專利名稱：：一種惡臭假單胞菌株及其在制備羥基乙酸中的應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種惡臭假單胞菌株，以及酶法制備羥基乙酸的方法。
背景技術：
：羥基乙酸(乙醇酸)是一種重要的中間體，廣泛用于日用品、工業清洗劑、聚合物的單體及醫藥領域等。傳統制備羥基乙酸的方法是通過化學合成，但通常化學合成需要高溫、高壓，且純度難以滿足需求。目前工藝較為成熟的化學法制備羥基乙酸的方法主要有氯乙酸堿性水解法。但該方法存在的缺陷是反應效率低、產物容易產生聚酯或者交酯等問題。生物法制備羥基乙酸受到普遍關注，主要有腈水解酶水解羥基乙腈法和乙二醇不對稱氧化法。這些方法所使用的原料羥基乙腈和乙二醇都較貴，且羥基乙腈和制備過程中使用的氫氰酸都是劇毒品，因此用來生產羥基乙酸具有一定的限制。鹵代乙酸脫鹵酶是一類可以水解氯乙酸的酶，該酶來源廣泛，已經在假單胞菌屬、根瘤菌屬、伯克霍爾德菌屬等發現。鹵代乙酸脫鹵酶目前主要用于污水或工業廢水中的氯乙酸的環境治理，至今沒有人用來生產制備羥基乙酸。因此開發從氯乙酸酶法制備羥基乙酸的方法，一方面可以在治理環境中變廢為寶，也可以用來直接以氯乙酸為原料制備羥基乙酸。
發明內容本發明所解決的技術問題是提供一種新的惡臭假單胞菌株及其在制備羥基乙酸中的應用。發明人首次分離純化到一株能快速降解氯乙酸的菌株。經過16SrRNA和生理生化鑒定，該菌株為惡臭假單胞菌(pseudomonasputida)，命名為惡臭假單胞菌CA15(pseudomonasputidaCA15)。該菌株保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏日期為2009年9月7日，保藏號為CGMCCNo.3267。本發明解決其技術問題所采取的技術方案是該菌株為惡臭假單胞菌株CA15，菌種保藏號為CGMCCNo.3267。本發明的惡臭假單胞菌株CA15為生物催化劑的應用，以用于制備羥基乙酸。本發明使用惡臭假單胞菌株CA15制備羥基乙酸的方法是主要包括如下步驟(1)添加誘導劑對惡臭假單胞菌CA15進行誘導培養，離心獲得細胞或者在獲得細胞后進一步經過破胞提取粗酶；(2)以獲得的靜息細胞或者粗酶液為催化劑，在緩沖溶液中添加氯乙酸鹽作為底物進行反應，然后從反應液中收集羥基乙酸。進一步地，本發明在步驟(1)中，所述誘導培養的培養條件如下所述誘導劑為1070mM的氯乙酸鈉；培養溫度為2050°C。進一步地，本發明所述培養溫度為2540°C。進一步地，本發明在進行誘導培養時還添加輔助碳源，所述輔助碳源為0.510g/L的蔗糖或甘油。進一步地，本發明在步驟(2)中，所述緩沖溶液的pH為5ll，反應溫度為2050°C。進一步地，本發明所述緩沖溶液的pH為8IO，反應溫度為2535°C。本發明的惡臭假單胞菌CA15(pseudomonasputidaCA15)在發酵培養基中添加誘導劑氯乙酸鈉誘導培養，離心獲得細胞或者進一步經過破胞提取粗酶。以獲得的靜息細胞或者破胞粗酶液為催化劑，在緩沖溶液中，通過一次或多次添加氯乙酸鈉，然后從反應液中收集羥基乙酸。與現有技術相比，本發明的優點有(1)采用新的酶法，水解氯乙酸獲得羥基乙酸，在環境治理中，可以變廢為寶。(2)相比于化學堿性水解氯乙酸制備羥基乙酸，本發明工藝簡單，反應條件溫和，且產物純度高，可以達99%以上，滿足大多數的醫藥需求。(3)發明所使用的原料氯乙酸相比于羥基乙腈，價格較低，來源廣泛，具有較大的經濟價值。(4)惡臭假單胞菌CA15具有較強的脫鹵能力，制得的粗酶活力高。