專利名稱：一株降低烤煙煙葉亞硝胺的惡臭假單胞菌t2-2及用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于農業微生物技術領域和煙草陳化技術領域，具體地說，本發明涉及利用一種人工分離的微生物菌株，該菌株是一種降低煙草特有亞硝胺的反硝化細菌。所述的菌株為惡臭假單胞菌T2-2。本發明還涉及到該菌株在烤煙上部煙葉人工陳化中的應用。
背景技術：
隨著社會的發展，吸煙與健康問題已得到廣泛的關注，煙草及其煙草制品和煙氣中的有害物質，特別是有致癌性的煙草特有亞硝胺(TSNA)對人體的危害更加引起世界各國的重視，如今人們最關心的就是如何最大限度降低煙草中TSNA的含量問題。 煙草特有亞硝胺(Tobacco-Specific Nitrosamines,簡稱TSNA)是一組僅發現于煙草及其煙草制品和煙氣的致癌物質，主要包括N-亞硝基去甲基煙堿(NNN)，4-(N-甲基-亞硝基)-I-(3-吡啶基)-I- 丁酮(NNK)，N-亞硝基新煙草堿(NAT)和N-亞硝基假木賊堿(NAB)等四種成分。其中NNN和NNK有顯著的致癌作用，而NAB和NAT則無明顯的致癌作用。煙葉中的TSNA幾乎都產生于調制期間，但其自身性狀對TSNA形成的影響也是非常明顯的。因此，降低煙葉中的TSNA需要從工業和農業兩方面著手。農業上，從栽培和育種的角度來降低TSNA，不屬于本發明的研究范疇；工業上，在調制過程中降低TSNA，一般來說，常常需要使用化學試劑，而化學試劑的大量使用往往也帶來一系列負面問題，如對環境的污染，還有對煙葉品質的影響等，目前，絕大多數研究都是通過物理吸附的方法，即在卷煙濾嘴中加入沸石等，此方法對煙氣中TSNA降低率相當高，但其造價非常昂貴，不利于大規模生產。因此，利用生物降低煙草TSNA就具有重要的社會意義及經濟價值。TSNA為4種亞硝胺的混合物，不能直接篩選降解TSNA的菌株，只能通過降低其前體物質——煙堿和硝酸鹽、亞硝酸鹽的含量，達到最終降低TSNA的目的，其中，硝酸鹽、亞硝酸鹽含量微少，是限制性因素，因此，本發明通過降解硝酸鹽、亞硝酸鹽途徑來降低TSNA。惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)T2-2是華中農業大學農業微生物國家重點實驗室微生物工程室篩選得到的一株可高效降低煙草特有亞硝胺的反硝化細菌。烤煙上部煙葉陳化試驗結果顯示該菌株具有較好的應用效果它對降低煙草亞硝胺有顯著效果(P < 0. 05)，其中，NNN和NNK的降低率分別達到28. 33%和57. 83%。國內外對煙草特有亞硝胺的研究工作，取得了一定進展，目前來說，大多數研究仍處于實驗室階段，有待進一步研究開發成產品加以應用，且研究多數集中在白肋煙，關于降低烤煙中TSNA的研究鮮少報道。祝明亮(公開號CN 1579260A,2005)等從大量煙草內生細菌中篩選出一株銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa KenLXP30),處理調制后能降低78. 23 98. 72%白肋煙TSNA含量。但銅綠假單胞菌有致病性，不適于作用煙草這種生活消費品。祝明亮(公開號CN 1580237A，2005)等從大量煙草內生細菌中篩選出一株放射根瘤菌KenLXR34 (Rhizobium radiobacter KenLXR34)菌株，接種葉面噴霧處理調制后，能降低55. 46%白肋煙TSNA含量。汪安云(2006)等研究表明從白肋煙TRM品種葉片中分離得到一株能還原硝酸鹽和亞硝酸鹽的菌株，該菌株為根瘤土壤桿菌屬，定名為Agrobateriumtumefaciens,噴灑菌株處理的煙葉中TSNA含量有明顯的降低，比同一時期對照煙葉中TSNA含量降低了 81.3%。這兩株菌的效果明顯，但是發酵培養時間過長，不適合大規模生產，且作用對象都為白肋煙新鮮煙葉。與上述菌株相比，本發明的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida) T2-2是一種降低烤煙煙草特有亞硝胺的反硝化細菌，可應用于好氧與微氧環境，發酵工藝操作簡單，發酵時間短，生長條件適宜，在普通培養基中即可生長良好，方便大規模生產。該菌株具有較強的環境適應能力，應用領域更廣，包括栽培，陳化，復烤前后和煙絲等方面。本發明涉及的該菌株在烤煙上部煙葉人工陳化中的應用，彌補了烤煙中降低TSNA研究報道稀少的遺憾。
