專利名稱：一種來自惡臭假單胞菌的黃素單加氧酶基因fmo及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬微生物領域，涉及一種來自惡臭假單胞菌的黃素單加氧酶基因FMO及其制備方法和應用，具體涉及一種利用功能互補法從來自被芳香族化合物污染的土壤中能以色氨酸為底物合成靛藍的惡臭假單胞菌克隆、編碼黃素單加氧酶(FMO)基因，并將該基因重組到大腸桿菌體內，得到的一種具有黃素單加氧酶活性的重組菌，將其命名為黃素單加氧酶基因FM0。在有色氨酸存在的條件下，用該黃素單加氧酶基因FMO可合成靛藍。
背景技術：
靛藍是最早發現的天然染料之一，廣泛應用于印染、醫藥和食品等工業。大部分靛藍是由化學法生產，天然靛藍比例非常小。從自然作物中提取遠遠不能滿足生產需求，研究者將眼光轉向能夠生產色素的微生物。微生物生長快、培養容易，易于工業化，利用微生物生產天然色素的技術具有廣闊的發展前景。微生物合成靛藍最早的報道是在1982年，研究者從土壤中分離到一株氧化吲哚假單胞菌O^seudomonans indoloxidaes)通過氧化吲哚合成靛藍任吉元，王文濤等，染料工業，1997。到20世紀80年代中期，研究者開始對生物合成靛藍的原理進行深入研究，結果發現真菌合成靛藍的周期太長，1個周期至少要1個月，而細菌的周期相對較短，1個周期一般為18-24h，產量較高，于是研究者重點對細菌進行相關研究。20世紀80年代中期，研究者發現細菌合成靛藍的兩條路徑。即微生物合成靛藍的雙加氧酶途徑和羥化酶途徑。1983年美國Texas大學微生物系和應用微生物學中心的 Ensley等利用遺傳工程技術，選育出能夠產生靛藍的菌株。這種菌株的選育，主要是把2種酶編碼的基因組建在一個菌株中，首先由色氨酸酶將色氨酸轉變成吲哚，然后由萘雙加氧酶將吲哚氧化成吲羥Ensley B. D. Science. 1983,222(4620) :167_169。1985 年瑞士日內瓦大學的Mermod等報道了另一種合成靛藍的途徑。即一種假單胞菌(I^seudomonae putida mt-2)中含有可以降解甲苯、二甲苯或甲苯的其他衍生物的酶的基因。這種基因在TOL質粒上，利用二甲苯氧化酶的釋放、產生、脫羥和單加氧化作用。以吲哚作為靛藍的前體，在二甲苯氧化酶的作用下，直接在C3位置發生羥化生成吲羥，單加氧酶使雙鍵發生環化再經空氣氧化，自動二聚形成靛藍Mermod N. Bio Technology. 1986,4(4) 321-324]0長期以來研究者沿著這兩條路徑來尋找新的突破。并最終確定了苯乙烯單加氧酶、苯酚羥化酶、黃素單加氧酶等。在20世紀末，研究者發現細胞色素P450酶在生物合成靛藍中的也具有重要作用李紅梅等，生物化學與生物物理進展。2005，32(7) :1-6。對生物合成靛藍的酶的研究目前仍主要集中在雙加氧酶和單加氧酶上，細胞色素酶的研究也是最近才開始，而其反應系統要比雙加氧酶和單加氧酶復雜很多，并且由于反應機理的限制，要想取得重大突破還是需要付出更多努力來尋找創新點。開發新菌種仍然是未來的努力方向辛嘉英等，現代化工，2008，28 (7) :31-35。
發明內容
本發明所要解決的技術問題在于提供一種來自惡臭假單胞菌的黃素單加氧酶基因FMO及其制備方法和應用，所述基因來源于受萘、苯酚等芳香族化合物污染的土壤中篩選獲得的能在色氨酸存在時合成靛藍的惡臭假單胞菌。本發明的技術方案是通過以下方式來實現的。所述的來自惡臭假單胞菌的黃素單加氧酶基因FM0，編碼成一個新型的黃素單加氧酶，其核苷酸序列如SEQ ID Nol所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No2所示。所述的黃素單加氧酶基因FMO的獲取方法如下利用含0. 001%色氨酸的LB培養基，從被萘、苯酚等芳香族化合物污染的土壤微生物中，選擇菌落顏色為靛藍色的菌株；再將選擇出來的菌落置于LB液體培養基中培養12小時以上；之后提取總DNA，用0. 02-0. 5u/ μ L濃度限制性核酸內切酶Sau3A酶切提取所得的總DNA，時間20-60分鐘，并將酶切片段連接到表達載體PG251 (CN1338515NCBI)中，將連接物轉化到感受態大腸桿菌菌株DH5 α 中，提取質粒PFM0，再次轉入大腸桿菌DH5 α，涂布于含有0. 