專利名稱：一種茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶的表達方法及其專用工程菌的制作方法
技術領域：
本發明涉及涉及茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶的表達方法及其專用工程菌。
背景技術：
微生物谷氨酰胺轉胺酶(MicrobialTransglutaminase, MTG, Ε2· 3. 2. 13)是一 種催化多肽鏈中谷氨酰胺的Y-酰基轉移至另一底物中的氨基，形成Y-谷氨酰化合物 的轉移酶。如底物為蛋白質，它能催化兩個蛋白質之間的交聯反應。底物包括乳清蛋白、 麥胚蛋白、大豆蛋白、牛肌球蛋白和家禽類肌動球蛋白等(Zhu Y，Rinzema Α，. TramperJ, Bol J. Microbal transglutaminase—^ review of its production and applicationin food processing. App 1. Microbiol. Biotechnol, 1995. 44 :277_282)。通過催化蛋白質或多 肽之間的交聯反應，可提高蛋白質的水溶性、起泡性、可攪拌性、熱穩定性、乳化性等功能， 從而使蛋白質類食品的質構、外觀和風味等方面得到改善，并提高蛋白質的商業價值。目 前，MTG已廣泛應用于食品工業(Ye DY (葉丹英)，Peng ZY (彭志英)，Zhao匪(趙謀明)， Transglutaminase and its application in foodprocessing. Journal of Zhongzhou Grain College (鄭州糧食學院學報)，2000. 21 (2) :46_49)。谷氨酰胺轉移酶廣泛存在 于多種動物組織中，但由于含量低、分離困難、熱穩定性差、對鈣離子具有依賴性等因素， 較難對其進行工業化生產。上世紀80年代末，Ando等發現茂原鏈輪絲菌、肉桂鏈輪絲 菌和灰肉鏈輪絲菌等均能分泌MTG，且這些微生物所分泌的MTG具有熱穩定性高、不需要 鈣離子，產物交聯程度高等特點(Ando H, Adachi M，Umeda K, et al. Purification and characteristics of a noveltransgloutaminase derived from microorganism. Agric Biol. Chem, 1989. 53 :2613_2617.)。雖然MTG現已可以進行工業化生產，但生產成本較高， 限制了它的進一步應用。
發明內容
本發明的目的是提供一種茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶的表達方法及其專用工 程菌。本發明所提供的表達茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶的專用工程菌，是將含有茂原 鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶基因的表達載體導入大腸桿菌中得到的；所述茂原鏈輪絲菌谷氨 酰胺轉胺酶基因的GenBank號為AF531437。用于構建所述含有茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶基因的表達載體的出發載體可 為 pET-22b、pET-28 或 pET-15 等，優選為 pET_22b。以pET_22b為出發載體，構建的含有茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶基因的表達載 體為 pET-MTG。所述大腸桿菌為適于蛋白表達的大腸桿菌菌株，優選為Ε. coli R0Setta(DE3)。將含有茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶基因的表達載體轉化大腸桿菌的方法可為生物工程領域中常用的轉化方法，如熱激法、電轉化法、接合轉化法、PEG介導的原生質體轉
化法等。本發明的第二個目的是提供一種茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶的表達方法。本發明所提供的茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶的表達方法，是發酵上述茂原鏈輪 絲菌谷氨酰胺轉胺酶的專用表達工程菌，表達的茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶以包涵體的 形式存在于菌體細胞中，收集包涵體，對其進行純化、變性、復性和純化后得到茂原鏈輪絲 菌谷氨酰胺轉胺酶。發酵上述工程菌時需加入IPTG誘導劑，所加入IPTG的濃度為0. 8-1. 2mmol/L，優 選為lmmol/L，誘導溫度為35_39°C，優選為37°C，誘導時間為2_4小時，優選為3小時。