專利名稱：：吸附重金屬鎘的重組惡臭假單胞菌ch01及應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬環境工程土壤環境治理領域。具體涉及一種新的微生物修復重金屬鎘污染土壤的基因工程菌的構建和應用。本發明與微生物基因工程和環境工程領域有關。
背景技術：
：鎘是一種典型的分散型重金屬元素，主要以硫化物的形式存在于銅、鉛、鋅等有色金屬礦藏中。隨著人類活動，鎘以各種途徑進入環境中，造成了嚴重的鎘污染。鎘在環境中有穩定積累和不易消除的特點，而鎘遷移轉化的最大特點是不能或不易被生物體分解轉化后排出體外，不易隨水移動，只能沿食物鏈逐級往上傳遞，通過食物鏈富集使人體慢性中毒。研究表明，鎘同時對人類和動物具有致癌作用，鎘污染地區居民的死亡率及癌癥罹患率同非污染地區相比均呈現出上升的趨勢。目前，鎘已被國際癌癥研究機構(IARC)歸為第一類致癌物(McGregoretal.,2000)在鎘污染的土壤環境中的植物也會不同程度地吸收該重金屬，使得根、莖、葉等器官及各種細胞器受到不同程度的傷害，使植物生物量下降。植物對鎘的吸收取決于植物根系生理功能及根際圈內微生物群落組成、士壤的理化性質、重金屬種類和濃度、氧化還原電位以及PH值等因素影響。部分植物對包括鎘在內的重金屬有較高的耐受和吸收性能而被用于修復重金屬污染的土壤，但是目前篩選出的富集重金屬的植物往往只對一種重金屬元素表現出較強的富集能力，而對復合污染的幾種重金屬元素同時富集的能力較弱；同時還存在著植物生物量小、生長周期長以及扎根淺等問題。植物根際微生物與植物根系所組成的生態系統對重金屬在根土界面的遷移轉化有著重要的作用。根際微生物對重金屬的吸附轉化和固定能有效降低重金屬對植物的傷害。而微生物對重金屬的耐受和解毒能力也為微生物從功能上治理和修復重金屬污染土壤提供了新的途徑。在所有微生物修復重金屬機制中，通過金屬硫蛋白吸附重金屬，特別是難于轉化為低毒或無毒的鎘一類的重金屬受到我們特別的關注。金屬硫蛋白(Metallothionein，簡稱MT)是一類低分子量，富含半胱氨酸，能夠結合Cd、Zn、Cu等多種金屬離子的蛋白質。1957年，Margoshes和Vallee首次從馬腎中分離得到。在重金屬吸附的利用方面，目前主要是將該類蛋白與周質空間或外膜組分融合后在大腸桿菌中表達，或者將MT的表達與金屬膜轉運蛋白的表達相結合(Jacobs,1989；Romeyer,etal,1990；Sousaetal.,1998；Vallsetal.,2000；Vallsetal.，1998)。但是大腸桿菌對重金屬的耐受能力較弱，而工程菌吸附重金屬后降低了工程菌的有效吸附周期，單個MT分子對于吸附效率和容量的提高也沒有明顯的增強。發明人所分離的一株高度耐受多種重金屬的細菌，初步具備修復多種重金屬污染的能力，同時也為構建高度重金屬污染土壤修復工程菌提供了一個十分有效的宿主。微生物表面展示技術是利用基因重組方法把靶蛋白(外源肽段或蛋白質結構域)基因序列與特定的載體蛋白基因序列(又稱定位序列)融合后導入微生物宿主細胞，從而使靶蛋白表達并定位于微生物細胞表面。被展示的多肽或蛋白質可以保持相對獨立的空間結構和生物活性。微生物展示策略能夠將參與重金屬吸附的蛋白質表達在宿主細胞表面，這既增強了修復工程菌與重金屬的接觸，又能降低細胞內的重金屬濃度，從而增強工程菌的耐受能力。
發明內容本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，篩選一種新的微生物修復重金屬鎘污染土壤的基因工程菌。本發明還涉及該基因工程菌的構建和應用。本發明的技術方案如下申請人:通過基因工程的方法篩選獲得一種能夠修復重金屬鎘污染土壤的基因工程菌CHOl，該菌株屬于惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)CH01，于2009年12月19日送交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏號為=CCTCCNOM209320。本發明的基因工程菌的制備方法是，首先將猴金屬硫蛋白α結構域四聚體(mMT4α)融合在野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestris)ATCC33913冰晶核蛋白N端(inaX-N)，并以此為主要功能單元構建一個廣宿主表達質粒。