001 %色氨酸的LB平板上，挑選顏色為靛藍色的菌落。從該靛藍色菌種克隆抽提的質粒PFMO再次轉入大腸桿菌DH5 α，結果證明這個克隆所產生的菌落均為靛藍色，對質粒pFMO進行測序，即得本發明的黃素單加氧酶基因FMO。所述的來自惡臭假單胞菌的黃素單加氧酶基因FMO的具體獲取方法，包括以下步驟1、菌種分離稱取被芳香族化合物污染的土壤樣品lg，加入0. 9% (w/v)氯化鈉溶液1ml，5000 轉/分震蕩混勻，3000轉/分輕離心，倒掉上清，再加入0. 9% (w/v)氯化鈉溶液1ml，5000 轉/分震蕩混勻，冰上IOmin靜置，吸取150 μ 1溶液涂布于含有0. 001%色氨酸的LB固體培養基中培養Mh。將顏色為靛藍色的單菌落接種于加入1. 6ml LB液體培養基的試管中，
培養48h，然后吸取150 μ 1的培養液再次涂布與含有色氨酸的LB固體培養基中培養 48h，觀察并挑取菌落顏色為靛藍色生長良好的菌株。2、總 DNA 提取將分離獲得的細菌單株在液體LB培養基(5g/L酵母提取物，5g/L NaCl,10g/L 胰蛋白胨，磷酸緩沖液pH7. 5)中培養過夜(16小時)，菌體培養液以6，000g重力加速度離心5min，得到菌體沉淀。先將這些沉淀在_20°C下冷凍lh，之后使用TE緩沖液(IOmM Tris-HCl,lmMEDTA, pH 8.0)清洗一次，然后懸浮于濃度為10mg/mL溶菌酶的無菌水中， 37 °C搖床培養Ih。接著向培養液中加入0. 5M EDTA, 10% (w/v) SDS和濃度為5M的NaCl并輕輕振蕩混勻后，再加入濃度為20mg/mL蛋白激酶K，37°C培養lh。用與培養菌液液體體積相當(1 倍體積)的苯酚氯仿異戊醇05 24 1，體積比)提取DNA;水相用與相當水相體積1/2的氯仿異戊醇04 1，體積比)萃取，振蕩混勻后離心5min。水相中加入與水相體積相當(1倍體積)的異戊醇，振蕩混勻后離心15min。取沉淀，用70% (ν/ν)酒精沖洗 DNA,干燥，之后在TE緩沖液中重懸浮，所得總DNA于4°C保存。3、惡臭假單胞菌黃素單加氧酶基因FMO的獲取與篩選用0. 02-0. 5ιι/μ L濃度限制性核酸內切酶Sau3A酶切提取所得的總DNA成團泛菌，時間20-60分鐘，然后0.7% (w/v)瓊脂糖凝膠電泳，切下長度為5-71Λ的DNA片段，用膠試劑盒(上海生工生物工程有限公司)回收。選擇pG251(CN1338515NCBI)作為表達載體，用限制性核酸內切酶BamHI酶切并進行膠回收。先對酶切的載體質粒進行去磷酸化操作，以降低質粒自連，并對堿性磷酸酶進行失活操作(Sambrook，分子克隆手冊，1989)，再與外源的DNA片段(即長度為5-71Λ的惡臭假單胞菌DNA片段)連接。反應溫度16°C，連接時間10-1池。連接產物用正丁醇沉淀后，用70% (ν/ν)的乙醇離心洗滌，最后用10 μ 1的超純水溶解，將連接物進行電擊轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，電擊參數為電脈沖2. 5 μ F， 電壓2. 5kV，電阻200 Ω，電擊時間為4. 5S。復蘇后，將菌液涂布于LB固體培養基(含有 50 μ g/mL氨芐青霉素)平板上，37°C培養12_16h，而后用質粒大量提取試劑盒(美國Omega 公司)進行質粒PFMO提取，這樣就構建成了包含有目的基因的基因組文庫。將大量提取的質粒轉入大腸桿菌DH5 α涂布與含有色氨酸的LB平板上培養48h， 挑選顏色為靛藍色的菌落。從靛藍色菌落克隆抽提的質粒PFMO再次轉入大腸桿菌DH5 α 將轉化子用無菌牙簽劃于含0. 001 %色氨酸的LB培養基上，結果證明這個克隆產生的菌落均為靛藍色，表明靛藍合成功能確實是由于轉入PFMO引起的。從上述靛藍色菌落中提取質粒pFMO進行測序，找出載體中插入惡臭假單胞菌的 DNA片斷進行序列分析，尋找閱讀編碼框，其中包含了一個1382bp的閱讀框，即為本發明的黃素單加氧酶FM0，其序列如SEQ ID No 1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No2所示。 