對包涵體進行純化包括以下步驟將包涵體用含Triton的Tris-HCl緩沖液重懸。對包涵體變性、復性可包括以下步驟將包涵體在含8mol/L尿素，20mmol/L DTT 和lmmol/L EDTA的Tris-HCl，pH6. 5-9. 0緩沖液中溶解后，迅速調節pH值至4. 0，導致MTG 復性。具體的對包涵體進行變性、復性的方法可為將經洗滌的包涵體溶于20mol、 pH6. 5-9. 0，且含 8mol/L 尿素，20mmol/L DTT 和 lmmol/L EDTA 的 Tris-HCl 緩沖液中，室溫 攪拌2小時，離心去除沉淀后，調pH值至4. 0，再次離心去除沉淀，將上清液用20mmol、pH 4. 0的乙酸緩沖液稀釋50倍后4°C攪拌12-24小時，調pH值至6. 0，離心去除沉淀后，用10 倍20mmol、pH6. 0的磷酸緩沖液(PB)透析1_3次。對復性產物進行純化的方法可為強陽離子交換層析法、弱陽離子交換層析法等， 優選為強陽離子交換層析法。本發明提供了一種茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶的原核高效表達方法。該方法 是將茂原鏈輪絲菌的谷氨酰胺轉胺酶基因借助大腸桿菌表達載體導入大腸桿菌中，經發酵 獲得茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶。其中P_ET22b為優選的大腸桿菌表達載體，該載體含 有pelB信號肽的編碼序列，使用限制性內切酶Nde I切除該序列后，表達產物便不含信號 肽。所克隆的茂原鏈輪絲菌的谷氨酰胺轉胺酶基因序列與Kikuchi等(Kikuchi Y, Date Μ, Yokoyama K, Umezawa Y, Matsui H. Secretion of active-formStreptoverticiIlium mobaraense transglutaminase by Corynebacteriumglutamicum :processing of the pro-transglutaminase by a cosecretedsubtiIisin-Like protease from Streptomyces albogriseolus. Appl Environ. Microbiol, 2003,69 :358_66.)報道的谷氨酰胺轉胺酶基 因序列完全相同，G+C含量為66. 66%，并含有大量的稀有密碼子，其中AGA和AGG占編碼 精基酸密碼子中的37. 8% (11/29)，表明谷氨酰胺轉胺酶的合成需要帶有稀有密碼子的 tRNA"—A)。但在所有大腸桿菌含稀有密碼子的tRNA中，tRNAw(A =/A<=A)含量最少，因此在 使用E. ColiBL-21(DE3)和E. Coli BL-21 (DE3)PLys作為宿主菌時，經IPTG誘導后未看到 重組谷氨酰胺轉胺酶的表達帶，可能是這兩株宿主菌中稀有密碼子的tRNAa"(A(^A(:A)含量不 足所致。而使用能共表達稀有密碼子的E. Coli Rosetta(DE3)宿主菌后，大量tRNAmg(AGG/ AGA)基因共表達，使重組谷氨酰胺轉胺酶獲得高效表達。實驗證明經搖瓶培養可獲得濕菌 體5. 8g/L培養基，得到純化的包涵體0. 55g，最終獲得重組谷氨酰胺轉胺酶純酶102. 4mg ； 若使用高密度發酵方法，每升培養基可獲得超過IOOg濕菌體，最終得到2g純酶，遠高于 現有的143mg天然酶/L培養基(可以)的表達水平(Yokoyama KI, NakamuraN, SeguroK，Kubota K. Overproduction of microbial transglutaminase inEscherichia coli， in vitro refolding, and characterization of the refoldedform. Biosci Biotechnol Biochem. 2000,64 1263-70.)。本發明為高效、大量、低成本生產谷氨酰胺轉胺酶提供了一 種有效方法，具有較高的實際應用價值。以下結合具體實施例對本發明作進一步詳細描述。
圖1為PCR擴增的茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶基因的瓊脂糖凝膠電泳檢測 結果圖2為陽性克隆質粒的Nde I和Xho I雙酶切產物的1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測結 果圖3為經IPTG誘導前、后的三種重組菌的全菌蛋白的15% SDS-PAGE檢測結果
圖4為經純化的重組茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶的15% SDS-PAGE檢測結果圖5為SP-S^harose FF離子交換層析純化復性后的MTG圖6為檢測重組茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶對牛血清白蛋白交聯作用的實驗 結果圖7為重組菌MTG/Rosetta (DE3)的菌體生產曲線圖8為重組菌MTG/Rosetta (DE3)的高密度發酵產物的SDS-PAGE檢測結果
