王豐等，中國水稻科學，2008，22 (4): 347-352)、王軍等(王軍等，分子植物育種，2008，6 (6): 1209-1212)以及本實驗的徐小龍等(徐小龍等，植物分類與資源學報，2011，33(6):667-673)，針對香味基因編碼鏈設計的各種分子標記的檢測方法，以及本實驗室對于在香味基因啟動子上的突變設計的分子標記及檢測方法，都是針對香味基因與非香基因相差7個或8個核苷酸長度差異進行鑒定。由于PCR擴增出的非香基因Badh2與香味基因badh2兩種PCR產物的條帶大小差距只有7bp或者8bp，因此需要使用聚丙烯酰胺凝膠電泳或者是4%高濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測非香基因和香味基因，兩個條帶較易分辨，但是聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作比較繁瑣。配制均勻一致的4%瓊脂糖凝膠難度也較大，而且即便采用4%瓊脂糖凝膠進行檢測，非香基因和香味基因兩條PCR條 帶有時也不易區分，容易導致判斷誤差。而使用本發明的CAPS (Alu I )分子標記，對香味基因和非香基因進行檢測，只需要使用1%左右瓊脂糖凝膠就能很容易分辨香味基因和非香基因。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1為實施例1中3種不同突變類型的香稻和3種非香稻以及它們各自雜交的Fl植株香味基因的鑒定圖。其中Ml為250bp類型的標準分子量DNA ;第I泳道為非香稻“C418”植株PCR擴增后的酶切產物，含有分子量約為480bp條帶；第2泳道為非香稻“C418”與香味基因啟動子突變類型香稻“南海138”的雜交Fl植株PCR擴增后的酶切產物，含有分子量分別約為480bp、320bp和160bp條帶；第3泳道為香味基因啟動子突變類型香稻“南海138”植株PCR擴增后的酶切產物，含有分子量分別約為320bp和160bp條帶；第4泳道為非香稻“超2-10”植株PCR擴增后的酶切產物，含有分子量約為480bp條帶；第5泳道為非香稻“超2-10”與香味基因第七外顯子突變類型香稻“W香77075”的雜交Fl植株PCR擴增后的酶切產物，含有分子量分別約為480bp、320bp和160bp條帶；第6泳道為香味基因第七外顯子突變類型香稻“W香77075”植株PCR擴增后的酶切產物，含有分子量分別約為320bp和160bp條帶；第7泳道為非香稻“嘉花I號”植株PCR擴增后的酶切產物，含有分子量約為480bp條帶；第8泳道為非香稻“嘉花I號”與香味基因第二外顯子突變類型香稻“B/’雜交Fl植株PCR擴增后的酶切產物，含有分子量分別約為480bp、320bp和160bp條帶；第9泳道為香味基因第二外顯子突變類型香稻“B/’植株PCR擴增后的酶切產物，含有分子量分別約為320bp和160bp條帶；M2為IOObp類型標準分子量DNA。
[0033]圖2為實施例2中2種非香稻和22種香稻的香味基因鑒定圖。Ml為250bp類型標準分子量DNA;第I泳道為非香稻“日本晴”植株PCR擴增后的酶切產物，含有分子量約為480bp條帶；第2泳道到第22泳道分別為香味基因不同突變類型的香稻品種:“蘇滬香粳”、“大華香粳”、“通運粳”、“松香早粳”、“涌湖香糯”、“99983香稻”、“香粳05-7”、“武香粳14”、“49②香稻”、“銀香18，，、“武運2645”、“W香99075”、“紫香糯861”、“07-08香稻”、“香稻I號”、“中香I號”、美國香稻“Della”光身稻、“泰國香稻”、“C香517”、“大粒香”、日本香稻“南海138”、“B/’香稻植株PCR擴增后的酶切產物，均含有分子量分別約為320bp和160bp條帶；第23泳道為非香稻“261S”植株擴增后的酶切產物，含有分子量約為480bp條帶。M2為IOObp類型標準分子量DNA。