然后在本發明人所分離的高效耐受多種重金屬的惡臭假單胞菌X4(PseudomonasputidaX4)中利用鎘特異性啟動子進行表達，實現猴金屬硫蛋白α結構域四聚體在該細菌的表面展示，從而獲得高效專一吸附重金屬鎘的基因工程菌菌株，將該基因工程菌命名為惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)CHOl0本發明所提供的基因工程菌CHOl可以在多種重金屬存在的實驗室條件下顯著吸附重金屬鎘，與豇豆、玉米的共生的水培結果顯示本發明的基因工程菌CHOl可以在植物根際定殖并快速吸附重金屬鎘。本發明提供的基因工程菌CHOl可用于鎘污染土壤的治理，降低重金屬鎘污染土壤的生物毒性，促進污染區農作物的穩產高產。更詳細的技術方案見《具體實施方式》所述。序列表SEQIDNO:1是本發明所克隆并使用的野油菜黃單胞菌冰晶核蛋白N端(inaX-N)核苷酸序列。序列表SEQIDNO:2是本發明所克隆并使用的猴金屬硫蛋白α結構域(MTα)核苷酸序列。序列表SEQIDNO:3是本發明所克隆并使用的重金屬鎘響應啟動子核苷酸序列。序列表SEQIDNO:4是本發明人工構建的具有吸附重金屬鎘的功能序列的核苷酸序列。表1本發明用于植物水培的Hoagland’s營養液配方。圖1本發明實施例中所獲取的inaX-N序列PCR擴增結果的瓊脂糖凝膠電泳分析；圖中M=DNA分子量標準；1inxN的PCR擴增產物。圖2本發明實施例中所獲取的鎘響應啟動子的PCR擴增結果的瓊脂糖凝膠電泳分析；4圖中1=DNA分子量標準；2啟動子PCR擴增產物。圖3本發明實施例中修復重金屬鎘污染的功能質粒pCIM的構建圖及其物理圖■i並曰ο圖4本發明實施例中工程菌CHOl的生長態鎘吸附量測定結果。圖中X4指示本發明所采用的宿主菌；X4/pCIM指示本發明所使用的工程菌CH01。圖5本發明實施例中工程菌CHOl的靜態鎘吸附量測定結果。圖中X4指示本發明所采用的宿主菌；X4/pCIM指示本發明所使用的工程菌CH01。圖6本發明實施例中工程菌CHOl在共生水培實驗下對不同植物的干重和株高的影響。圖中CK指示的實驗條件為常規條件，無重金屬和工程菌；X4/pCIM+Cd指示添加工程菌和重金屬鎘；X4+Cd指示添加宿主菌X4和重金屬鎘；a部分是不同作物的干重比較；b部分是不同作物的株高比較圖7本發明實施例中工程菌CHOl在共生水培實驗下對不同植物植物根際鎘含量測定。圖中X4/pCIM指示添加工程菌后植物根際鎘含量；X4指示添加宿主菌X4后植物根際鎘含量；withoutincubation指示未添加任何菌株的植物根際鎘含量。具體實施方案以下敘述是根據本發明實施方案的實施例。應該說明的是，本發明的實施例對于本發明只有說明作用，而沒有限制作用。有關DNA的標準操作方法和所使用的藥品均參考分子克隆手冊(參見J.薩姆布魯克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黃培堂，王嘉璽等譯，分子克隆實驗指南(第三版)，科學出版社，2002版)所描述的內容。本發明中所涉及的其他各種實驗操作，均為本領域的常規操作技術，文中沒有特別說明的部分，本領域的普通技術人員可以參照本發明申請日之前的各種常用工具書、科技文獻或相關的說明書、手冊等加以實施。實施例1修復鎘污染的功能質粒pCIM的構建本發明所利用的核苷酸序列來源如下鎘響應啟動子來源于惡臭假單胞菌KT2440(Pseudomonasputida)KT2440(見SEQIDΝ0:3所示)；猴金屬硫蛋白α結構域序列(見SEQIDΝ0:2所示)，該序列來源于復旦大學黃仲賢教授實驗室提供；inaX-N來源于野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestris)ATCC33913(見SEQIDN0:1所示)。1、野油菜黃單胞菌的Inax-N的獲取申請人:以野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestris)ATCC33913的總DNA為模板，設計上游引物5，CCATGGATCGCGAAAAAGTCTTGG3，，下游引物5，GAATTCTGCGTACCCGCGAAAT3，，進行PCR擴增。