專利名稱：大豆GmCOL4基因在植物花期調控中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，特別是涉及一個大豆開花基因在植物花期調控中的應用。
背景技術：
大豆是重要的農作物之一，是植物蛋白質、食用油、生物柴油以及異黃酮和卵磷脂等次生代謝產物的重要來源。因為大豆是短日植物，開花受光周期的嚴格控制，因而不同區域間的優異品種不能相互引種、生育期也受環境光周期的制約(aiang等.，2008)。如果能降低大豆對光周期的敏感性，突破大豆開花對光周期的限制，就能解決大豆的引種問題，從而實現各區域間優質品種的相互交換，豐富各地優異種質資源，調節大豆生育期，提高大豆產量和品質。以往解決大豆光周期敏感性主要是通過雜交的方法獲得新品種，但是，這種育種方法具有對親本的依賴性強和周期長等缺點，到目前為止尚未獲得大豆光周期廣適應性品種。對擬南芥等植物的研究表明，植物的光周期是受極其復雜的調節網絡控制的 (Mouradov等，2002 ；Turck等，2008)。但是，其中一個關鍵蛋白對開花時間的調節起著至關重要的作用，它就是CONSTANS(CO)基因。Putterill等最早報道了擬南芥中的CO基因 (Putterill等，19%)。通過大量的研究發現CO介于生物節律鐘與下游開花基因之間，將光信號轉變為開花信號(Suarez等，2001)。隨著基因組學和生物信息學的興起和發展， 不同物種中的CO不斷被認知，如水稻(Oryza sativa) (Yano等，2000)、小麥(Tritivum aestivum) (Nemoto 等，2003)禾口衣藻(Chlamydomonas reinhardtii) (Serrano 等，2009)的 CO基因。在已研究的植物中，CO常以多個拷貝的形式存在于生物體中，各CO拷貝的功能有明顯差異。擬南芥的CO家族有17個成員(Robson等，2001)，水稻中有16個成員(Griffiths 等，2003)，甘藍型油菜(Brassica napus)中也克隆得到4個CO同源基因(Robert等， 1998)，在溫帶裸子植物歐洲云杉(Picea abies)中鑒定到2個CO同源基因(Holefors等， 2009)。但大豆CO基因的功能及其應用方面未見報道。通過調節大豆開花基因表達來改變植物對光周期的敏感性和開花時間也沒有報道。
發明內容
本發明的目的是提供一種大豆GmC0L4基因植物花期調控中的應用，通過在植物中過表達或抑制表達GmC0L4，實現調節植物光周期和開花時間。本發明的通過RT-PCR的方法從大豆‘墾農18，中分離到GmC0L4(全稱為Glycine max CONSTANSLike 4)的cDNA全長，它與擬南芥CO蛋白的氨基酸序列之間的同源性為對％，在保守功能域(兩個B-box和一個CCT domain)具有多個關鍵氨基酸的不同。因此推測與擬南芥CO基因促進開花的功能不同，GmC0L4可能具有抑制開花的功能。通過Real-time PCR分析了大豆GmC0L4基因的表達模式，結果表明主要在大豆子葉、莖、葉、花、莢中均有表達，其中在開花期的葉中表達量最高，因此推測所述基因與開花
3相關。本發明將GmC0L4基因構建到表達載體p35S-GW上，并在大腸桿菌DH5a中擴繁。 通過農桿菌介導轉化方法，將P35S-GW攜帶的GmC0L4基因轉入擬南芥，獲得擬南芥轉化植株。結果表明，GmC0L4具有降低植物對光周期的敏感性并抑制擬南芥開花的作用。本發明的通過克隆大豆GmC0L4基因，并在在植物中過表達GmC0L4基因，延長植物生育期，抑制植物開花。因此，GmC0L4基因及其編碼的蛋白可以調節花期，可用于解決雜交育種中的花期不遇的問題，各種作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制的問題以及光周期敏感性問題和引種問題。