【具體實施方式】
[0034]實施例中所使用的非香稻是溫帶非香粳型水稻，不包括甜菜堿醛脫氫酶2基因(Badh2)編碼鏈第一個核苷酸下游+898處位點為胞嘧啶脫氧核苷酸(C)的溫帶非香粳型水稻。(此位點可以是T、A、G)
[0035]實施例1能夠鑒定多種類型香味基因分子標記的建立及檢測方法
[0036]以第二外顯子突變類型香稻“銀香18”和第七外顯子突變類型香稻“W香99075”作為編碼鏈突變類型的香稻品種的代表，以“南海138”水稻作為編碼鏈上游突變類型的香稻品種的代表，提取了 3種水稻基因組DNA，設計了 8對引物，克隆了這3種香型水稻與稻米香味直接相關的甜菜堿醛脫氫酶2基因(badh2)7666bp序列，并進行了測序分析，同時查看了已公布在Genbank中非香型 水稻“日本晴”的甜菜堿醛脫氫酶2基因序列(AP004463.2)。
[0037]比較4種水稻的甜菜堿醛脫氫酶2基因序列，3種香型水稻的香味基因都各自具有代表其特征性的突變區段。但是與非香水稻“日本晴”比較，在3種香型水稻的不同香味基因上，還存在15處共同的突變位點，其中在第二內含子中相當于編碼鏈起始密碼子第一個核苷酸下游的+898bp處，3種香稻均為胞嘧啶脫氧核苷酸(C)，對于非香水稻“日本晴”則是胸腺嘧啶脫氧核苷酸(T)。3種香稻+898處的“C”分別與其上游+896和+897以及下游+899組合就構成了 “AGCT”序列，能夠作為限制性核酸內切酶Alu I酶識別和剪切的序列。而非香水稻“日本晴”從+896至+899的相應序列為“AGTT”，不能作為限制性核酸內切酶Alu I酶識別的位點。由此建立一個能夠同時鑒定多種類型香味基因的分子標記:CAPS(Alu I )ο
[0038]在甜菜堿醛脫氫酶2基因+896至+899序列的兩端分別設計一對上、下游引物，序列分另Ij 為 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.2 所示的 5’ - GATGGGTTCAAGCGGAGA-3’ 和5’ - GCACTGGTCACTGTTTTAC-3’。以香味基因突變位點分別位于編碼鏈上游、第七外顯子和第二外顯子的三種香稻:“南海138”水稻、“W香99075”水稻和“B/’香稻，三種非香水稻:“C418”、“超2-10”和“嘉花I號”，以及三種不同香味基因突變位點的香稻依次分別與三種非香稻雜交的Fl植株為材料，提取基因組DNA，使用如上設計的引物對基因組DNA進行擴增。使用Alu I酶對所有水稻樣品的PCR產物進行酶切處理。酶切后產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。結果顯示，三種香稻品種都含有分子量分別約為320bp和160bp的條帶，三種非香水稻都含有分子量約480bp的條帶,三種雜交的Fl植株都含有分子量分別約為480bp、320bp和160bp的條帶(如圖1)。