圖1是羥基乙酸和氯乙酸的高效液相分析的標準譜圖；實驗分析條件如下Agilent1100系統，有機酸分析柱Bio-RadHPX-87H(30cmX7.8mm)，流動相為5mM硫酸水溶液，流速為0.6ml/min，室溫下測定紫外(UV)210nm下吸收值；氯乙酸和羥基乙酸在此條件下的保留時間分別為15.392min和12.154min。圖2是底物為不同氯乙酸鈉濃度時的酶活圖。圖3是反應產物的高效液相譜圖；分析條件同圖1的條件，其出峰時間為12.156min，與羥基乙酸的出峰時間相同。生物材料樣品的保藏信息保藏的生物材料樣品惡臭假單胞菌CA15(pseudomonasputidaCA15);保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC);保藏單位地址北京市朝陽區北辰西路1號院中國科學院微生物研究所(郵編100101);保藏日期2009年9月7日；保藏登記號CGMCCNo.326具體實施例方式本發明采用的酶活力單位定義為每分鐘水解氯乙酸產生lPmol羥基乙酸所需要的酶量。本發明采用的種子培養基組成3.2g的十二水磷酸氫二鈉，1.5g的磷酸二氫鉀，0.0980.2g的硫酸鎂，0.20.5g的酵母抽提物，0.51.0g的硫酸銨，加水至1L，滅菌。本發明采用的發酵培養基組成在種子培養基基礎上，添加通過過濾滅菌的誘導劑，或者為提高產酶量，進一步添加輔助碳源。氯乙酸和羥基乙酸的分析方法見附圖1。[OO37](—)菌種篩選及鑒定本發明從垃圾場附近土壤、許多含氯化合物的化工廠附近土壤或活性淤泥共8處土壤，在種子培養基中，添加30mM氯乙酸為唯一碳源富集培養，通過稀釋培養挑取單菌落至96深孔板中，培養24h后測定氯離子含量，挑取脫氯能力較強的進行復篩，提取粗酶檢測活性并驗證脫鹵產物，最后挑取并通過16SrRNA和生理生化實驗鑒定該菌株為惡臭假單胞菌株Pseudomonasputida命名為惡臭假單胞菌CA15。[OO39](二)脫鹵酶菌株的培養條件的確定培養溫度的確定在含有80ml的種子培養基的250ml的搖瓶中，添加30mM的氯乙酸鈉為誘導劑，在溫度分別為2(TC、25t:、3(rC、4(rC或5(rC條件下振蕩培養24h，測定酶活。結果顯示，3(TC時的酶活為177.8U/L，2(TC、25t:、4(rC、5(rC下的活性分別對應為30°C時的酶活的22%、65%、78%、50%，因此較佳的培養溫度為2540°C。誘導劑濃度的確定在含有80ml的種子培養基的250ml的搖瓶中，分別添加10mM、20mM、30mM、50mM、70mM的氯乙酸鈉為誘導劑，3(TC下培養24h，測定0D550考察細菌的生長過程和測定酶活考察最終的產酶量，發現以10mM及20mM的氯乙酸鈉為誘導劑時，細胞較早的進入凋亡期，酶活分別為30mM誘導劑濃度時的產生的酶活(由上可知，其中30mM的氯乙酸鈉的酶活為177.8U/L)的34%和47%;當誘導劑濃度為3050mM的氯乙酸鈉時，菌體生長相差不大，50mM的氯乙酸鈉為誘導劑所產的酶是30mM的誘導劑濃度時產生的酶活的93%;誘導劑濃度為70mM時的所得到菌體的最大0D550值為30mM時的最大0D550的70%。因此較佳的誘導劑濃度為3050mM。輔助碳源的影響在含有80ml的種子培養基的250ml的搖瓶中，添加30mM的氯乙酸鈉為誘導劑的基礎上，繼續添加10g/L蔗糖、10g/L葡萄糖或10g/L甘油為輔助碳源。3(TC下振蕩培養24h，結果如表1。如從表1中所示添加蔗糖所產生的酶活是不添加輔助碳源時的酶活的1.5倍。