在該閱讀框的左右兩側設計引物PFMOZ :5，-GGATCCATGACTCTTCGTGTAGCTATC-3，禾口PFMOF 5，-GAGCTCCTACCGGCGCAGGGCCTTCAC-3，為擴增引物，以 pFMO 質粒 DNA 為模版，對1382bp的閱讀框進行PCR擴增。將回收片段用BamHI和McI雙酶解，與pG251表達載體連接，將連接產物轉入大腸桿菌DH5 α涂布與含有0. 001%色氨酸的LB平板上培養 48h，確定1382bp閱讀框表達質粒的正確性。利用PCR進行全長擴增，在Taq DNA聚合酶存在的反應體系中，使用多個擴增弓丨物和2個外側引物完成。擴增條件依次為94°C預熱Imin ；94°C 30秒，50°C 30秒，72°C延長 lOmin，共25個循環。PCR結束后，0.8% (w/v)瓊脂糖膠回收。將上述SEQ ID No 1序列與表達載體相連接后轉入微生物細胞中，能在含有色氨酸的LB培養基上合成靛藍。有益效果本發明采用來自被萘、苯酚等芳香族化合物污染的土壤中的惡臭假單胞菌(即一類能夠在芳香族化合物中生長的細菌)，克隆此類細菌中的黃素單加氧酶基因，通過培養、 提取總DNA和PCR擴增后，即得到如SEQ ID Nol所示的黃素單加氧酶基因FM0，它可以應用于靛藍燃料的生物合成，和降解芳香族污染物。本發明所述的術語與其一般概念相同。所述的“核苷酸”和“引物”序列均為5’端至3’端。所述的“生物細胞”指微生物、植物細胞或組織。所述的“微生物”指原核微生物或真核微生物，原核微生物主要為細菌；真核微生物為真菌或藻類，真菌主要指酵母菌。
圖1為FMO表達質粒與pG251空質粒轉化大腸桿菌，其中A為DH5 α (攜帶惡臭假單胞菌FMO表達質粒)，B為陰性對照，即DH5 α (攜帶pG251空質粒)。
具體實施例方式以下結合附圖詳細描述本發明的技術方案。實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求范圍中。本發明所用的試劑若未經說明，均購自西格瑪-奧德里奇(Sigma-Aldrich)公司。本發明涉及分子生物學實驗，如沒有特別注明，均參考自《分子克隆》一書(J.薩姆布魯克、E. F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，科學出版社，1994)。該書及其后續出版版本是本領域技術人員在進行與分子生物學相關的實驗操作時最常用的具有指導性的參考書籍。實施例1菌種分離稱取被芳香族化合物污染的土壤樣品lg，加入0. 9% (w/v)氯化鈉溶液1ml，5000 轉/分震蕩混勻，3000轉/分輕離心，倒掉上清，再加入0. 9% (w/v)氯化鈉溶液1ml，5000 轉/分震蕩混勻，冰上IOmin靜置，吸取150 μ 1溶液涂布于含有色氨酸的LB固體培養基中培養Mh。將顏色為靛藍色的單菌落接種與加入1. 6ml LB液體培養基的試管中，28°C培養 48h，然后吸取150 μ 1的培養液再次涂布與含有色氨酸的LB固體培養基中培養48h，觀察并挑取菌落顏色為靛藍色生長良好的菌株。實施例2總DNA的提取及菌種鑒定將實施例1分離獲得的顏色為靛藍色生長良好的細菌單株在IOml液體LB培養基 (5g/L酵母提取物，5g/LNaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸緩沖液pH7. 5)中培養16小時，菌體培養液以6，OOOg重力加速度離心5min，得到菌體沉淀。先將這些沉淀在_20°C下冷凍lh，之后使用TE緩沖液(IOmM Tris-HCl, ImM EDTA, pH 8. 0)清洗一次，然后加入20 μ 1溶菌酶 (Sigma-Aldrich)濃度為10mg/mL的無菌水懸浮，在37°C下搖床培養lh。 接著加入50 μ L濃度為0. 5Μ EDTA, 50 μ 1濃度為10 % (w/v) SDS和50 μ 1濃度為 5Μ的NaCl并輕輕振蕩混勻后，再加入10 μ 1濃度為20mg/mL蛋白激酶K(Takara日本)， 反應物在37°C下培養lh。用與培養菌液體積相當(1倍體積)的苯酚氯仿異戊醇 (25 24 1，體積比)提取DNA。水相用與相當水相體積1/2 (0. 