[0039]再將非香稻“C418”與香稻“南海138”的雜交Fl植株、非香稻“超2_10”與香稻“W香99075”的雜交Fl植株以及非香稻“嘉花I號”與香稻“B/’雜交Fl植株自交，得的三種自交F2植株中提取總DNA，用同樣的方法進行PCR擴增、酶切和電泳檢測。從檢測結果顯示三種組合的自交后代都有三種不同基因型的植株，其中DNA分子量只有約320bp和160bp兩條帶對應于自交后代香味基因純合植株PCR產物，具有約480bp、320bp和160bp三條帶對應于自交后代香味基因雜合植株PCR產物，只有480bp —條帶對應于自交后代非香純合植株PCR產物。我們還使用了 1.7%K0H溶液對F2植株的葉片進行香味檢測。取I克新鮮的水稻葉片，剪成碎片放入試管，加入1.7%K0H溶液5ml，立即塞住試管口，在室溫下保持lOmin，然后逐一打開試管塞迅速用鼻嗅來鑒別香味有無。為確保鑒定的準確性，由三人同時聞味。由于香味屬于隱性性狀，對于出現480bp條帶的純合非香植株和同時出現480bp、320bp和160bp三條帶的雜合植株都沒有香味，只有出現320bp和160bp兩條帶的植株才有香味。
[0040]將非香稻“C418”與香稻“南海138”的雜交Fl植株、非香稻“超2_10”與香稻“W香99075”的雜交Fl植株以及非香稻“嘉花I號”再與各自的非香稻親本回交，從所得的回交一代植株BClFl中提取總DNA，用同樣的方法進行PCR擴增、酶切和電泳檢測。檢測結果顯示，三種回交組合的后代中都出現了兩種基因型后代。無香味基因的純合植株只有480bp條帶，香味基因雜合類型植株具有480bp、320bp和160bp三條帶。同樣采用1.7%K0H溶液對回交一代植株BClFl葉片進行檢測，所有植株都沒有香味。
[0041]使用CAPS (Alu I )分子標記和KOH溶液兩種方法的檢測結果，與遺傳分離規律中的一對基因自交及回交預期結果完全一致。由此表明，使用本發明建立的CAPS(Alu I )分子標記及檢測方法，不僅能夠有效區別香型水稻和非香水稻所具有的甜菜堿醛脫氫酶2基因，而且采用相同的操作方法`[0042]實施例222種香型水稻CAPS (Alu I )分子標記的鑒定
[0043]為了說明本發明設計的CAPS(Alu I )分子標記能夠適用于更多香型水稻的香味基因鑒定，我們又收集了 19種分別來自于中國、美國、泰國，香味基因突變位點分別為第二外顯子和第七外顯子的香稻:“蘇滬香粳”、“大華香粳”、“通運粳”、“松香早粳”、“涌湖香糯”、“99983香稻”、“香粳05-7”、“武香粳14，，、“49②香稻”、“銀香18，，、“武運2645”、“紫香糯861”、“07-08香稻”、“香稻I號”、“中香I號”、美國香稻“Della”光身稻、“泰國香稻”、“C香517”、“大粒香”，以及實施例1中使用過的3種香稻:“W香99075”、日本香稻“南海138”和“B/’香稻共22種香稻，同時又選擇了兩種非香稻:“日本晴”和光溫敏兩系不育系水稻“261S”，按照實施例1的方法進行檢測。檢測結果顯示，所有香稻品種香味基因PCR擴增后的酶切產物，都含有分子量分別約為320bp和160bp的條帶，非香稻植株的非香味基因擴增后的酶切產物，都含有分子量約為480bp的條帶(圖2)。
[0044]檢測結果表明，本發明設計的CAPS(Alu I )分子標記及檢測方法，能夠適用于更多香型水稻香味基因的鑒定。
[0045]實施例3非香水稻CAPS (Alu I )分子標記的鑒定
[0046]由于大多香型水稻的產量都較低，因此在利用分子標記輔助選育新的香型水稻中，一般都選擇產量較高的非香水稻與香型水稻進行雜交，然后再將雜交Fl植株與高產的非香水稻回交幾代，在每次回交前，需要使用鑒定香味基因的分子標記對回交后代進行檢測，選取含有香味基因的雜合植株繼續與非香水稻回交。因此，對于作為鑒定香味基因的分子標記位點，應該能夠區別出作為親本的香型水稻和非香型水稻分別具有的香味基因和非香味基因。
