定點突變獲得的惡臭假單胞菌腈水解酶突變株及其構建方法
【專利摘要】本發明提供了一種高酶活腈水解酶突變株及其制備方法，屬于基因工程領域。本發明以惡臭假單胞菌（PseudomonasputidaCGMCC3830）腈水解酶作為模板，再用分子生物學手段對惡臭假單胞菌腈水解酶序列進行飽和定點突變，獲得兩株酶活提高的陽性轉化子Asn40Gly和Phe50Trp，在此基礎上進行組合突變，獲得組合突變和株Asn40Gly-Phe50Trp。在改造條件下，發現酶活均有所提高，并且熱穩定性也有所改善。利用此策略可以大大提高腈水解酶的轉化能力，使其應用于醫藥中間體、食品添加劑以及環境治理方面具有廣闊的應用前景。
【專利說明】定點突變獲得的惡臭假單胞菌腈水解酶突變株及其構建方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于基因工程領域，具體涉及酶活提高的惡臭假單胞菌腈水解酶突變株及其構建方法。
【背景技術】
[0002]腈水解酶是一類能將腈化合物一步水解生成羧酸和氨的催化劑，其立體選擇性和區域選擇性可用于解決化學工藝中手性催化和區域催化效率低的問題。腈水解酶來源廣泛、反應條件溫和、特異性高、選擇性強，在有機合成領域具有潛在的應用價值。然而，腈水解酶在應用中仍然存在諸多局限，如，比酶活偏低、穩定性較差、底物譜較窄等。因此，獲得一株酶活提高的腈水解酶具有重要的工業應用價值。
[0003]在本研究中，我們首先通過生物信息學手段對高酶活的腈水解酶基因進行序列比對，找出活性中心附近的一些潛在的關鍵位點，再對這些位點進行飽和突變，構建突變文庫，選擇合適的載體和宿主進行表達，高通量篩選出酶活較高的突變株。再以此突變株為模板，進行下一步的組合突變，直至達到預期的要求。
[0004]在前期工作中，發明人已成功將惡臭假單胞菌腈水解酶在大腸桿菌中高效表達。本發明以大腸桿菌作為宿主菌株、利用半理性設計改造的方法，以期獲得酶活力得到顯著提高的惡臭假單胞菌腈水解酶突變株。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于，通過基因工程手段對惡臭假單胞菌腈水解酶基因進行飽和突變改造，使改造后的腈水解酶的酶活性有所提高，最終能達到工業化生產的要求。
[0006]本發明提供惡臭假單胞菌putida CGMCC3830)腈水解酶一種定點飽和突變改造的腈水解酶突變株，所述的腈水解酶突變株具有更好的催化活力。該菌株于2010年5月11日保藏于北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.3830，分類命名為惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)。
[0007]本發明提供了一種定點飽和突變改造的惡臭假單胞菌腈水解酶突變體，由惡臭假單胞菌putida CGMCC3830)腈水解酶基因出發，通過定點飽和突變、構建突變體庫而篩選獲得；所述的腈水解酶的成熟蛋白的氨基酸序列為SEQ ID N0.2;對應的腈水解酶基因序列SEQ ID N0.1 ;所述的腈水解酶突變體的成熟蛋白的氨基酸序列為SEQ IDN0.3、SEQ ID N0.4或SEQ ID N0.5均由370個氨基酸組成。
[0008]本發明所述的腈水解酶突變株，是在惡臭假單胞菌基因上進行飽和突變得到，主要是突變位點在第40位的天冬酰胺和第50位的苯丙氨酸。
[0009]能表達生產所述腈水解酶突變體的細胞系或基因工程菌也為本專利要求保護的范圍。
[0010]本發明提供了一種腈水解酶突變體的制備方法，以SEQ ID N0.1所示的序列出發，將確定突變的氨基酸即第40位的天冬酰胺和第50位的苯丙氨酸所對應的核苷酸以NNN代替原有密碼子，設計簡并引物，進行全質粒PCR反應，構建定點飽和突變PCR產物，反應結束后，用Dpn I消化原始模板,割膠回收,純化PCR產物,熱擊倒入大腸桿菌Rosetta-gami(DE3)感受態中，涂布于含有卡娜霉素和氯霉素的LB平板上篩選陽性克隆，得到飽和突變庫，篩選出酶活力提高的突變體，所述的腈水解酶突變體為Asn40Gly和Phe50Trp。
