一種小鼠肝星狀細胞的改良分離方法
【專利摘要】本發明涉及一種細胞分離方法，尤其是一種小鼠肝星狀細胞的改良分離方法。本發明解決其技術問題所采用的技術方案是，通過插管固定、灌注消化、細胞分散、小鼠肝星狀細胞分離等步驟完成對小鼠肝星狀細胞的分離。用上述方法得到了需要的小鼠肝星狀細胞，質量很好，比傳統大鼠的分離質量好很多，而且在整個過程比較便捷，在普通實驗室就能完成，很穩定，由于采用了小鼠，不用一些特殊的設備，降低了這種分離方法的成本，在得到高質量的小鼠肝星狀細胞，為進一步深入研究小鼠肝星狀細胞的生物學行為創造了條件。
【專利說明】一種小鼠肝星狀細胞的改良分離方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種細胞分離方法，尤其是一種小鼠肝星狀細胞的改良分離方法。
【背景技術】
[0002]肝星狀細胞是ECM的主要來源，HSC激活并轉化為肌成纖維細胞樣細胞(MFC)，各種致纖維化因素均把HSC作為最終靶細胞，肝星狀細胞激活并轉化為肌成纖維細胞樣細胞(MFC)，各種致纖維化因素均把HSC作為最終靶細胞，正常情況下肝星狀細胞處于靜止狀態。當肝臟受到炎癥或機械刺激等損傷時，肝星狀細胞被激活，其表型由靜止型轉變為激活型，激活的肝星狀細胞一方面通過增生和分泌細胞外基質參與肝纖維化的形成和肝內結構的重建，另一方面通過細胞收縮使肝竇內壓升高。
[0003]通常在通過大鼠的肝臟分離得到，但是這種方法成本很高，需要特殊的儀器，而且分離的質量一般，通過小鼠肝臟分離是比較理想的方法，但是目前沒有一種小鼠肝星狀細胞分離的方法。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于，提供一種分離質量高的小鼠肝星狀細胞的改良分離方法。
[0005]本發明解決其技術問題所采用的技術方案是:第一步:選取雄性BALB/c小鼠，體質量25~30g，普通飼料喂養，自由進食進飲，對其操作前禁食12h ；
[0006]第二步:將選取的小鼠用3%戊巴比妥鈉腹腔注射，待麻醉起效后，固定于工作臺中，用75%乙醇腹部洗浴消毒，剔毛、75%乙醇再次消毒、剖腹，將腸管推于左側，充分暴露門靜脈、下腔靜脈、上腔靜脈，在下腔`靜脈、上腔靜脈各預置I號縫線I根，暫不結扎，楔形剪開下腔靜脈，插管，結扎固定，同時結扎上腔靜脈，剪開門靜脈；
[0007]第三步:采用37°C預熱的D-HanK’ s液對門靜脈進行灌注，速度為5~7mL/min，灌注7min后，觀察肝臟變黃白，流出的D-HanK’s液中無肉眼可見血液后，開始灌注37°C預熱含膠原蛋白酶的HBSS溶液，IOmin左右，速度為3~5mL/min，直至肝臟變軟、變脆，壓之凹陷不易恢復時，結束灌注；
[0008]第四步:取肝臟置于消毒平皿內，去除肝包膜、血管等纖維結締組織，去除膽囊，充分細致剪碎肝組織，加入HBSS液20mL，于37°C進行震蕩消化25min得到細胞懸液；
[0009]第五步:細胞懸液中加入4°C含20% FBS的DMEM液20mL終止消化，經200目濾網過濾進入50mL聚丙烯離心管中，30Xg離心5min,取上清液,上清液450Xg離心7min,去上清，取沉淀，加入6mL的15 %的optiprep,充分混勻，在混合液上面加6mL的11.5 %的optiprep,然后在其上再加6mL的HBSS, 1400Xg, 4?離心18min后，吸取界面層細胞。
[0010]上述方法中，第五步吸取界面層細胞，就得到了需要的小鼠肝星狀細胞，利用這種方法得到的小鼠肝星狀細胞質量很好，比傳統大鼠的分離質量好很多，而且在整個過程比較便捷，在普通實驗室就能完成，很穩定，由于采用了小鼠，不用一些特殊的設備，降低了這種分離方法的成本，在得到高質量的小鼠肝星狀細胞，為進一步深入研究小鼠肝星狀細胞的生物學行為創造了條件。
【具體實施方式】