具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，所有百分比濃度均為質量百 分比濃度。實驗材料大腸肝菌BL21 (DE3) PLysS, Rosetta (DE3)和質粒 pET_22b 購自 Novagen 公司；限 制性內切酶Nde I、Xho 1和1\ DNA連接酶購自大連TaKaRa公司、高保真Pfu聚合酶購自上 海生工；質粒少量提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購自上海華舜公司；引物合成及DNA測序工 作均由上海博亞公司完成；SP-S印harose購自Amersham公司；蛋白分子量標準購自Gibco 公司；IPTG、尿素、EDTA等其它試劑為進口或國產分析純試劑。實施例1、茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶的獲得一、茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶的專用表達工程菌的構建1、茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶基因的克隆根據已知的茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶(MTG)基因(GenBank號AF531437)的 開放閱讀框架設計引物，引物序列如下Pl(正向引物)5，-TAAAAACATATGGACTCCGACGACAGGGTCAC-3，；P2 (反向引物)5，-TAAAAACTCAGGTTACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3，以 1 μ g茂原鏈輪絲菌(Sti^ptoverticillium mobaraense)的基因組DNA為模板， 在引物Pl和P2的引導下，PCR擴增谷氨酰胺轉胺酶基因。100 μ 1 PCR反應體系為IOX擴增緩沖液 IOul，4 種 dNTP 混合物 各 200umol/L，
引物各 10 lOOpmol，模板 DNA0. 1 2ug，Taq DNA 聚合酶 2. 5u，Mg2+1. 5mmol/L,加雙或三蒸水至 IOOul。反應條件為首先94°C 5min;然后 94°C 50s，58°C 1. 5min,72°C 2min，共 30 個 循環；最后72°C IOmin0反應結束后，對PCR擴增產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測 結果如圖1所示(泳道Marker為DNA marker (bp)，泳道MTG為PCR擴增產物)，結果PCR 擴增出了 993bp的DNA片段，與預期結果相符。2、含有茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶基因的大腸桿菌表達載體的構建用凝膠回收試劑盒回收并純化步驟1用PCR方法擴增的993bp的DNA片段，對其 用限制性內切酶Nde I、Xho I雙酶切后，與經同樣酶雙酶切的載體pET-22b用T4 DNA連接 起來，16°C反應16h后，將連接產物轉化大腸肝菌DH5ci感受態細胞，經篩選后挑選陽性克 隆，提質粒用限制性內切酶Nde I、Xho I進行雙酶切分析驗證，將酶切產物進行瓊脂糖 凝膠電泳檢測，檢測結果如圖2所示(泳道1為DNA marker (bp)，泳道2為pET-MTG/Nde I+Xho I)，結果獲得了 993bp的酶切片段，表明目的片段正確地克隆入載體pET-22b中。然 后對經酶切鑒定正確的陽性克隆質粒進行DNA測序鑒定，測序結果表明插入DNA片段的核 苷酸序列與已知的MTG基因(GenBank號AF531437)的核苷酸序列一致，表明構建的含有 茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶基因的大腸桿菌表達載體正確，將其命名為PET-MTG。3、轉化將步驟2構建的茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶基因的大腸桿菌表達載體pET-MTG 分別轉化大腸肝菌Rosetta (DE3)、BL21(DE3) PlysS和Ε. coli BL21(DE3)菌株,后兩種菌株 為對照，得到茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶的專用表達工程菌。將上述三種重組菌分別命 名為 MTG/Rosetta(DE3)、MTG/BL21 (DE3) PlysS 和 MTG/BL21 (DE3)。本領域技術人員按以上步驟操作，均能夠獲得茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶的 專用表達工程菌MTG/R0Setta(DE3)，該重組菌具有高度可重復性。