5倍體積)的氯仿異戊醇04 1，體積比)萃取。振蕩混勻后離心5min。水相中加入與水相體積相當(1倍體積)的異戊醇。振蕩混勻后離心15min。取沉淀，用70% (ν/ν)酒精沖洗DNA，干燥，之后在 TE緩沖液中重懸浮，所得的總DNA于4°C保存。 以抽提的總DNA為模板，利用細菌的16s rRNA特異性引物進行擴增。擴增的引物為 P16SF :5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3，和 P16SF :5’ -AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3，。以 KOD Plus (Toyobo日本)為iTaq DNA聚合酶，擴增條件依次為94°C 30秒，55°C 30秒，72°C 120 秒，擴增30個循環。循環結束后，加入2個單位的rtaq酶(寶生物工程(大連)有限公司)，72°C延伸 300 秒，擴增片段長 1500bp (GeneID 1045690NCBI)。PCR 結束后，(w/v)瓊脂糖凝膠回收，取10 μ 1直接與T/A載體相連(寶生物工程(大連)有限公司)，4°C連接過夜。先將上述利用16s rRNA特異性引物進行PCR擴增的片段與T/A載體的連接產物轉化入大腸桿菌DH5a感受態細胞中，再用ABI Prism Big Dye的ABI3700毛細管自動化測序儀測序，測得的序列通過Blast程序與GenBank中核酸數據進行對比分析，得到菌株與惡臭假單胞菌中的16s rRNA有99%的同源性，說明該菌株為惡臭假單胞菌株。實施例3利用色氨酸合成靛藍的DNA片斷分離和序列分析用不同濃度(0. 02-0. 5u/ μ L)限制性核酸內切酶Sau3A(寶生物工程(大連)有限公司)酶切實施例2提取所得的惡臭假單胞菌總DNA，時間20-60分鐘，然后0. 7% (w/ ν)瓊脂糖凝膠電泳，切下長度為5-71Λ的DNA片段，用膠試劑盒(上海生工生物工程有限公司)回收。選擇pG251 (CN1338515NCBI)作為表達載體，用限制性核酸內切酶BamHI (寶生物工程(大連)有限公司)酶切并進行膠回收。先對酶切的載體質粒進行去磷酸化操作，以降低質粒自連，并對堿性磷酸酶進行失活操作(Sambrook，分子克隆手冊，1989)，再與外源的DNA片段(即長度為5-71Λ的成團泛菌DNA片段)連接。連接前，將回收的部分酶解的細菌基因組DNA片段與pG251載體DNA， 用瓊脂糖凝膠電泳的方法估計濃度，確保連接反應中外源DNA的濃度至少是載體濃度3-5 倍。反應溫度16°C，連接時間為10-12h。連接產物用正丁醇沉淀后，用70% (ν/ν)的乙醇離心洗滌，最后用10 μ 1的超純水溶解，將連接物進行電擊轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，電擊參數為電脈沖2. 5 μ F， 電壓2. 5kV，電阻200 Ω，電擊時間為4. 5S。復蘇后，將菌液涂布于LB固體培養基(含有 50yg/mL氨芐青霉素)平板上，37°C培養12_1他，而后用質粒大量提取試劑盒(美國Omega 公司)進行質粒PFMO提取，這樣就構建成了包含有目的基因的基因組文庫。將大量提取的質粒轉入大腸桿菌DH5 α涂布于含有0. 001%的色氨酸的LB平板上培養48h，發現有多個菌落生長良好。將這些菌落接種到含0.001%色氨酸的LB平板上， 挑選較好的菌落，抽提該克隆的質粒PFMO再次轉入大腸桿菌DH5 α中，將轉化子用無菌牙簽點于含0. 001%色氨酸的LB固體培養基上，結果證明這個克隆所產生的轉化子可合成靛藍，表名靛藍合成功能確實是由于轉入PFMO引起的。利用逐步序列測定方法對上述篩選獲得的轉化子進行DNA測序。測序的引物分別為Par 1 :5’ -GATGTTTGATGTTATGGAGCAG-3，Par2 :5’ -CTGACAGCGTTATTGATGACA-3’Par3 :5’ -GATCACCGCATGGCGATGTGT-3，Par4 :5’ -AACG CCAGTCCACCAGCACG-3’分析結果表明，插入的片斷大小為3170bp，從測序結果中尋找閱讀編碼框，其中包含了一個1382bp的閱讀框。在閱讀框的左右兩側設計引物PFMOZ :5，-GGATCCATGACTCTTCGTGTAGCTATC-3，禾口PFMOF :5，-GAGC TCCTACCGGCGCAGGGCCTTCAC-3，為擴增引物，以 pFMO 質粒 DNA 為模版，對1382bp的閱讀框進行PCR擴增。使用KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)，擴增條