發明內容
本發明的主要目的在于克服現有技術的缺陷，提供一株可以在好氧條件下生長的 能夠降低烤煙煙葉特有亞硝胺(TSNA)的菌株，利用該菌株進行發酵培養生產菌劑，降低烤煙煙葉中特有亞硝胺的含量，為卷煙生產提供優質煙葉原料。申請人:從烤煙煙葉中分離得到一株好氧條件下生長的能夠降低煙草特有亞硝胺的反硝化細菌，該菌株是惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida) T2-2,于2011年3月21日送交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏編號為CCTCC NO :M2011074，經過16S rDNA序列測定，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示。惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida) T2-2的微生物學特征短桿狀，無芽孢，革蘭氏陰性菌，V. P實驗陽性，甲基紅實驗陽性，氧化酶陰性，硝酸鹽還原陽性，亞硝酸鹽還原陽性(具體特征見實施例I)。本發明所提供的細菌為所篩選的一株好氧反硝化菌，系本發明人從大量烤煙煙葉表面細菌菌株中篩選出來的，具有顯著降低烤煙TSNA的作用。本發明所述的惡臭假單胞菌T2-2菌株的應用方法是發酵培養一收集菌體一制備菌懸液一噴灑上部烤煙一人工陳化一卷煙。惡臭假單胞菌T2-2菌株的發酵培養的條件為180rpm，28°C，12h。惡臭假單胞菌T2-2菌株的發酵菌體的收集在發酵培養結束后，8000rpm，8min離心沉淀菌體。惡臭假單胞菌T2-2菌株的發酵菌體通過麥云度法(見趙斌和何紹江，2002)可制備成108CFU/mL的菌懸液。惡臭假單胞菌T2-2菌株108CFU/mL的菌懸液在烤煙上部煙葉的噴灑用量為煙葉質量的10%，以煙葉噴灑后手捏不成團為宜。惡臭假單胞菌T2-2菌株制備的108CFU/mL菌懸液噴灑人工陳化烤煙上部煙葉的條件為處理溫度28°C、相對濕度45%，處理時間21天。更詳細的技術方案見《具體實施方式
》。本發明的優點是I.本發明屬于生物領域，即利用微生物的方法，通過降解TSNA的前體物質——硝酸鹽、亞硝酸鹽,來降低TSNA含量，比傳統的物理化學降低TSNA含量的方法更為方便、經濟、環保。2.本發明所獲得的惡臭假單胞菌T2-2是一株好氧反硝化菌株，可應用于好氧與微氧環境，發酵工藝操作簡單，發酵時間短，生長條件適宜，在普通培養基中即可生長良好，方便大規模生產。3.本發明所獲得的惡臭假單胞菌T2-2是從烤煙煙葉表面篩選出來的，比一般的外源細菌更容易在烤煙煙葉上生長。4.本發明涉及的惡臭假單胞菌T2-2在烤煙上部煙葉人工陳化中的應用，完善了關于降低烤煙TSNA研究報道稀少的不足。5.本發明所獲得的惡臭假單胞菌T2-2，該菌株對TSNA的降低率較高，用無菌水配成菌懸液后，對烤煙上部煙葉葉面進行噴霧處理，與對照相比，煙葉中TSNA的關鍵組分NNN 和 NNK，分別下降 NNN 28. 33% 和 NNK 57. 83%。
序列表SEQ ID NO : I是惡臭假單胞菌T2-2菌株的16S rRNA的核苷酸序列。圖I :是本發明的技術流程圖。圖2 :是本發明惡臭假單胞菌T2-2在100X油鏡下的菌體形態。圖3 :是本發明惡臭假單胞菌T2-2在Giltay培養基中的顏色、產氣變化。圖4 :是用無菌水處理烤煙上部煙葉后，陳化過程中Ck的硝酸鹽和亞硝酸鹽的含量變化曲線。圖中CK為對照實驗，即用無菌水處理烤煙上部煙葉。圖5 :是惡臭假單胞菌T2-2對烤煙上部煙葉處理后，陳化過程中硝酸鹽和亞硝酸鹽的含量變化。圖6 :是不同濃度惡臭假單胞菌T2-2處理烤煙上部煙葉后，在14d時硝酸鹽含量和2Id時亞硝酸鹽含量。