PCR體系包括IOXBuffer2.5μ1，Mg2+Iμ1，dNTP2.5μ1，模板DNA2μ1，引物各1μl，K0D_Plus0.5μ1，ddH20補足25μ1。PCR條件為94°C5min，94°C30ec,58°C30sec,68°C3sec，30個循環。PCR產物進行凝膠檢測如圖1，然后將純化的PCR產物與T載體(購自寶生物工程(大連)有限公司)連接，獲得pMDIS-inax克隆，并對其中的inax進行測序。該片段的核苷酸序列序列如SEQIDNO:1所示，表明申請人獲得具有細菌表面展示功能的inax-N片段。52、猴金屬硫蛋白α結構域(MTα)序列的獲取和四聚體片段MTα4的構建PCR模極為復旦大學黃仲賢教授所饋贈的含有猴金屬硫蛋白的序列的質粒，申請人通過克隆獲得猴金屬硫蛋白的α結構域序列(見SEQIDΝ0:2所示)。具體方法如下以含有猴金屬硫蛋白的序列的質粒DNA為模板，設計PCR引物進行猴金屬硫蛋白α結構域片段的擴增。為了進行猴金屬硫蛋白α結構域多聚體的構建，利用引物(如后所述)在該片段兩側引入BglII和BamHI酶切位點。引物序列和PCR反應條件如下以上游引物5'-cggaAGATCTaagaaaagctgctgctc,下游引物5'-attcGGATCCggcacaacagttgcac進行PCR反應，PCR體系包括IOXBuffer2.5μ1，Mg2+Iμ1，dNTP2.5μ1，模板DNA2μ1，引物各1μ1，KOD-Plus0.5μ1，ddH20補足25μ1。PCR條件:94°C2min，94°C15sec，58°C30sec,68°C20sec，循環25次。PCR產物進行凝膠電泳分析，并按照常規方法純化檢測。然后將MTa基因片段連入T載體，藍白斑篩選獲得ρΤΑ-ΜΤα陽性克隆，并進行測序和分析。所克隆的猴金屬硫蛋白α結構域核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，表明獲得的猴金屬硫蛋白α結構域序列正確。接下來用BglII和BamHI酶切ρΤΑ-ΜΤα，瓊脂糖凝膠回收小片段MTα(IlObp)，MTa與經BamHI酶切并去磷酸化的載體pGEX-2T連接。酶連操作按照以下方法進行取PGEX-2TIyl稀釋到ΙΟμΙ。取回收的MTa基因片斷，室溫下溶解。建立酶連體系如下體系1(物質的量比為140)稀釋后的線狀PGEX-2T0.2μ1，ΜΤa8.5μ1，T4DNALigaseBuffer1μ1,T4DNALigase0·3μ1，ddH20補足10μ1。體系2(對照)稀釋后的線狀PGEX-2T0.2μ1，T4DNALigaseBuffer1μ1,T4DNALigase0.3μ1，ddH20補足10μ1。16°C過夜反應。按照申請人的經驗，一步酶連反應一般可以獲得三聚串連體(pGMTa3)，然后以三聚串連體為基礎進一步獲得更高數目串連體。PGMTα3經BamHI酶切，并進行去磷酸化處理，獲得線狀PGMTα3，溶解凍存的MTα片段，建立線狀pGMTα3與MTα片段的酶連體系(pGMTa3MTa的物質的量比為140)。酶連轉化獲得的克隆子經過驗證得到四聚體串聯體MTa4，并被命名為pGEX-4T_mMT4a。3、鎘特異性啟動子的克隆和X4表達載體的構建以惡臭假單胞菌KT2440(AnuLeedja..rvetal.，2008)基因組DNA為模板，PCR擴增鎘響應啟動子片段。惡臭假單胞菌KT2440總DNA的抽提(1)用1.5ml離心管將LB液體培養基過夜培養的菌液離心收集菌體，6，OOOrpm離心5min，棄上清液；(2)加入300μ1ΤΕ，吹吸充分混勻，8，OOOrpm離心5min，棄上清液，重復2次；(3)用300μITE混勻，再加入15μ110mg/ml的溶菌酶37°C水浴30min；(4)加入30μ110%的十二烷基硫酸鈉(SDS)混合均勻水浴37°C至50°C；(5)再加入5μ1蛋白酶K，50°C水浴Ih；(6)加入80μ15Μ的NaCl；(7)加等體積的酚-仿，振蕩5min，12，OOOrpm離心5min，使溶液分層，取上層水相；(8)重復上述操作，至無蛋白析出，取上層水相；(9)加入2倍體積的無水乙醇在_20°C保溫30min沉淀DNA，12，OOOrpm離心5min，棄上清液；(10)加入70%乙醇洗滌沉淀，12，OOOrpm離心5min，棄上清，置于室溫自然風干，加入50μ1ddH20使DNA完全溶解；(11)將抽提的總DNA取2μ1，用0.7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA質量。