9件依次為94°C 30秒，68°C 30秒，72°C 2分鐘，30個循環。然后加入2單位rtaq(寶生物工程(大連)有限公司)，在72°C延伸30分鐘。PCR結束后，(w/v)瓊脂糖凝膠回收，獲得長度為1382bp的SEQ ID Nol核苷酸，即為本發明的黃素單加氧酶FM0，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No2所示。將回收片段用BamHI和McI雙酶解，與pG251表達載體連接，用瓊脂糖凝膠電泳的方法估計濃度，確保連接反應中外源DNA的濃度至少是載體濃度3-5倍。反應溫度16°C， 連接時間為10-1 1。再將該載體轉化入DH5a感受態中。利用ABI Prism Big Dye的 ABI3700毛細管自動化測序儀測序，確定1382bp閱讀框(惡臭假單胞菌FM0)表達質粒的正確性。將大腸桿菌DH5 a (攜帶惡臭假單胞菌FMO表達質粒)和DH5 a (攜帶pG251空質粒)接種到含色氨酸的LB固體培養基中，經^°C、4 !培養。結果發現陰性對照B在LB 中呈現正常菌落的淡黃色；而DH5 a (攜帶惡臭假單胞菌FMO表達質粒)A在LB中菌落呈現明顯的靛藍色(參看圖1)。實施例4惡臭假單胞菌黃素單加氧酶基因FMO的篩選與合成通過基因合成方法(Nucleic Acids Research，2004，32，e98)克隆篩選合成本發明的惡臭假單胞菌黃素單加氧酶基因FM0，所用的引物如下1FM01 ATGACTCTTC2FM0-2 GATTTGCGGC3FM0-3 GCCGCCATGC4FM0-4 CACCGGCTCG5FM0-5 CAGCATGGCG6FM0-6 GAAATGTTCA7FM0-7 AGCTTCGATG8FM0-8 ATCGCGCACC9FM0-9 AAAGCCGGGG10FM0-10 GCCGTAGTCA11FM0-11 AGCGCCCATG12FM0-12
10
GTGTAGCTAT CATCGGTGCC GGCCCCTCCG GCCTTGCGCA ACTGCGTGCC ATGGCGGCGC CCTGGGCATG GGCGGACTGG AAGGCACGCA GTTGCGCAAG CGCAAATCGT CTGCTTCGAA AAGCAGGCCG ACTGGGGCGG CATGTGGAAC CCATGCTGGT CGAGTCCGGT GCGCCAGGTG TAGTTCCACA TGCCGCCCCA AGCCGGTGCA CGGCAGCATG TACCGCTACT TGTGGTCCAA CGGCCCCAAG TCGAAGCTG TAGTCGGCGA ACTCCAGGCA CTCCTTGGGGC CGTTGGACCA AACATTTCG GCCGGCCAAT CTCCTCATAT CCGCCGCGCGA GGTGCTGTGG CCGGCTTTT TTCACGCGGC CCTGGATGTA GTCCCACAGCA CCTCGCGCGG TGCGCGATT TCATCCGCTT CAATACCGTG GTCAAGCACGT CAGCTTCAAT TGGGCGCTG ACGGTGAACT CGCGTGTCTG CTCATTGAAGC TGACGTGCTT ACTACGGCG CAGGGGTCGG CATCGAGCAG GTGTTCGACTA CGTGGTGGTC0085]TTCGAACTCCGGCACATGCGGGGTGGAGA AGTGGCCACT GGCGACCACCACGTAGTCGAA0086]13FM0-13 0087]CATGTGCCGGAGTTCGAAGGCTTCGAGCG TTTCACCGGG CGTATCCTGCACGCCCACGAT0088]14FM0-14 