[0011]以Asn40Gly作為突變模板，以Phe50Trp突變體的引物作為引物，組合突變，得到酶活力提高的腈水解酶組合突變體ASn40Gly-Phe50Trp。
[0012]本發明提供的腈水解酶突變體酶活力高，應用于醫藥中間體、食品添加劑以及環境治理方面具有廣闊的應用前景。
[0013]
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1腈水解酶突變體酶活力檢測圖2腈水解酶突變體最適宜pH檢測。
[0015]圖3腈水解酶突變體的熱穩定。
[0016]本發明的優點和有益效果
通過定點飽和突變，對惡臭假單胞菌(AeWOrOfflmas putida CGMCC3830)腈水解酶活性中心周邊的第40位的天冬酰胺和第50位的苯丙氨酸進行改造，獲得的腈水解酶突變株，在酶活和熱穩定性上有所提聞，這樣提聞了生廣效率。本發明所獲得的突變株分別是Asn40Gly, Phe50Trp 和 Asn40Gly_Phe50Trp，酶活均有所提高，其中 Asn40Gly_Phe50Trp 酶活提高50%，在50°C下熱穩定性提高31%。改造后腈水解酶突變株在醫藥中間體、食品添加劑以及環境治理方面具有廣闊的應用前景。
[0017]
【具體實施方式】
[0018]上述酶活提高的腈水解酶突變株的構建方法，包括以下步驟:
I)惡臭假單胞菌putida CGMCC3830)腈水解酶工程菌的構建對惡臭假單胞菌腈水解酶基因通過上游引物和下游引物擴增目的基因:
上游引物:5’ -CCGGAATTCATGGTTACGTACACGAATAAGTTCA-3’，帶下劃線堿基為限制性內切酶EcoR I識別位點；
下游引物:5’ -CCCAAGCTTGACCGGGGACTTCCAAGCTATACGTT-3’，帶下劃線堿基為限制性內切酶Hind III識別位點；
以惡臭假單胞菌基因組作為模板，在上下游引物參與進行PCR反應，PCR條件為94°C預變性4 min;94°C變性30 s，58°C退火30 s，72°C延伸90 S，30個循環；72°C終延伸10 min。獲得目的片段，割膠回收目的片段。與質粒PMD-19T進行連接，將連接產物轉化到大腸桿菌JM109感受態細胞中，將轉化細胞涂布到含有100 ug/ml氨芐LB平板上，篩選出陽性克隆，提取質粒，用限制性內切酶進行雙酶切后與經同樣酶雙酶切的質粒pET-28a進行連接，將轉化產物轉化到大腸桿菌Rosetta-gami (DE3)感受態細胞中，將轉化細胞涂布于含有50ug/ml卡娜霉素和25 ug/ml氯霉素的LB平板上篩選陽性克隆，得到重組質粒。
[0019]2)惡臭假單胞菌腈水解酶氨基酸序列的分析及飽和突變位點的確定
對惡臭假單胞菌腈水解酶氨基酸序列與其它的腈水解酶序列進行比對分析，腈水解酶的催化活性位點分別是第48位的谷氨酸、第131位的賴氨酸和第165位的半胱氨酸，找出活性位點周邊差異性比較大的位點:第40位的天冬酰胺和第50位的苯丙氨酸。
[0020]3)根據選取的位點進行飽和突變庫的建立及突變體的篩選
以連有目的片段的重組質粒作為模板，分別對第40位的天冬酰胺和50位的苯丙氨酸進行飽和突變，即對40位和50位氨基酸對應的核苷酸處利用NNK代替原有密碼子，設計簡并引物，進行全質粒PCR反應。
[0021]飽和突變引物序列如下:
【權利要求】
1.具有更高催化活力的一株腈水解酶突變株的氨基酸序列，其特征在于如SEQID N0.3所示惡臭假單胞菌腈水解酶氨基酸序列中活性中心周邊的40位的天冬酰胺突變為甘氨酸: 1METValThrTyrThrAsnLysPheLysAlaAlaThrValGlnAlaGluProValTrpPhe 21AspAlaAlaAlaThrValGluLysThrIIeGlyLeuIIeLysGluAlaAlaAspAsnGly 41AlaGlnIIeIleAlaPheProGluValPhelIeProGlyTyrProTyrHisiIeTrpLeu 61AspSerProPheAlaGlyMETGlyLysPheAlaThrArgTyrHisGluGlnSerLeuSer 81IIeAspSerProLeuIIeThrArgIIeGlnGluAlaAlaGluSerAsnAsnIIeCysVal 