然后以上述抽提的總DNA為模板，以正向引物5，一GGGTCGACCTTAAATTGAGCCTGTTG—3，；反向引物5，—GCGAAGCTTAGATCTCAATGCCCGTGA—3，進行PCR擴增，50μLPCR反應體系中包含10μL5XPCRBuffer,28.75μLdH20，0.25μLKOD酶，0.5μL正向引物，0.5μL反向引物，1μL模板。PCR反應參數和程序為94°C，2min，1個循環；94°C，15sec，64°C，30sec，68°C，3min,30個循環；4°C，5min,1個循環。PCR產物進行凝膠檢測如圖2，然后將啟動子連接入廣宿主表達質粒PTR102，形成pTR102-PcadR，并進行測序。序列如SEQIDNO34鎘修復功能質粒pCIM的構建和基因工程菌CHOl的獲取為了進行高效專一的重金屬鎘污染土壤的修復，申請人在本身能耐受鎘并具有一定鎘修復能力的宿主菌惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)X4(該菌株于2009年12月19日送交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏號為CCTCCNOM209319)的基礎上，以鎘特異性啟動子驅動金屬結合蛋白猴金屬硫蛋白α結構域四串聯體在宿主菌表面展示表達。功能質粒包括鎘特異性啟動子，細菌表面展示元件inx-N和金屬硫蛋白α結構域四串聯體。具體構建流程見圖3。構建過程如下所述。以pGEX-4T-mMT4α為模板，以5，GAATTCTGCGTACCCGCGAAAT3，禾P，GGATCCTTATTATCTAGAGATTCGAATTCCCG3，為引物進行PCR擴增，PCR體系包括引物各2.5μL，模板DNAlμL,Ex-TaqDNA聚合酶0.8μL，IOXEx-TaqDNA聚合酶緩沖液5μL，dNTPmixture4μL,ddH2034.2μL,PCR條件為94°C2min，94°C15sec，58°C30sec，68°C20sec，循環25次。PCR產物經過凝膠電泳分析檢測；然后連接到pMD18-T得到pMD18-mMT4α質粒，然后進行測序以確定。將pMD18-mMT4α和pMD18_inaX分別用限制性內切酶EcoRI處理，使兩者產生互補的粘性末端，連接得到pMD18-inaX-N-mMT4α，經過測序證實inaX-N_mMT4α為同一開放閱讀框(ORF)下的融合基因，其核苷酸序列如SEQIDΝ0:4所示(即本發明需要的功能序列)。然后用NcoI和BamHI分別處理pTR102-PcadR和pMD18-inaX-N-mMT4α，回收pTR102_PcadR和inaX-N_mMT4α融合基因，酶連后得到載體pCIM(pTR102-PcadR-inaX-N-mMT4α)，電轉化Χ4得到重組菌X4/pCIM，該重組菌被命名為CHOl04、重組惡臭假單胞菌CHOl的生物學及遺傳學特性①生物學特性革蘭陰性桿菌，單端叢毛菌，專性需氧，最適生長溫度25°C30°C，生長迅速，但是在42°C不生長，飽和培養物有腥臭味。有莢膜。對鎘(Cd2+)7mM、銅(Cu2+)4.5mM、鈷(Co2+)7.5mM、銀(Ag+)O.05mM、鋅(Zn2+)7.5mM等重金屬有較好的耐受性。②遺傳學特性本發明是以對重金屬具有高度耐受性的惡臭假單胞菌X4為出發菌株得到的重組惡臭假單胞菌CH01，該重組菌株CHOl含有本發明構建的鎘吸附功能質粒pCIM，該質粒能在該重組菌中穩定存在，表達正常，對受體菌的生長無重大影響。③培養條件本重組菌CHOl所使用的培養基為MJS培養基HEPES12.5mM(pH7.1)；NaCl50mmol/L；NH4Cl20mmol/L；KCllmmol/L；MgCl2lmmol/L；7MnCl2O.05mmol/L；酪氨酸0.8%；甘油4%；硫胺素0.005%，121°C高壓蒸汽滅菌30min。