0089]GATGAGCAGGTCCTGGCCCTTGAATTCCA CCGCTTCACG AAAATCGTGGGCGTGCAGGAT0090]15FM0-15 0091]GGCCAGGACCTGCTCATCGTTGGCAGCA GTTATTCCGCC GAAGACATAGGTTCGCAGTGC0092]16FM0-16 0093]GGTACGTTAGGCCGTGGTGATCGACCGTGCACCGTACTT GTAGCACTGCGAACCTATGTC0094]17FM0-17 0095]ACCACGGCCTAACGTACCCAGGCCGATGGGGCTTCAAGTGGCCCACGGGGTGGGAAGAGC0096]18FM0-18 0097]CGAAGAACGCCAGGTCGTTCTCGACCCTGACCAGTTGCGGACGCTCTTCCCACCCCGTGG0098]19FM0-19 0099]ACGACCTGGCGTTCTTCGCCGATGGATCGAGCAAGCGCATCGACGCAATCATCCTGTGCA0100]20FM0-20 0101]TCAGCTCATCCGGCAGGAACGGGAAGTGATGCTGGTAGCCCGTGCACAGGATGATTGCGT0102]21FM0-21 0103]TCCTGCCGGATGAGCTGACCCTCAAGACCAACAACCGCCTGTGGCCTGCGGGGCTCTACC0104]22FM0-22 0105]CCAGGTAGAGCAACTGCGGGTTCTGCTCCCAGACCACGCCTTGGTAGAGCCCCGCAGGCC0106]23FM0-23 0107]CGCAGTTGCTCTACCTGGGCATGCAGGACCTCTGGTACAGCTTCAACCTGTTCGACGCCC0108]24FM0-24 0109]GCTGCAGGCGCCCCAGCATATAGTCGCGTGCAAACCATGCCTGGGCGTCGAACAGGTTGA0110]25FM0-25 0111]TGCTGGGGCGCCTGCAGCTACCGCCCAAGGCGGACATGCAAGCCGACAGCAAGCGCTGGC0112]26FM0-26 0113]CATACATCGAGGCTGTGGTTTCCAGACGCTCCTCATCCTCGCGCCAGCGCTTGCTGTCGG0114]27FM0-27 0115]CCACAGCCTCGATGTATGAGTTCCAGGGTCGATACATCAAGCACCTGATCGAGCAGACCG0116]28FM0-28 0117]GGAAGATGCGATTGACCGCATCGATGTCGAAGCTTGGGTAATCGGTCTGCTCGATCAGGT0118]29FM0-29 0119]CGGTCAATCGCATCTTCCTGCAATGGAAGCAGGACAAGAAGCACGACATCATGGGCTATC0120]30FM0-30 0121]CTGCTTTCGTGCCGGTGATCACCGAGCGGTACGACTTGTCGCGATAGCCCATGATGTCGT0122]31FM0-31 0123]TCACCGGCACGAAAGCAGTGCCCCACCATACCCGCTGGATGCAGGCGCTGGACGACTCGC
32FM0-32 CCTCACCTTG CTTGCCGTCC GTTTCGCGCA GGTATTCCTG CAGCGAGTCG TCCAGCGCCT33FM0-33 ACGGCAAGCA AGGTGAGGTG AAGGCCCTGC GCCGGTAG34FM0-34 CTACCGGCGC AGGGCCTTCA利用PCR進行β -胡蘿卜素全長操縱子擴增，在100μ 1反應體系中， FM0-2-FM0-33共32個引物的添加量為2ng，外側引物FM0-1和FM0-34添加量為30ng。以 KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)為Taq DNA聚合酶。擴增條件依次為94°C預熱Imin ； 940C 30s ；50°C 30s ；72°C lOmin，使用的，共25個循環，擴增產物即為FMO基因。PCR結束后，1 % (w/v)瓊脂糖膠回收，取10 μ 1直接與Τ/Α克隆載體相連(寶生物工程(大連)有限公司)，4°C連接過夜。高效轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞中，獲得陽性克隆，將該陽性克隆經ABI Prism Big Dye的ΑΒΙ3700毛細管自動化測序儀測序，獲得長度為1382bp的SEQ ID Nol核苷酸，即為本發明的黃素單加氧酶FM0，其編碼的氨基酸序列如 SEQIDNo2 所示。