[0047]對于非香水稻甜菜堿醛脫氫酶2基因編碼鏈起始密碼子第一個核苷酸下游+898位點是否是胞嘧啶脫氧核苷酸(C)的鑒定，可確定在使用本發明的香味基因分子標記CAPS(Alu I )進行新的香型水稻新品種培育的輔助篩選時，有哪些非香水稻品種適合被選作非香親本。
[0048]在實施例1和實施例2中，我們選用的5種非香水稻，使用本發明的CAPS (Alu I )分子標記及檢測方法，對它們的基因組DNA進行鑒定，結果它們都顯示一條480bp的條帶，表明這5種非香水稻的甜菜堿醛脫氫酶2基因的PCR產物都不能被Alu I剪切，說明它們在甜菜堿醛脫氫酶2基因編碼鏈起始密碼子第一個核苷酸下游+898位點不是胞嘧啶脫氧核苷酸(C)，從而也表明利用本發明設計的CAPS(Alu I )分子標記，能夠用于鑒定這5種非香水稻與香型水稻雜交培育新的香型水稻新品種，也就是說這5種非香水稻品種適合被作為非香親本進行新的香型水稻新品種的選育。
[0049]為了探索是否有更多的非香水稻在培育新的香型水稻新品種時，也適合使用本發明的CAPS(Alu I )分子標記進行檢測。我們又另外選取了目前大多在上海市等周邊地區主栽的11種重要的非香水稻:“連粳6”、“光明粳I號”、“楊粳4227”、“中花11”、“寶農34”、“金豐”、“湘晴”、“R44”、“上實2號”、“上師大5號”、“秀水134”，使用CAPS (Alu I )分子標記對這11種非香水稻進行鑒定。結果也與在實施例1和實施例2中的5種非香水稻一樣，也都含有 480bp 條帶。我們還查看了 Kovach 等(Kovach 等,PNAS, 2009，106 (34): 14444-14449)報道中的8個不同于在本發明實施例中使用過的溫帶非香粳稻品種(Baber、Chinese03UEarly Wataribune>Luk Takhar>Shinriki>Tainan Iku487、Taipei309、Randhanipagal)的甜菜堿醛脫氫酶2基因編碼鏈起始密碼子第一個核苷酸下游+898位點的脫氧核苷酸，情況與本發明實施例中檢測過的16種非香水稻相同。也就是說，本發明的CAPS(Alu I )分子標記對使用這些非香稻作為非香型親本進行新的香型水稻新品種選育也是適合的。但是，我們曾將非香型秈稻的甜菜堿醛脫氫酶2基因進行分析，結果顯示，秈稻甜菜堿醛脫氫酶2基因編碼鏈起始密碼子第一個核苷酸下游+898位點與香稻相同，PCR產物經過Alu I酶處理也會出現與香稻相同的條帶，即含有分子量分別約為320bp和160bp的條帶。因此本發明的CAPS(Alu I )分子標記不適合選擇非香型秈稻作為非香親本進行分子標記輔助培育新的香型水稻新品種。
[0050]我們建議育種家在使用本發明CAPS(Alu I )分子標記輔助選育新的香型水稻育種前，最好能夠提前使用本發明簡便的操作方法對用作親本的非香水稻進行鑒定，如鑒定結果只顯示一條480bp條帶的，即表明是本發明適合被選為非香親本使用范圍的水稻品種。
[0051]實施例4利用分子標記輔助選育香型軟米恢復系水稻
[0052]“秋優金豐”是近年上海市閔行區農科所培育出的優質雜交水稻品種。該品種穩定性好、抗逆性強，而且產量高、米質優，已成為目前本市水稻生產的主推品種之一。“秋優金豐”父本為“R44”恢復系。
[0053]近年來在世界上正興起一種新型稻米一一軟米育種研究。軟米米質介于糯性與粘性之間，其最大的特點是稻米直鏈淀粉含量較低。據報道直鏈淀粉含量為8%-12%的軟米，米飯食味好，甜潤爽口，冷飯熱飯均蓬松，質軟。最近幾年上海市培育出的“清香軟粳”常規水稻是香型軟米類型的品種，米質優。