培養本發明的重組菌CHOl時應加入氨芐青霉素Amp100μg/mL；鹽酸四環素Tet20μg/mL,然后進行28°C，200r/min搖瓶培養。培養惡臭假單胞菌X4時基本條件同上，但該菌使用的抗生素為氨芐青霉素Amp，其終濃度為100μg/mL。實施例2本發明的基因工程菌CHOl對鎘吸附能力實驗1、生長態鎘的吸附將本發明構建的基因工程菌CHOl和出發菌株惡臭假單胞菌X4在含有相應抗生素的MJS培養基中過夜培養，然后按照1100的比例接種到50毫升的新鮮培養基中培養到OD600為0.6，然后加入終濃度為100ymol/L的CdCl2,于llh、21h、31h分別取樣2mL，測量鎘的吸附量。具體測量方法是將菌液樣品于13000r/min離心5min，沉淀用5mmol/LHEPES緩沖液(pH7.1)混合0.8%NaCl溶液洗滌3次，65°C干燥24h，再加入100μL濃硝酸硝化48h，硝化產物用ddH20稀釋，然后用石墨爐原子吸收分光光度計測定菌體中鎘的含量。圖4表明，隨著培養時間的增加，菌體對鎘的單位吸附量逐漸增大。基因工程菌CHOl對鎘的吸附量達到2.17士0.4nm0l/mg(干重)，是對照菌吸附量的2倍左右，顯著提高了細菌對鎘的吸附能力。本實驗證實本發明中的基因工程菌CHOl能顯著增強對重金屬鎘的吸附而具備修復鎘污染土壤或水體的能力。2、靜態鎘吸附為了模擬工程菌投入土壤后，在土壤中的緩慢生長狀態對鎘吸附的影響，發明人進行了靜態細胞鎘吸附實驗。將基因工程菌CHOl和出發菌株惡臭假單胞菌X4進行過夜培養，然后按照體積比為1100的比例接種到50毫升的新鮮培養基中培養到0D_為0.6，然后加入終濃度為50μmol/L的CdCl2,28°C靜置培養17h，冰上冷卻20min，4°C離心收集菌體，用50mmol/LTris-HCl(pH7.4)緩沖液洗滌3次，重懸，再加入終濃度為50μmol/L的CdCl2,分別于0、5、30、60和150min取樣2mL，按照前述方法測定鎘的吸附量。從圖5可以看出，細胞與鎘的結合在很短時間內完成，最大吸附量的90%都在5min時間內完成。工程菌的最大吸附量達到2.96士0.5nmol/mg(干重)，是對照的0.5士0.02nmOl/mg(干重)吸附量6倍左右。在5min取樣測得的吸附量與最高濃度吸附量相比較，占91%以上，這說明工程菌能在5分鐘內快速、高效且專一的吸附重金屬鎘。本實驗證實在模擬土壤環境中本發明中的基因工程菌CHOl能高效專一的吸附重金屬鎘。實施例3本發明的基因工程菌CHOl與植物共生水培實驗本發明的制備的用于水培培養的植物營養液見表1所示。表1用于水培實驗的植物營養液配方本實施例的具體步驟如下(1)將玉米和豇豆種子用95%的乙醇浸泡5min，再用100%NaClO洗5min，然后用無菌水漂洗5-10次。將玉米和豇豆種子置于裝有無菌水的培養皿中，置于28°C恒溫光照培養箱中催芽，玉米和豇豆種子的培養皿中水變渾濁后換水，約3天生根。將生根的種子置于石英砂上繼續培養，每天澆一次Hoagland’s營養液，28°C恒溫光照培養10天。(2)將培養至穩定期的惡臭假單胞菌X4和基因工程菌CHOl在4°C，4000r/min條件下離心IOmin收集菌體，并用PBS(pH7.2)洗滌兩次，最終重懸于Hoagland’s營養液中，使終濃度達到107CFU/mL。本發明中用于植物水培的Hoagland’s營養液是由去離子水配好的大量元素和微量元素的的1000倍濃縮液，避光保存備用。換培養液時用去離子水稀釋后根據需求用氫氧化鈉和鹽酸溶液調節PH值。具體的元素組成如表1所示。(3)將植物小苗移栽到裝有Hoagland's營養液的三角瓶中，瓶口用錫紙將基部固定。每個瓶子裝入一個通氣管，管口置于瓶底部，用空氣泵向瓶內通氣。三角瓶外面套上一層不透光的黑布，置于光照培養室培養，每7天換一次Hoagland’s營養液，培養20天后接入處理過的工程菌。待菌體在根部定殖4天后，換成含有100μmol/L鎘的營養液。繼續培養7天后收獲植株，將收獲的植株根分離，108°C烘干48h后稱重，取0.05g于ImL濃硝酸中硝解48h后，稀釋過濾后測定鎘含量。實驗結果表明，加入鎘的植株都表現出生長遲緩、植株矮小、莖倒伏、葉片黃化等現象。但接入基因工程菌CHOl后能顯著提高植物在鎘環境下的干重和株高，增強對鎘脅迫的耐受(圖6)。