權利要求
1.一種來自惡臭假單胞菌的黃素單加氧酶基因FMO，其核苷酸序列如SEQ ID No 1所示。
2.權利要求1所述的惡臭假單胞菌的黃素單加氧酶基因FMO的制備方法，其特征在干， 利用功能互補法對來自被芳香族化合物污染的土壌中能以色氨酸為底物合成靛藍的惡臭 假單胞菌克隆、編碼黃素單加氧酶(FMO)基因，并將該基因重組到大腸桿菌體內而獲得，具 體包括以下步驟1)菌種分離；2)總DNA的提取及菌種鑒定；3)惡臭假單胞菌黃素單加氧酶基因FMO的篩選與合成。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在干，所述的芳香族化合物為萘或苯酚。
4.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在干，通過基因合成方法克隆篩選與合成 所述的黃素單加氧酶基因FM0。
5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在干，所述基因合成方法所用的引物如下 IFMO 1 ATGACTCTTC GTGTAGCTAT CATCGGTGCC GGCCCCTCCG GCCTTGCGCA ACTGCGTGCC 2FM0-2 GATTTGCGGC ATGGCGGCGC CCTGGGCATG GGCGGACTGG AAGGCACGCA GTTGCGCAAG 3FM0-3 GCCGCCATGC CGCAAATCGT CTGCTTCGAA AAGCAGGCCG ACTGGGGCGG CATGTGGAAC 4FM0-4 CACCGGCTCG CCATGCTGGT CGAGTCCGGT GCGCCAGGTG TAGTTCCACA TGCCGCCCCA 5FM0-5 CAGCATGGCG AGCCGGTGCA CGGCAGCATG TACCGCTACT TGTGGTCCAA CGGCCCCAAG 6FM0-6 GAAATGTTCA TCGAAGCTG TAGTCGGCGA ACTCCAGGCA CTCCTTGGGGC CGTTGGACCA 7FM0-7 AGCTTCGATG AACATTTCG GCCGGCCAAT CTCCTCATAT CCGCCGCGCGA GGTGCTGTGG 8FM0-8 ATCGCGCACC CCGGCTTTT TTCACGCGGC CCTGGATGTA GTCCCACAGCA CCTCGCGCGG 9FM0-9 AAAGCCGGGG TGCGCGATT TCATCCGCTT CAATACCGTG GTCAAGCACGT CAGCTTCAAT 10FM0-10 GCCGTAGTCA TGGGCGCTG ACGGTGAACT CGCGTGTCTG CTCATTGAAGC TGACGTGCTT 11FM0-11 AGCGCCCATG ACTACGGCG CAGGGGTCGG CATCGAGCAG GTGTTCGACTA CGTGGTGGTC 12FM0-12 TTCGAACTCC GGCACATGCG GGGTGGAGA AGTGGCCACT GGCGACCACCA CGTAGTCGAA 13FM0-13 CATGTGCCGG AGTTCGAAGG CTTCGAGCG TTTCACCGGG CGTATCCTGCA CGCCCACGAT14FM0-14 GATGAGCAGG 15FM0-15 GGCCAGGACC 16FM0-16 GGTACGTTAG 17FM0-17 ACCACGGCCT 18FM0-18 CGAAGAACGC 19FM0-19 ACGACCTGGC 20FM0-20 TCAGCTCATC 21FM0-21 TCCTGCCGGA 22FM0-22 CCAGGTAGAG 