具體實施例方式下面結合實例來進一步闡述本發明，但本發明的內容并不局限于此。實施例I惡臭假單胞菌T2-2的分離、篩選及微生物學分類鑒定(I)本發明所獲得的惡臭假單胞菌T2-2是這樣篩選分離的a、選取20g烤煙煙葉進行馴化；馴化初始，將來自于武漢卷煙廠倉庫的不同煙葉產地(湖北省、云南省)自然存放2年的煙葉，未經過人工陳化處理的烤煙煙葉用已滅菌的剪刀剪碎，選取20g置入300mL反硝化液體培養基中，于恒溫培養箱中，28°C下培養2 5d ;10倍稀釋涂分離培養基平板，得到單菌落，多次經LB平板劃線純化后，轉入斜面保藏。b、從斜面中挑取少許菌接到裝有8mL LB培養液的PA瓶中活化，12h后，按V/V計I 2%接種量接種到裝有50mL LB液體培養基的250mL三角瓶中，放入搖床，在溫度為30°C，轉速為180rpm的條件下培養10h。取ImL發酵液接入裝有反硝化培養基的三角瓶中，得到對總氮去除率達到50%以上的菌株。C、將總氮去除率達到50%以上的菌株進行發酵培養，取ImL發酵液接到裝有Giltay培養基的試管中，放入28°C恒溫箱中培養10 14d。期間觀察試管的變色、產氣情況,如圖3。Giltay管中最先變色并最先產氣的,其反硝化的能力最強。該Giltay培養基試管是這樣實現的將制備好的Giltay液體培養基,加入大試管(20mmX200mm)中,把纏有細線的小試管(12mmX75mm)倒立放入大試管中，將小試管的氣體排盡，塞住大試管，留部分細線在大試管外，便于小試管的提升和降落，滅菌備用。上述篩選分離中所需的培養基配方為反硝化培養基(或稱富集培養基):KN032.Og/L、MgSO4 7H20 0. 2g/L、K2HPO4O. 5g/L和酒石酸鉀鈉20. Og/L ;加蒸餾水至IL ;滅菌前將pH調至7. 2 ;在121°C高壓蒸汽下滅菌20mino分離培養基KN032.0g/L、MgS04 *7H20 0. 2g/L、K2HP040. 5g/L 和酒石酸鉀鈉 20. Og/L，瓊脂15 20g/L ;加蒸餾水至IL ;滅菌前調pH至7. 2 ;在121°C高壓蒸汽下滅菌20min。LB培養基蛋白胨10. Og/L,酵母提取物5. Og/L和氯化鈉10. Og/L,瓊脂15 20g/ L ;加蒸餾水至IL ;滅菌前調pH至7. 2 7. 4 ;在121°C高壓蒸汽下滅菌20min。Giltay培養基A溶液:1. Og KNO3,1. Og天冬酰胺和5mL I % BTB酒精溶液；加蒸餾水至 500mL ；B 溶液8. 5g 檸檬酸鈉，I. Og MgSO4 7H20，0. 05g FeCl3 6H20,1. Og KH2PO4,0. 2g CaCl2 *2H20 ;加蒸餾水至500mL。將A溶液和B溶液這兩種溶液混合；滅菌前調pH至7. 0 ;在115°C高壓蒸汽下滅菌30min。(2)傳統微生物學分類鑒定I.形態特征菌落呈白色，光滑，邊緣整齊，菌體呈短桿狀，革蘭氏染色呈陰性。2. 16S rDNA 鑒定方法a.本發明的惡臭假單胞菌T2-2基因片段長度為1420bp，該菌的Genebank登錄號 JF699758b. 16S rDNA引物設計與PCR過程其具體步驟如下將惡臭假單胞菌T2_2(保藏號為CCTCC NO M2011074)菌株接種于LB培養基，180rpm，28°C震蕩培養12小時，離心收集菌體，懸浮后加入溶菌酶，采用CTAB法和SDS法破壁(張瑞福，2003)，采用苯酚-氯仿-異戊醇提取基因組DNA (顏子穎和王海林，1998)，用 16S rRNA 通用引物正向引物 27F(5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和反向引物 1492R(5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3')，對其 16S rRNA 基因進行 PCR 擴增，將擴增的產物交由北京奧科生物技術有限責任公司進行測序。