重組菌的構建方法見 非專利文獻 Francois Baneyx. Recombinant protein expression in Escherichiacoli. Current Opinion in Biotechnology. 1999. 10 :411_421.，申請人承諾公眾可從申請人處 獲得該重組菌MTG/Rosetta (DE3)。二、MTG在大腸肝菌中的表達、包涵體的變性、復性及MTG的純化挑取步驟一獲得的重組菌MTG/BL21 (DE3)的單菌落，將其接種于含50mg/mL氨卞青霉素的LB液體培養基中，將后兩種重組菌MTG/Rosetta (DE3)和MTG/BL21 (DE3) PlysS的 單菌落分別接種于含有50mg/mL氨卞青霉素和30mg/mL氯霉素的LB液體培養基中，37°C 振蕩培養至OD值為0. 6-0. 8時，加入終濃度為lmmol/L的IPTG，37°C誘導3小時。誘導結 束后，對經IPTG誘導前、后的三種重組菌的全菌蛋白進行15% SDS-PAGE檢測，檢測結果如 圖 3 所示(泳道 UMolecular weight marker (KD)，泳道 2-4 IPTG 誘導前泳道 2、E. coli BL 21(DE3)j;}dt3、E.coli BL 21 (DE3) PlysS，泳道 4、Ε· coli Rosetta (DE3)；泳道 5-7 IPTG 誘導后泳道 5、E. coli BL21 (DE3)，泳道 6、E. coli BL21 (DE3) PlysS,泳道 7、E. coli Rosetta (D3E))，只有經IPTG誘導的MTG/Rosetta (DE3)出現分子量為36kDa的外源蛋白表達帶，與MTG的分子量一致，表明茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶基因大腸桿菌中獲得表達，而MTG/BL21 (DE3)PlysS、MTG/BL21 (DE3)以及未經IPTG誘導的重組菌株均未出現外源蛋白 表達帶。離心收集經IPTG誘導的MTG/R0Setta(DE3)菌體，得到濕菌體5. 8g/L培養基。 用50mmol/L、pH 8.0 Tris-HCl (含lmmol/L EDTA)緩沖液懸浮菌體，在冰浴中超聲波破碎 菌體，離心后分別收集上清和沉淀，將沉淀部分(包涵體)用50m molTriS-HCl(pH8.0，含 100m mol/L NaCl, Im mol/L EDTA,0. 5% Triton X-100)緩沖液重懸，經超聲處理洗滌 3 次 后，再用不含Triton X-100的相同緩沖液洗滌3次，得到純化的包涵體，濕重0. 55g。然后 將純化的包涵體(蛋白濃度約為20mg/mL)溶于20mol、pH8. 0 Tris-HCl (含8mol/L尿素， 20m mol/L DTT和Im mol/L EDTA)緩沖液中進行變性，室溫攪拌2小時，離心去除沉淀后， 用HCl調pH值至4. 0，再次離心去除沉淀，將上清液用20m mol、pH4. 0的乙酸緩沖液稀釋 50倍，4°C攪拌12-24小時。用0. 5mol NaOH調pH值至6. 0，離心去除沉淀，將上清液用10 倍體積的20m mol、pH6. 0磷酸緩沖液(PB)透析2次。最后將復性產物上SP-S印harose強 陽離子交換柱層析純化，用PB洗去未結合的成分，再用含0. 5M NaCl溶液洗脫，洗脫液經 透析后進行超濾濃縮，獲得MTG蛋白102. 4mg。將濃縮獲得的重組MTG蛋白樣品進行15% SDS-PAGE檢測，檢測結果如圖4所示(泳道1為蛋白分子量標準，泳道2為包涵體，泳道3為 為經純化的重組MTG蛋白)，SP-Sepharose FF離子交換層析純化復性后的MTG如圖5所示 (Sample(l) Refolded MTG in PB,EluentA(2) :PB+20m mol/L NaCl,EluentB(3) :PB+500m mol/L NaCl)，表明獲得了高純度的茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶。實施例2、茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶的活性測定和對牛血清白蛋白(BSA)的 交聯作用一、茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶的活性測定用比色法測定實施例1表達并純化的茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶的活性 (Pasternack R，Dorsch S，Otterbach J，Robenek Is，et al. Bacterialpro-transgluta minase from Streptoverticillium mobaraense. Purification, characterization and sequence of the zymogen. Eur J Biochem，1998. 