[0054]雜交水稻一般能夠比常規水稻增產15%。本實驗室曾將“清香軟粳”常規水稻與“R44”恢復系雜交，發現由此得到的雜交稻的確產量比原先的“清香軟粳”水稻明顯提高。如果要以“R44”作為恢復系培育香型軟米雜交稻，需要培育“清香軟粳”三系不育系水稻，以及含有“R44”遺傳組成的香型軟米恢復系。因此能夠利用分子標記輔助育種技術培育含有“R44”遺傳組成的香型軟米三系恢復系，將能夠為今后培育高產的香型軟米雜交水稻新品種奠定重要基礎。本實施例將敘述利用本發明的香味基因鑒定的分子標記及檢測方法輔助培育香型軟米恢復系的過程。
[0055]目前還沒有文獻報道“清香軟粳”香型軟米水稻的香味基因屬于甜菜堿醛脫氫酶2基因什么位點突變類型，因此無法直接使用現已報道的只針對一種突變類型的香味基因分子標記篩選的檢測方法。采用本發明的香味基因分子標記CAPS(Alu I )及檢測方法可以免去提前對作為香稻親本的香味基因類型進行研究的大量操作步驟。
[0056]在實施例3中，我們已知“R44”恢復系非香水稻適合使用本發明的香味基因分子標記CAPS(Alu I )及檢測方法輔助選育新的香稻品種。如果前期不知道作為非香稻的親本是否屬于本發明的分子標記適合選擇的非香稻類型，只需要采用本發明的分子標記簡便的檢測方法進行一次操作即可確定。
[0057]在確定“R44”恢復系可以作為雜交的非香親本后，將“R44”恢復系作為母本，將“清香軟粳”水稻作為父本進行雜交，再以“R44”恢復系作為母本，以雜交Fl植株作為父本進行回交得到BClFl種子。在繼續將“R44”恢復系作為母本，BClFl植株作為父本進行第二次回交前，使用本發明的香味基因分子標記CAPS(Alu I )和已報道的軟米基因分子標記檢測的方法(謝米雪等，上海師范大學學報，2013，42( 2 ):384-391)先后對BClFl植株進行鑒定。對于回交BClFl群體的檢測出現兩種基因型后代，含有香味基因雜合植株顯示分別含有分子量約為480bp、320bp和160bp的條帶，只有純合非香基因的植株顯示含有分子量約為480bp的條帶。將含有480bp、320bp和160bp三個條帶的雜合植株繼續檢測軟米基因，將同時含有香味基因和軟米基因的植株作為父本繼續與“R44”恢復系回交，獲得BC2F1種子。繼續種植BC2F1種子和“R44”恢復系種子。再使用本發明的香味基因分子標記CAPS (AluI )對BC2F1群體進行檢測，再將含有分子量約為480bp、320bp和160bp條帶雜合香味基因植株進行軟米基因檢測，將含有雜合香味基因和軟米基因的植株為父本繼續與“R44”恢復系回交，獲得BC3F1種子。同樣的操作再繼續回交3代，獲得BC6F1種子，同樣在每次回交前，都需要采用本發明的香味基因分子標記CAPS(Alu I )和軟米基因分子標記檢測回交前的植株。繼續種植BC6F1種子，在苗期繼續使用本發明的香味基因分子標記CAPS(AluI )對BC6F1植株繼續檢測，將顯示分子量約為480bp、320bp和160bp條帶的香味基因雜合植株繼續檢測軟米基因，從含有三個條帶的香味基因雜合植株中選出也含有軟米基因的植株上收獲自交種子BC6F2。大量種植自交的BC6F2種子，在植株接近成熟期，在田間觀察，選擇各種農藝性狀都更接近“R44”恢復系水稻的植株，取葉片同樣采用本發明的香味基因分子標記CAPS(Alu I )檢測BC6F2植株。香味基因的檢測結果有三種基因型。含有純合非香基因的植株檢測結果只有480bp條帶，含有雜合香味基因植株同時具有480bp、320bp和160bp三條帶，含有純合香味基因植株只有320bp和160bp兩條帶。取含有純合香味基因的植株繼續檢測軟米基因，從含有純合香味基因同時又檢測到具有純合軟米基因的植株上收獲種子BC6F3。再繼續種植兩代BC6F3種子， 獲得BC6F5種子。在自交期間，通過田間觀察，也從各種性狀都與“R44”恢復系盡量較近的植株上收獲種子，由此培育出具有較多“ R44 ”恢復系遺傳組成的香型軟米恢復系水稻新品系。