101VallleGlyPheSerGluArgAspGlyGlySerLeuTyrMETSerGlnLeuIlelleAsp 121GluLysGlyLysIIeValAlaHisArgArgLysLeuLysProThrHisValGluArgThr 141ValTyrGlyGluGlyAspGlySerAspIIeAlaValHisAspMETProIIeGlyArgVal 161GlyAlaLeuAsnCysTrpGluHisPheGlnThrProThrLysTyrAlaMETTyrAlaMET 181HisGluGlnValHisileAlaAlaTrpProGlyMETSerLeuTyrGlnProGluValPhe 201AlaPheSerSerGluAlaGlnLeuValAlaThrGlnMETTyrAlaMETGluGlyGlnThr 221PheValLeuCysSerThrGlnValValGlyLysAlaAlaLeuGluPhePheCysGluAsn 241GluMETHisLysLysLeuIIeGlyTyrGlyGlyGlyPheAlaGlnIIePheGlyProAsp 261GlyArgProLeuAlaGluArgLeuProAlaAspGlyGluGlyIIeLeuTyrAlaGluIIe 281AspLeuAlaGlnIIeThrMETAlaLysGlnAlaAlaAspProValGlyHisTyrSerArg 301ProAspValPheSerLeuGlnPheAsnAsnGlnAlaGlnSerProValLysArgLeuLys 321AspMETGlyLysHisileGluSerGluGluValPheSerSerIIeSerGlnGlyThrVal 341ProGlyLeuThrTyrSerLeuGluValProGlyProPheLeuGlnLysSerLeuAlaGln 361PheGluProValLysValHisGluGluSer。
2.具有更高催化活力的一株腈水解酶突變株的氨基酸序列，其特征在于如SEQID N0.4所示惡臭假單胞菌腈水解酶氨基酸序列中活性中心周邊的50位的苯丙氨酸突變為色氨酸: 1METValThrTyrThrAsnLysPheLysAlaAlaThrValGlnAlaGluProValTrpPhe 21AspAlaAlaAlaThrValGluLysThrIIeGlyLeuIIeLysGluAlaAlaAspAsnAsn 41AlaGlnIIeIleAlaPheProGluValTrpIIeProGlyTyrProTyrHisiIeTrpLeu 61AspSerProPheAlaGlyMETGlyLysPheAlaThrArgTyrHisGluGlnSerLeuSer 81IIeAspSerProLeuIIeThrArgIIeGlnGluAlaAlaGluSerAsnAsnIIeCysVal 101VallleGlyPheSerGluArgAspGlyGlySerLeuTyrMETSerGlnLeuIlelleAsp 121GluLysGlyLysIIeValAlaHisArgArgLysLeuLysProThrHisValGluArgThr 141ValTyrGlyGluGlyAspGlySerAspIIeAlaValHisAspMETProIIeGlyArgVal 161GlyAlaLeuAsnCysTrpGluHisPheGlnThrProThrLysTyrAlaMETTyrAlaMET 181HisGluGlnValHisileAlaAlaTrpProGlyMETSerLeuTyrGlnProGluValPhe 201AlaPheSerSerGluAlaGlnLeuValAlaThrGlnMETTyrAlaMETGluGlyGlnThr 221PheValLeuCysSerThrGlnValValGlyLysAlaAlaLeuGluPhePheCysGluAsn 241GluMETHisLysLysLeuIIeGlyTyrGlyGlyGlyPheAlaGlnIIePheGlyProAsp 