圖1為克隆載體pGWCm的結構示意圖。圖2為大豆開花基因GmC0L4編碼蛋白的氨基酸序列與CO基因編碼蛋白的氨基酸序列的比較。圖3A為大豆開花基因GmC0L4在大豆中不同組織器官的表達水平。圖;3B為大豆開花基因GmC0L4在大豆中不同發育時期的表達水平。圖4為大豆開花基因GmC0L4在轉基因植物細胞核中的定位；圖5為植物表達載體p35S-GW的結構示意圖。圖6為大豆開花基因GmC0L4擬南芥轉化植株表現。其中，在圖3中，短線前面的字母表示植株的發育時期，短線后面的字母表示器官，U代表單葉；T代表復葉(T后面的數字為復葉的順序)；F代表花；Pd代表莢；Pt代表葉柄(其后數字表示不同時期的莢)；R代表根；HH代表上胚軸；EH代表下胚軸；SAM代表生長點Jt代表莖；L代表側生葉；C代表子葉Jeedling表示播種一周后的幼苗。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。實施例1大豆開花基因GmC0L4的克隆分別利用正向引物5 ‘ -ATGGGTTATATATGTGATTTTTGTG-3 ‘ 和反向引物 5' TCAGCAGCTTCTGGTTGTGC 3'從大豆‘墾農 18，(G1 ycine max L. Kennong 18，)葉片 cDNA中，擴增CO同源基因。PCR 反應程序為95°C 5min 預變性，95°C 30S,50°C !35S，72°C 2min，25 個循環， 72°C IOmin 延伸。將擴增獲得的PCR產物直接按照TA克隆方法克隆到如圖1所示的pGWCm載體上。 先將pGWCm載體用Ahd I內切酶水解后用凝膠回收試劑盒回收酶切產物以獲得T載體。然后PCR產物和T載體于16 °C進行連接，將連接產物轉化大腸桿菌DH5a，并在其中擴增，篩選陽性克隆并測序。實施例2大豆開花基因GmC0L4編碼蛋白的氨基酸序列分析大豆開花基因的GmC0L4蛋白序列與擬南芥之間的同源性較低僅為對％，且在保守功能域(兩個B-box和一個CCT domain)多個關鍵氨基酸的不同，如圖2所示。因此推測GmC0L4與擬南芥CO的功能可能不同，可能具有抑制植物開花的活性。
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實施例3大豆開花基因GmC0L4在大豆中不同組織器官及不同發育時期的表達水平利用實時定量熒光PCR(quantitative real time RT-PCR)測定大豆開花基因 GmC0L4在大豆中的表達。實時熒光定量PCR采用ABI M^One進行，用STOR Green I檢測熒光信號。上游引物5' -ACCCTTTGAGCACAACCAGA-3‘，下游引物5' -GTTTTTCTTTTGCTAC
TATAGGACTG-3'。反應體系為SYBR Primix Ex Taq (2 X) (TaKaRa)7. 5 μ 1上游引物(10μ Μ)0. 3μ 1下游引物(10μ Μ)0· 3 μ 1ROX Reference Dye (50x)0. 3 μ 1cDNA1. 0μ 1滅菌雙蒸水5. 6μ1反應參數為兩步法95°C 10S，熱啟動；95°C 5S，60°C lmin，40個循環。用基因芯片數據分析軟件Genesis對基因的表達進行標準化并作圖。大豆開花基因GmC0L4主要在大豆子葉、莖、葉、花、莢中均有表達，其中在開花期的葉中表達量最高，如圖3所示。實施例4大豆開花基因GmC0L4編碼蛋白在植物細胞中的定位采用基因槍轟擊的方法，將大豆開花基因GmC0L4與YFP的融合基因，轉化至大豆葉片中。具體方法如下1)微粒子彈的制備將10 μ g重組質粒DNA與6 μ 1 50mg/ml的金粉懸液(直徑為1. 0 μ m)、4 μ 1 0. lmol/L亞精胺(抽濾滅菌)和6 μ 1 2. 5mol/LCaCl2,渦旋振蕩混勻，冰上靜置15min，12，OOOrpm離心10s，收集金粉沉淀，用20 μ 1無水乙醇重懸。2)轟擊受體材料將大豆幼嫩葉片擺放在MS培養基上，22°C預培養4h。選用 IlOOpsi的壓力膜，將20 μ 1金粉-DNA混合物點在轟擊膜中央，采用PDS 1000/He型基因槍(Bio-Rad)進行轟擊，轟擊距離6cm，真空度為25 . Hg。轟擊后的表皮細胞22°C暗培養 24h后，在激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP2)下觀察。轉化細胞中的YFP熒光信號表示大豆開花基因GmC0L4編碼蛋白的定位，如圖4所示。圖4顯示大豆開花基因GmC0L4編碼的蛋白在大豆葉片中主要定位于核。