257 :570_576)。一個MTG 的酶活單位為 37°C時，催化底物CBZ-Gln-Gly生成1 μ mol L-谷氨酰Y -單異羥基肟酸。L-谷氨酰γ-單 異羥基肟酸在波長520nm處有吸收峰，結果所表達的茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶的比活 為21.5u/mg，與文獻報道的天然酶活性(天然酶的比活為23u/mg)相比，重組MTG的比活 禾肖低(Kikuchi Y，Date M，Yokoyama K，Umezawa Y，Matsui H. Secretion of active-form Streptoverticilliummobaraense transglutaminase by Corynebacterium glutamicum processing of thepro-transglutaminase by a cosecreted subtilisin-Like protease fromStreptomyces albogriseolus. Appl Environ. Microbiol,2003,69 :358_66.)。二、檢測茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶對牛血清白蛋白(BSA)的交聯作用將BSA溶解于含2mmol DTT的磷酸緩沖液-生理鹽水(PBS)中，使蛋白濃度為 lmg/mL，反應總體積為lmL，先在50°C保溫lOmin，然后加入Iu實施例1表達并純化的茂原 鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶，37°C保溫，對照組為未加入重組MTG的反應體系，于10、20、30和 60min取樣進行10% SDS-PAGE，檢測BSA交聯情況。結果如圖6所示，BSA在用DTT處理后未出現沉淀，結果未用MTG組無明顯的多聚體出現(泳道1、6 10)；重組MTG處理組(泳道2 5)形成了分子量更大的多聚體，由 于分子量太大，多聚體未能進入濃縮膠(濃縮膠的孔徑比分離膠小)而附著于上樣孔濃縮 膠表面，表明茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶對牛血清白蛋白具有較強的交聯作用。實施例3、高密度發酵及表達將表達高純度的茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶的重組菌MTG/R0Setta(DE3)進行高密度發酵。重組菌體生長的OD值曲線如圖7所示(PO2 溶解氧.OD 細胞密度.Hour 發 酵時間(小時))，表明OD值在接種2小時開始上升，3小時后上升速度加快，26小時后上 升速度減慢，此時的OD值為56。溶氧曲線顯示接種4h后溶氧開始下降，6小時后直線下 降。8h后溶氧下降到28%，同時堿泵間歇運轉，表明細菌在產酸，約在10小時，溶氧開始上 升，說明發酵罐里養料逐漸消耗，在15h時開始補料。待菌體密度的OD值達60-65時，停止 補料半小時，讓葡萄糖充分耗盡。IPTG誘導后MTG表達逐漸增高，在3小時達到最高，4小 時后表達量下降(如圖8所示，泳道1. Marker,泳道2. IPTG誘導前，泳道3_6. IPTG誘導后 lh、2h、3h、4h.)。在誘導3h時，表達帶與它相近的一條帶已融合起來，無法判斷MTG占全菌 蛋白的百分含量。在隨后的高密度發酵中，確定誘導時間為3小時，離心得濕菌體105g/L 培養基。按上述方法分離純化包涵體，并進行復性純化，共獲得MTG蛋白1.85g。以上描述可以總結出本發明的突出特點l、pET22b為分泌型表達載體，含有pelB信號肽的編碼序列，本發明使用NdeI酶切 祛除該序列，因此，表達產物不含信號肽。重組質粒PET-MTG插入的DNA片段序列與Kikuchi 等報道的完全相同，其中G+C占66. 66%。當外源目的基因在大腸桿菌表達時，由于密碼 子的偏愛性不同，會因為缺乏某種和幾種tRNA，直接導致翻譯中止或錯誤。編碼精氨酸密 碼子AGA、AGG、甘氨酸密碼子GGA和脯氨酸CCC很少被使用。在所有大腸桿菌含稀有密碼 子的tRNA中，含量最少。MTG編碼基因分析顯示含有大腸桿菌稀有密碼子 AGA、AGG、CCC、GGA，其中AGA和AGG最多，占編碼精基酸密碼子中的37. 8% (11/29)。位于 MTG N-端第5和15位的Arg，密碼子均為AGG.，更不利于MTG的表達。Ivanov等報道，當 mRNA5端含有稀有密碼子時，該基因在大腸桿菌表達明顯受到抑制。本發明研究表明在使 用E. coli BL-21(DE3)和BL-21(DE3)PLysS作為宿主菌時，IPTG誘導后未看到表達帶，這 可能是這兩株宿主菌中含稀有密碼子的tRNAa"(A(^A(:A)含量不足所致。