261GlyArgProLeuAlaGluArgLeuProAlaAspGlyGluGlyIIeLeuTyrAlaGluIIe281AspLeuAlaGlnIIeThrMETAlaLysGlnAlaAlaAspProValGlyHisTyrSerArg 301ProAspValPheSerLeuGlnPheAsnAsnGlnAlaGlnSerProValLysArgLeuLys 321AspMETGlyLysHisileGluSerGluGluValPheSerSerIIeSerGlnGlyThrVal 341ProGlyLeuThrTyrSerLeuGluValProGlyProPheLeuGlnLysSerLeuAlaGln 361PheGluProValLysValHisGluGluSer。
3.具有更高催化活力的一株腈水解酶突變株的氨基酸序列，其特征在于如SEQ ID N0.5所示惡臭假單胞菌腈水解酶氨基酸序列中活性中心周邊的40位的天冬酰胺突變為甘氨酸和50位的苯丙酰胺突變為色氨酸: IMETValThrTyrThrAsnLysPheLysAlaAlaThrValGlnAlaGluProValTrpPhe 21AspAlaAlaAlaThrValGluLysThrIIeGlyLeuIIeLysGluAlaAlaAspAsnGly 41AlaGlnIIeIleAlaPheProGluValTrpIIeProGlyTyrProTyrHisiIeTrpLeu 61AspSerProPheAlaGlyMETGlyLysPheAlaThrArgTyrHisGluGlnSerLeuSer 81IIeAspSerProLeuIIeThrArgIIeGlnGluAlaAlaGluSerAsnAsnIIeCysVal 101VallleGlyPheSerGluArgAspGlyGlySerLeuTyrMETSerGlnLeuIlelleAsp 121GluLysGlyLysIIeValAlaHisArgArgLysLeuLysProThrHisValGluArgThr 141ValTyrGlyGluGlyAspGlySerAspIIeAlaValHisAspMETProIIeGlyArgVal 161GlyAlaLeuAsnCysTrpGluHisPheGlnThrProThrLysTyrAlaMETTyrAlaMET 181HisGluGlnValHisileAlaAlaTrpProGlyMETSerLeuTyrGlnProGluValPhe 201AlaPheSerSerGluAlaGlnLeuValAlaThrGlnMETTyrAlaMETGluGlyGlnThr 221PheValLeuCysSerThrGlnValValGlyLysAlaAlaLeuGluPhePheCysGluAsn 241GluMETHisLysLysLeuIIeGlyTyrGlyGlyGlyPheAlaGlnIIePheGlyProAsp 261GlyArgProLeuAlaGluArgLeuProAlaAspGlyGluGlyIIeLeuTyrAlaGluIIe 281AspLeuAlaGlnIIeThrMETAlaLysGlnAlaAlaAspProValGlyHisTyrSerArg 301ProAspValPheSerLeuGlnPheAsnAsnGlnAlaGlnSerProValLysArgLeuLys 321AspMETGlyLysHisileGluSerGluGluValPheSerSerIIeSerGlnGlyThrVal 341ProGlyLeuThrTyrSerLeuGluValProGlyProPheLeuGlnLysSerLeuAlaGln 361PheGluProValLysValHisGluGluSer。
【文檔編號】C12N15/60GK104130998SQ201410244226
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年6月5日 優先權日:2014年6月5日
【發明者】龔勁松, 熊雷, 許正宏, 李恒, 史勁松, 孫文敬, 周強 申請人:江南大學, 江西省德興市百勤異Vc鈉有限公司