PCR條件為94°C，5min ；95°C,40s, 55 (-1°C / 循環)°C，30s，72°C，25s，6 循環；95 °C, 40s, 55 °C, 45s, 72 °C, I. 5min，30 循環；72°C,5min,10°C,5min。PCR產物長度為1420bp，其核苷酸序列表如序列表SEQ ID NO:I所示。3.生理生化檢測對分離到的分離菌T2-2進行37項相關生理生化檢測，發現其與GeorgeM. Garrity ((Bergeyj s Mannual of Systematic Bacteriology》Vol. VIII, 1974 年版中提供的標準菌株(Pseudomonas putida biovar B)的生理生化結果完全一致，最終將本發明的分離菌T2-2鑒定為惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida),其生理生化特征如表I。表I惡臭假單胞菌T2-2的生理生化實驗
權利要求
1.一株在好氧條件下生長能降低烤煙煙葉亞硝胺的反硝化細菌，其特征在于，該菌株是惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)T2-2,保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC),其保藏編號為CCTCC NO :M2011074，其16S rDNA序列如序列表SEQ ID NO 1所示。
2.一株在好氧條件下生長能降低烤煙煙葉亞硝胺的反硝化細菌的培養方法，其特征在于如下步驟 a、制備一級種子取保藏號為CCTCCNO :M2011074的惡臭假單胞菌T2-2斜面種子在在LB培養基平板上劃線，置28°C培養箱培養12hz至出現游離單菌落，得到一級種子； b、制備二級種子液用接種環取一環步驟a的一級種子，接種于裝有50mL的LB液體培養基的250mL搖瓶中，培養溫度為28°C，搖床轉速為180rpm，培養時間為12h，使OD6tltl至.2.0，得到二級種子液； C、發酵培養取步驟b的二級種子液以V/V計為0. 5 3. 0%的接種量接入裝有20 .40mL發酵培養基的250mL搖瓶中進行發酵培養，控制搖床溫度為26 30°C，轉速為160 .200rpm,起始pH為6. 8 7. 6，發酵周期為36 60h，得到惡臭假單胞菌； 其中 所述的發酵培養基成分及配制方法如下蛋白胨8. 0 5. Og/L，酵母提取物3. 0 .8. Og/L,氯化鈉8. 0 15. Og/L,瓊脂15 20g/L ;補充蒸懼水至IL ;滅菌前調pH至7. 0 .8.0 ;在121°C高壓蒸汽下滅菌20min。
3.權利要求I所述的菌株在降解烤煙煙葉亞硝胺中的應用。
全文摘要
本發明屬于微生物技術領域，公開了一株降低煙草特有亞硝胺(TSNA)的菌株篩選及其應用。本發明分離的細菌為惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)T2-2，其保藏號為CCTCC NOM2011074。本發明的主要特征是，從大量烤煙煙葉表面細菌中篩選出一株能夠明顯降低煙草特有亞硝胺含量的菌株——惡臭假單胞菌T2-2，通過液體發酵擴大培養后，T2-2菌懸液噴施于上部烤煙煙葉表面處理，煙葉中TSNA中的關鍵組分NNN和NNK，分別下降NNN 28.33％和NNK 57.83％。
文檔編號A24B15/20GK102732440SQ201110090798
公開日2012年10月17日 申請日期2011年4月12日 優先權日2011年4月12日
發明者何結望, 冀志霞, 吳風光, 孫政, 李丹, 李琳, 陳守文 申請人:華中農業大學