接種工程菌CHOl的植株和接種惡臭假單胞菌X4的相比較，玉米和豇豆組中的基因工程菌CHOl處理比惡臭假單胞菌X4處理的干重和株高都要高，說明本發明的基因工程菌工程菌CHOl能有效緩解重金屬鎘對植物的生物毒性。植物根際鎘含量原子吸收結果(圖7)表明，接入基因工程菌CHOl和原宿主菌惡臭假單胞菌X4的植株其根際與對照組根際相比都有較高的鎘吸附量，且主要集中在植物的根部。吸附量最高均為接入基因工程菌CHOl的植株根際，其中豇豆根際最高達到16.13士3.SOnmol/mg(干重)，與對照比較，吸附量差異最大的為玉米組，接入基因工程菌CHOl的植株根際鎘吸附量是對照組到1.75倍。本實驗證明本發明中的基因工程菌CHOl在部分農作物的實際生產中能通過在植物根際吸附固定重金屬鎘而避免重金屬向植物體內的轉移，從而保護農作物免受鎘的毒害。9參考文獻1.McGregorDB,BaanRA,PartenskyC,RiceJΜ,WilbournJD.Evaluationofthecarcinogenicriskstohumansassociatedwithsurgicalimplantsandotherforeignbodies—areportofanIARCMonodraphsProgrammeMeeting,InternationalAgencyforResearchonCancer.EurJCancer,2000,36:307_3132.JacobsFA,BeaucheminFM,BrousseauMR.Humanmetallothionein-IIissynthesizedasastablemembrane-localizedfusionproteininEscherichiacoli..Gene,1989,83:95_1033.RomeyerFM,JacobsFA,BrousseauR.ExpressionofaNeurosporacrassametallothioneinanditsvariantsinEscherichiacoli.ApplEnvironMicrobiol,1990,562748-27544.SousaC,KotrbaP,RumlT,CebollaA,DeLorenzoV.MetalloadsorptionbyEscherichiacolicellsdisplayingyeastandmammalianmetallothioneinsanchoredtotheoutermembraneproteinLamB.JBacteriol,1998,180:2280_22845.VallsM,deLorenzoV,Gonzalez-DuarteR,AtrianS.Engineeringouter-membraneproteinsinPseudomonasputidaforenhancedheavy-metalbioadsorption.JInorgBiochem，2000，79:219_2236.VallsM,Gonzalez-DuarteR,AtrianS,DeLorenzoV.BioaccumulationofheavymetalswithproteinfusionsofmetallothioneintobacterialOMPs.Biochimie,1998,80:855_8617.AnuLeedja“rv,AngelaIvask,andMarkoVirta.InterplayofDifferentTransportersintheMediationofDivalentHeavyMetalResistanceinPseudomonasputidaKT2440.JBacteriol,2008,190(8)=2680-2689序列表<110>華中農業大學<120>吸附重金屬鎘的基因工程菌CHOl及應用<130><141>2009-12-29<160>4<170>PatentInversion3.1<210>1<211>540<212>DNA<213>野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestris)<220><221>gene<222>(1)..