實施例5大豆開花基因GmC0L4的植物表達載體將從實施例1中得到的大豆開花基因GmC0L4的克隆載體與如圖5所示的植物表達載體p35S-GW(購自Invitrogen)等比例混合后通過LR反應(兩種質粒各50ng，LR酶 1 μ 1，補H2O至終體積5 μ 1，混勻后25°C反應6小時以上)，將GmC0L4構建在p35S_GW上， 命名為P35S-GW-C0L4，用于在植物中過表達大豆開花基因GmC0L4，研究其功能。植物的轉化方法采用農桿菌介導法進行。植物中的篩選標記為Bar。實施例6GmC0L4的轉基因擬南芥的獲得1.農桿菌液準備將含有目的基因雙元表達載體的根瘤農桿菌GV3101: :p35S-GW-C0L4接種于5ml 含有相應抗性的液體LB培養基中，28 0C 200rmp培養，轉化前Id接種于200ml含有相應抗生素的液體LB培養基擴大培養至0D600為0. 8 1. 2，5，OOOrmp離心15min收集菌體，菌體
5重懸于侵染緩沖液(含1/2MS大量，V2MS微量，5%蔗糖和0.02% Silweet L_77，pH5. 7)， 使0D600為0. 8左右。2.擬南芥轉化擬南芥在長日照條件下培養，待主莖抽苔后剪掉，待大多側枝現蕾時即可進行轉化。將花序放進盛有侵染緩沖液的容器中，浸泡10 30s，轉化完畢后，用黑色塑料袋罩住避光、保濕，16 24h后揭去塑料袋。常規管理至種子成熟。3. Basta抗性篩選轉基因植株種子收獲后于37°C烘干(1周左右)，然后均勻播在土中，罩上保鮮膜防止污染并保濕，播種7 IOd后待子葉完全張開時噴灑1 1000稀釋的Basta，篩選陽性植株。分別利用正向引物 5 ‘ -GTTATGGGTCAACGGTTTC-3 ‘和反向引物 5 ‘ -TCAGCAGCTTCTGGTTGTGC-3 ‘ 鑒定獲得的抗性植株，確保為GmC0L4轉基因植株。通過PCR鑒定獲得C0L4過表達轉基因 T1代植株共3株。實施例7大豆開花基因GmC0L4抑制擬南芥開花從實施例6獲得的擬南芥轉化植株與野生型Col對照在長日植株生長室中的條件(16小時光照/8小時黑暗的光周期，光強80 μ mol ·πΓ2 · s—1)下同時培育，給予同樣的栽培管理措施，對30株GmC0L4的轉基因擬南芥進行花期觀測。結果表明，大豆開花基因 GmC0L4轉化擬南芥，抑制擬南芥開花，對光周期不敏感，如圖6所示，其中右側代表對照野生型Col，左側代表轉基因植株。30株GmC0L4的T1代過表達轉基因植株從播種到開花為 35 45天，平均為41. 4，而其對照20株Col野生型的開花時間為25 30天左右，平均為 32. 5天。結果表明大豆GmC0L4蛋白具有抑制開花的活性。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。序列說明SEQ ID No 1所示為大豆GmC0L4核苷酸序列；SEQ ID No2所示為大豆GmC0L4氨基酸序列；SEQ ID No 3和SEQ ID No 4為擴增GmC0L4全長的引物對；SEQ ID No 5禾口 SEQ ID No6 為 GmC0L4 Real-time PCR 引物對；SEQ ID No7 和 SEQ ID No 8 為檢測轉化植株的 PCR引物對。
權利要求
1.大豆GmC0L4基因植物花期調控中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，通過在植物中過表達或抑制表達GmC0L4， 實現調節植物光周期和開花時間。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，在植物中過表達GmC0L4，使開花延遲，生育期延長。
全文摘要
本發明涉及基因工程領域，特別是涉及一個大豆開花基因GmCOL4在植物花期調控中的應用。過表達GmCOL4可明顯抑制植物(擬南芥)開花，使開花時間延遲，生育期延長。可用于解決雜交育種中的花期不遇問題、各種作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制問題、光周期敏感性問題和引種問題。
文檔編號C12N15/29GK102399788SQ20101027614
公開日2012年4月4日 申請日期2010年9月7日 優先權日2010年9月7日
發明者傅永福, 張曉玫 申請人:中國農業科學院作物科學研究所