[0011]第一步:選取雄性BALB/c小鼠，體質量25~30g，普通飼料喂養，自由進食進飲，在操作前禁食12h。
[0012]
[0013]第二步:將小鼠用3%戊巴比妥鈉(60mg/kg)腹腔注射，待麻醉起效后，固定于工作臺中，75%乙醇腹部洗浴消毒，剔毛、75%乙醇再次消毒、剖腹，將腸管推于左側，充分暴露門靜脈、下腔靜脈、上腔靜脈，在下腔靜脈、上腔靜脈各預置I號縫線I根，暫不結扎，楔形剪開下腔靜脈，插管，結扎固定，同時結扎上腔靜脈，剪開門靜脈。
[0014]第三步:采用37°C預熱的D-HanK’ s液對門靜脈進行灌注，速度為6mL/min，灌注7min后，觀察肝臟變黃白，流出的D-HanK’ s液中無肉眼可見血液后，開始灌注37°C預熱含膠原蛋白酶的HBSS溶液(0.3mg/mL的IV型膠原酶)，lOmin，速度為4mL/min，直至肝臟變軟、變脆，壓之凹陷不易恢復時，結束灌注。
[0015]第四步:剪斷肝周韌帶，取肝臟置于消毒平皿內，去除肝包膜、血管等纖維結締組織，去除膽囊，充分細致剪碎肝組織，加入已配制好的HBSS液20mL (0.3mg/mL的IV型膠原酶、2 μ g/mDNA酶)，于37°C進行震蕩消化25min得到細胞懸液。
[0016]第五步:細胞懸液中加入4°C含20% FBS的DMEM液20mL終止消化，經200目濾網過濾后進入50mL聚丙烯離心管中，30Xg離心5min,棄沉淀,取上清液,450Xg離心7min,去上清，取沉淀，加入6mL的15% optiprep,充分混勻，在混合液上面加6mL的11.5%的optiprep,然后在其上再加6mL的HBSS, HOOXgdO離心18min,吸取界面層細胞。
`[0017]取得小鼠肝星狀細胞后可以加入5mL的GBSS懸浮后，450Xg，8min離心清洗后去上清，沉淀中加入DMEM培養液(含20% FBS及雙抗)重懸，活細胞鑒定后，種瓶培養。
[0018]可以進一步活細胞鑒定、性質鑒定、原代培養等細胞研究。
【權利要求】
1.一種小鼠肝星狀細胞的改良分離方法，其方法如下: 第一步:選取雄性BALB/c小鼠，體質量25~30g，普通飼料喂養，自由進食進飲，對其操作前禁食12h ； 第二步:將選取的小鼠用3%戊巴比妥鈉腹腔注射，待麻醉起效后，固定于工作臺中，用75%乙醇腹部洗浴消毒，剔毛、75%乙醇再次消毒、剖腹，將腸管推于左側，充分暴露門靜脈、下腔靜脈、上腔靜脈，在下腔靜脈、上腔靜脈各預置I號縫線I根，暫不結扎，楔形剪開下腔靜脈，插管，結扎固定，同時結扎上腔靜脈，剪開門靜脈； 第三步:采用37°C預熱的D-HanK’ s液對門靜脈進行灌注，速度為5~7mL/min，灌注7min后，觀察肝臟變黃白，流出的D-HanK’ s液中無肉眼可見血液后，開始灌注37°C預熱含膠原蛋白酶的HBSS溶液，IOmin左右，速度為3~5mL/min，直至肝臟變軟、變脆，壓之凹陷不易恢復時，結束灌注； 第四步:取肝臟置于消毒平皿內，去除肝包膜、血管等纖維結締組織，去除膽囊，充分細致剪碎肝組織，加入HBSS液20mL，于37°C進行震蕩消化25min得到細胞懸液； 第五步:細胞懸液中加入4°C含20% FBS的DMEM液20mL終止消化，經200目濾網過濾進入50mL聚丙烯離心管中，30Xg離心5min,取上清液,上清液450Xg離心7min,去上清,取沉淀，加入6mL的15%的optiprep,充分混勻，在混合液上面加6mL的11.5%的optiprep,然后在其上再加6mL的HBSS，1400Xg，4°C離心18min后，吸取界面層細胞。
【文檔編號】C12N5/071GK103805553SQ201210455728
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年11月8日 優先權日:2012年11月8日
【發明者】俞富祥 申請人:溫州醫學院附屬第一醫院