23FM0-23 CGCAGTTGCT 24FM0-24 GCTGCAGGCG 25FM0-25 TGCTGGGGCG 26FM0-26 CATACATCGA 27FM0-27 CCACAGCCTC 28FM0-28 GGAAGATGCG 29FM0-29 CGGTCAATCG 30FM0-30 CTGCTTTCGT 31FM0-31 TCACCGGCAC 32FM0-32 CCTCACCTTG 33FM0-33 TCCTGGCCCT TGAATTCCA CCGCTTCACG AAAATCGTGGG CGTGCAGGAT TGCTCATCGT TGGCAGCA GTTATTCCGCC GAAGACATAGG TTCGCAGTGC GCCGTGGTGA TCGACCGTGC ACCGTACTT GTAGCACTGCG AACCTATGTC AACGTACCCA GGCCGATGGG GCTTCAAGTG GCCCACGGGG TGGGAAGAGC CAGGTCGTTC TCGACCCTGA CCAGTTGCGG ACGCTCTTCC CACCCCGTGG GTTCTTCGCC GATGGATCGA GCAAGCGCAT CGACGCAATC ATCCTGTGCA CGGCAGGAAC GGGAAGTGAT GCTGGTAGCC CGTGCACAGG ATGATTGCGT TGAGCTGACC CTCAAGACCA ACAACCGCCT GTGGCCTGCG GGGCTCTACC CAACTGCGGG TTCTGCTCCC AGACCACGCC TTGGTAGAGC CCCGCAGGCC CTACCTGGGC ATGCAGGACC TCTGGTACAG CTTCAACCTG TTCGACGCCC CCCCAGCATA TAGTCGCGTG CAAACCATGC CTGGGCGTCG AACAGGTTGA CCTGCAGCTA CCGCCCAAGG CGGACATGCA AGCCGACAGC AAGCGCTGGC GGCTGTGGTT TCCAGACGCT CCTCATCCTC GCGCCAGCGC TTGCTGTCGG GATGTATGAG TTCCAGGGTC GATACATCAA GCACCTGATC GAGCAGACCG ATTGACCGCA TCGATGTCGA AGCTTGGGTA ATCGGTCTGC TCGATCAGGT CATCTTCCTG CAATGGAAGC AGGACAAGAA GCACGACATC ATGGGCTATC GCCGGTGATC ACCGAGCGGT ACGACTTGTC GCGATAGCCC ATGATGTCGT GAAAGCAGTG CCCCACCATA CCCGCTGGAT GCAGGCGCTG GACGACTCGC CTTGCCGTCC GTTTCGCGCA GGTATTCCTG CAGCGAGTCG TCCAGCGCCTACGGCAAGCA AGGTGAGGTG AAGGCCCTGC GCCGGTAG 34FM0-34 CTACCGGCGC AGGGCCTTCA 。
6.權利要求1所述的來自惡臭假單胞菌的黃素單加氧酶基因FMO在靛藍合成中的應
全文摘要
本發明涉及一種來自惡臭假單胞菌的黃素單加氧酶基因FMO及其制備方法和應用。具體涉及一種利用功能互補法從來自被芳香族化合物污染的土壤中能以色氨酸為底物合成靛藍的惡臭假單胞菌克隆、編碼黃素單加氧酶(FMO)基因，并將該基因重組到大腸桿菌體內，得到的一種具有黃素單加氧酶活性的重組菌，將其命名為黃素單加氧酶基因FMO，其核苷酸序列如SEQ ID No 1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No2所示。在有色氨酸存在的條件下，用該黃素單加氧酶基因FMO可合成靛藍。
文檔編號C12N15/53GK102559709SQ20101060054
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月22日 優先權日2010年12月22日
發明者付曉燕, 周惠, 姚泉洪, 彭日荷, 朱波, 田永生, 趙偉, 金曉芬, 陳晨, 韓紅娟 申請人:上海市農業科學院