【權利要求】
1.一種檢測水稻香味等位基因檢測的分子標記的引物，其特征在于，包括如SEQ IDN0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。
2.權利要求1所述檢測水稻香味等位基因檢測的分子標記的引物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示。
3.—種檢測水稻香味等位基因的方法，其特征在于，包括以下步驟: (O以水稻總DNA為模板，用權利要求1或2所述的引物進行PCR擴增； (2 )將步驟(1)的產物用Alu I酶切； (3)將步驟(2)的酶切產物用凝膠電泳檢測。
4.權利要求3所述檢測水稻香味等位基因的方法，其特征在于，步驟(3)中，模板總DNA由為含有甜菜堿醛脫氫酶2基因的純合香型水稻提取時，酶切產物含有分子量約為320bp和160bp的兩種條帶。 模板總DNA由非香型水稻提取時，酶切產物為分子量約480bp的條帶； 模板總DNA由香型水稻與非香型水稻雜交后代的雜合子水稻提取時，酶切產物含有約分子量為480bp、320bp和160bp三種條帶； 如模板總DNA由香型與非香型水稻雜交Fl植株再自交的后代水稻提取，純合型香稻含有分子量約為320bp和160bp兩種條帶；雜合子含有分子量約為480bp、320bp和160bp三種條帶；純合型非香稻含有分子量約為480bp的一種條帶。 如模板總DNA由香型與非香型水稻雜交Fl植株再與非香型水稻回交的后代水稻提取，純合非香稻含有分子量約為480bp —種條帶；對于雜合子含有分子量約為480bp、320bp和160bp三種條帶。
5.權利要求3所述檢測水稻香味等位基因的方法，其特征在于，步驟(1)中，PCR擴增程序為:93~95°C預變性4~7min ；93~95°C變性42~50s、51~54°C退火42~50s、70~73°C延伸25~35s，共30~35個循環；最后70~73°C延伸9~12min。
6.權利要求3或5所述檢測水稻香味等位基因的方法，其特征在于，步驟(1)中，PCR擴增程序為:94°C預變性5min ;94°C變性45s、52°C退火45s、72°C延伸30s，共32個循環；最后72°C延伸lOmin。
7.權利要求3所述檢測水稻香味等位基因的方法，其特征在于，步驟(2)中，酶切的反應條件為36~37°C下反應3~6小時。
8.權利要求3所述檢測水稻香味等位基因的方法，其特征在于，步驟(3)中，所述的凝膠為0.8%~1.5%瓊脂糖凝膠。
9.權利要求3所述檢測水稻香味等位基因的方法，其特征在于，所述的水稻為溫帶非香粳型水稻、香型水稻、溫帶非香粳型水稻與香型水稻的雜交后代及其再自交或回交后代；其中的溫帶非香粳型水稻不包括甜菜堿醛脫氫酶2基因編碼鏈第一個核苷酸下游+898處位點為胞嘧啶脫氧核苷酸的溫帶非香粳型水稻。
【文檔編號】C12Q1/68GK103484556SQ201310479862
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年10月14日 優先權日:2013年10月14日
【發明者】李建粵, 時亞瓊, 許言福, 張建中, 王英存 申請人:上海師范大學