而本發明所用專用重 組菌Rosetta(DE3)是經過修飾，專用于帶有大腸桿菌稀有密碼子的外源蛋白表達的菌株， 故使MTG實現了高效表達。2、在包涵體復性過程中，本發明使用了稀釋復性，迅速調節pH值至4.0，該技術簡 單且容易放大，適合工業化生產。本發明在包涵體純化復性過程中添加Triton，使復性率提 高了 40%。使用高密度發酵方法，每升培養基獲得105g濕菌體，獲得了近1. 85g的純酶，遠 高于目前報道的最高的表達水平(132mg/每升培養基)。活性試驗表明與文獻報道天然 酶活性相比，本發明重組MTG的比活幾乎相同(重組MTG的比活為21. 5u/mg，天然酶的比活 為 23u/mg)。總之，本發明實現了 MTG的原核高效表達，并建立了高密度發酵工藝和簡便有效 的包涵體復性方法，為進一步利用大腸桿菌工業化生產更廉價的微生物轉谷氨酰胺酶提供 了保證。
權利要求
表達茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶的專用工程菌，是將含有茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶基因的表達載體導入大腸桿菌中得到的；所述茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶基因的GenBank號為AF531437。
2.根據權利要求1所述的專用工程菌，其特征在于構建所述含有茂原鏈輪絲菌谷氨 酰胺轉胺酶基因的表達載體的出發載體為pET-22b、pET-28或pET_15等，優選為pET_22b。
3.根據權利要求2所述的專用工程菌，其特征在于用于構建所述含有茂原鏈輪絲菌 谷氨酰胺轉胺酶基因的表達載體的出發載體為pET-22b。
4.根據權利要求3所述的專用工程菌，其特征在于所述含有茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺 轉胺酶基因的表達載體為pET-MTG。
5.根據權利要求1所述的專用工程菌，其特征在于所述大腸桿菌為 E. coliRosetta(DE3)。
6.一種茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶的表達方法，是發酵權利要求1所述的茂原鏈輪 絲菌谷氨酰胺轉胺酶的專用表達工程菌，收集包涵體，對其進行純化、變性、復性后得到茂 原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶。
7.根據權利要求6所述的表達方法，其特征在于所述發酵時需加入IPTG誘導劑，所 加入IPTG的濃度為0. 8-1. 2mmol/L，誘導溫度為35_39°C，誘導時間為2-4小時。
8.根據權利要求6或7所述的表達方法，其特征在于對包涵體純化可包括以下步驟 將包涵體用含Triton的Tris-HCl緩沖液重懸；對包涵體變性、復性可包括以下步驟包涵 體在 pH6. 5-9. 0，含 8mol/L 尿素，20mmol/L DTT 和 lmmol/L EDTA 的 Tris-HCl 緩沖液中溶 解后，迅速調節PH值至4. 0，導致MTG復性。
9.根據權利要求8所述的表達方法，其特征在于所述對包涵體進行變性、復性的具體 過程為將經洗滌的包涵體溶于20mol所述的Tris-HCl緩沖液中，室溫攪拌2小時，離心去 除沉淀后，調PH值至4.0，再次離心去除沉淀，將上清液用20mmol、pH 4.0的乙酸緩沖液稀 釋50倍后4°C攪拌12-24小時，調pH值至6. 0，離心去除沉淀后，用10倍20mmol、pH6. 0的 磷酸緩沖液透析1-3次。
10.根據權利要求6或7或8或9所述的表達方法，其特征在于所述對復性產物進行 純化的方法為強陽離子交換層析法。
全文摘要
本發明公開了一種茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶的表達方法及其專用工程菌。該專用工程菌，是將含有茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶基因的表達載體導入大腸桿菌中得到的；所述茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶基因的GenBank號為AF531437。一種茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶的表達方法，是發酵上述茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶的專用表達工程菌，收集包涵體，對其進行洗滌、變性、復性和純化后得到茂原鏈輪絲菌谷氨酰胺轉胺酶。本發明為高效、大量、低成本生產谷氨酰胺轉胺酶提供了一種有效方法，具有較高的實際應用價值。
文檔編號C12N1/21GK101805719SQ20101014511
公開日2010年8月18日 申請日期2010年3月26日 優先權日2010年3月26日
發明者張海軍, 徐斌, 高仁偉 申請人:張海軍