(540)<223><400>10103]atggtccatatgaatcgcgaaaaagtcttggcattacgcacttgcacgaacaacatgtcc600104]gatcattgcgggctgatctggccactgtccggcatcgtcgaatgtcggcattggcaaccc1200105]agcatcaaacaggaaaacggcttgaccggcCtgttgtggggacagggcaccaatgcgcat1800106]ctgaacatgcatgccgacgcgcattgggtcgtctgcatggtggacaccgccgacatcatc2400107]tggctgggcgaagagggaatgatcaagttccccagggcggaggtggtctacgccggcaac3000108]CgtgCgggCgcgatgagctgcatcgccgccggcatcgagcagcattcgccacccaagccc3600109]gagccccctgcagacagcgtgattgctgcggagttcactcccaaggcggcgcatgcgcaa4200110]ttcactgcgcccgtcgttgaaagcggtgcgcattccaccgcgccactgccatcgccgcct4800111]aatggcatcggcccacaagccgcgcagccgtcaaatgcgatcctgcgtacccgcgaaatc5400112]<210>20113]<211>960114]<212>DNA0115]<213>猴子(Macaca)0116]<220>0117]<221>gene0118]<222>⑴··(96)0119]<223>0120]<400>20121]aagaaaagctgctgctcctgCtgCCCCgtgggctgtgccaagtgtgcccagggctgtgtc600122]tgcaaaggggcgtcggagaagtgcaactgttgtgcc960123]<210>30124]<211>5410125]<212>DNA0126]<213>惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)0127]<220>0128]<221>promoter0129]<222>⑴··(541)0130]<223>0131]<400>30132]gcgaagcttttggctcaatgcccgtgactccgccccacatgggaatgttcggtatccggt600133]accgataccgCCCCgtttgtctccagttgctgcaagatcgcgcattcactcccctgcgcg1200134]ttgcagcgccgccgcagctccaccagctgctcctgcaatgccaccaagccatcgatccgc1800135]gcctgaacatgctcgatatgctcgtcgatcagcgcattgacgctgccgcacgcgtcgtcg2400136]gggctgtcgcgcaggcgtagcaggctgcgaatttcgtccagggtcatgtccagcgtgcgg3000137]cagttgcggatgaaggtcagccgctccacatgggcctgggtgtacaaccggtagttgccc3600138]tcgctgcgcgCCggCtCtggcagcaggttttcacgctcgtagtagcggatggtttccacc4200139]gcgcagtcggtggctttggccagttctccgatcttcatcacgaaatctccagcaagtggc4800140]ttgaccctatagtggctacagggtgttcacttggcaacaggctcaatttaaggatgaccc5400141]C5410142]<210>40143]<211>9660144]<212>DNA0145]<213>人工序列0146]<220>0147]<221>gene0148]<222>⑴··(966)0149]<223>0150]<400>40151]atggtccatatgaatcgcgaaaaagtcttg0152]gatcattgcgggctgatctggccactgtcc0153]agcatcaaacaggaaaacggcttgaccggc0154]ctgaacatgcatgccgacgcgcattgggtc0155]tggctgggcgaagagggaatgatcaagttc0156]CgtgCgggCgcgatgagctgcatcgccgcc0157]gagccccctgcagacagcgtgattgctgcg0158]ttcactgcgcccgtcgttgaaagcggtgcg0159]aatggcatcggcccacaagccgcgcagccg0160]gaattcaagaaaagctgctgctcctgctgc0161]tgtgtctgcaaaggggcgtcggagaagtgc0162]tgctcctgctgccccgtgggctgtgccaag0163]tcggagaagtgcaactgttgtgctggatct0164]ggctgtgccaagtgtgcccagggctgtgtc0165]tgtgccggatctaagaaaagctgctgctcc0166]cagggctgtgtctgcaaaggggcgtcggag0167]gcattacgcacttgcacgaacaacatgtcc60ggcatcgtcgaatgtcggcattggcaaccc120Ctgttgtggggacagggcaccaatgcgcat180gtctgcatggtggacaccgccgacatcatc240cccagggcggaggtggtctacgccggcaac300ggcatcgagcagcattcgccacccaagccc360gagttcactcccaaggcggcgcatgcgcaa420cattccaccgcgccactgccatcgccgcct480tcaaatgcgatcctgcgtacccgcgaaatc540CCCgtgggCtgtgccaagtgtgcccagggc600aactgttgtgccggatctaagaaaagctgc660tgtgcccagggctgtgtctgcaaaggggcg720aagaaaagctgctgctcctgCtgCCCCgtg780tgcaaaggggcgtcggagaagtgcaactgt840tgctgccccgtgggctgtgccaagtgtgcc900aagtgcaactgttgtgccaagcttccggga96096權利要求一株能夠修復重金屬鎘污染的重組惡臭假單胞菌CH01，其特征在于，該菌株是惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)CH01，保藏在中國典型培養物保藏中心，其保藏號為CCTCCNOM209320。2.一個具有重金屬修復功能的廣宿主質粒的構建方法，其步驟包括將SEQIDNO2所示的猴金屬硫蛋白α結構域序列，組裝成四聚體mMT4a，然后將其與如SEQIDN0:1所示的野油菜黃單胞菌ATCC33913冰晶核蛋白N端序列結合，得到人工構建的具有吸附重金屬鎘的如序列表SEQIDNO:4所示的核苷酸序列；再將SEQIDNO:4所示的核苷酸序列與SEQIDNO:3所示的惡臭假單胞菌KT2440的鎘特異性啟動子序列進行拼接，最后將所述的SEQIDNO:4及SEQIDNO:3所示的核苷酸序列與廣宿主表達載體pTR102拼接，獲得質粒pCIMo3.權利要求1所述的重組惡臭假單胞菌CHOl重金屬鎘污染治理中的應用。全文摘要本發明屬于環境工程土壤環境治理領域。涉及一種新的微生物修復重金屬鎘污染土壤的基因工程菌的構建及應用。將猴金屬硫蛋白α結構域四聚體融合在野油菜黃單胞菌ATCC33913冰晶核蛋白N端，以此為主要功能單元構建一個廣宿主表達質粒，然后在高效耐受多種重金屬的惡臭假單胞菌X4中利用鎘特異性啟動子進行表達，實現了猴金屬硫蛋白α結構域四聚體在該細菌中的表面展示，獲得高效專一吸附重金屬鎘的基因工程菌CH01。該工程菌可在多種重金屬存在的條件下顯著吸附重金屬鎘，與小麥、豇豆、玉米的共生水培結果顯示該工程菌CH01可以在植物根際定殖并快速吸附鎘離子。本發明還公開了基因工程菌CH01的構建方法。其保藏號為CCTCCNo.M209320。文檔編號C12N15/78GK101892187SQ20091027344公開日2010年11月24日申請日期2009年12月30日優先權日2009年12月30日發明者何小川,李友國,王珂征,陳雯莉,雷磊,黃巧云申請人:華中農業大學