表1:輔助碳源種類對酶活及菌體it的影響輔助碳源OD550酶活U/L葡萄糖2.826.9蔗糖0.991268.9甘油2.40341.1不加輔助碳源0.999177.8輔助碳源濃度的影響在含有80ml的種子培養基的250ml的搖瓶中，添加30mM的氯乙酸鈉為誘導劑，繼續添加如表2所示的不同濃度的蔗糖或甘油。從表2可得以0.5g/L的甘油、10g/L或5g/L的蔗糖為輔助碳源時，所產的酶活均超過450U/L。而以5g/L的蔗糖為輔助碳源時所產的菌體量和酶活相對最高。表2:輔助碳源濃度對酶活及菌體量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(三)利用靜息細胞為催化劑水解氯乙酸在250ml搖瓶內，含有80ml的種子培養基的250ml的搖瓶中，添加30mM的氯乙酸鈉為誘導劑基礎上，繼續添加5g/L蔗糖，3(TC培養24h后，在離心力為4000g的條件下離心收集細胞，用0.lmol的pH7.5的10.0的磷酸緩沖溶液分別清洗及離心兩次，獲得細胞。取培養后所獲的靜息細胞，以每克濕細胞添加10ml的0.lmol的pH10.0的甘氨酸/氫氧化鈉緩沖溶液的量溶解并混勻，在細胞懸液中添加30mM氯乙酸鈉為底物，在3(TC振蕩反應，反應5h時，底物剛好反應完全，羥基乙酸濃度為12.3mM。取培養后所獲的靜息細胞，細胞以每克濕細胞添加10ml的O.lmol的pH10.0的甘氨酸/氫氧化鈉緩沖溶液的量溶解并混勻，在細胞懸液中添加30mM的氯乙酸鈉為底物，在2(TC振蕩反應12h時，底物剛好反應完全，此時的羥基乙酸濃度為6.2mM。取培養后所獲的靜息細胞，細胞以每克濕細胞添加10ml的0.lmol的pH9.0的甘氨酸/氫氧化鈉緩沖溶液的量溶解并混勻，在細胞懸液中添加30mM的氯乙酸鈉為底物，30。C振蕩反應5h時，底物消耗了26.lmM，此時的羥基乙酸濃度為9.3mM。取培養后所獲的靜息細胞，細胞以每克濕細胞添加10ml的0.lmol的pH8.0的磷酸緩沖溶液的量溶解并混勻，在細胞懸液中添加50mM的底物，3(TC振蕩反應，5h時，底物消耗了20mM，此時的羥基乙酸濃度為10.8mM。取培養后所獲的靜息細胞，細胞以每克濕細胞添加10ml的0.lmol的pH10.0的甘氨酸/氫氧化鈉緩沖溶液的量溶解并混勻，在細胞懸液中添加110mM的氯乙酸鈉為底物，在3(TC振蕩反應12h時，底物剛好反應完全，此時的羥基乙酸濃度為40.7mM。取培養后所獲的靜息細胞，細胞以每克濕細胞添加10ml的0.lmol的pH10.0的甘氨酸/氫氧化鈉緩沖溶液的量溶解并混勻，在細胞懸液中添加110mM的氯乙酸鈉為底物，在5(TC振蕩反應8h時，底物剛好反應完全，此時的羥基乙酸濃度為30.2mM。取培養后所獲的細胞，細胞以每克濕細胞添加10ml的0.lmol的pH10.0的甘氨酸6/氫氧化鈉緩沖溶液的量溶解并混勻，在細胞懸液中添加llOmM的氯乙酸鈉為底物，在35°C振蕩反應9h時，底物剛好反應完全，此時的羥基乙酸濃度為37.7mM。取培養后所獲的細胞，細胞以每克濕細胞添加10ml的0.lmol的pH5.0的乙酸/氫氧化鈉緩沖溶液的量溶解并混勻，在細胞懸液中添加30mM的氯乙酸鈉為底物，在3(TC振蕩反應12h時，底物消耗了3.2mM，此時的羥基乙酸濃度為2.lmM。(四)利用粗酶為催化劑水解氯乙酸制備羥基乙酸在250ml搖瓶內，含有80ml的種子培養基的250ml的搖瓶中，添加30mM的氯乙酸鈉為誘導劑的基礎上，繼續添加5g/L蔗糖，3(TC培養24h后，在離心力為4000g的條件下離心收集細胞，再用O.lmol的pH7.5的磷酸緩沖溶液清洗及離心兩次，獲得細胞。以每克濕細胞添加10ml的0.02M的pH7.5的Tris-硫酸緩沖溶液中，400kHz的超聲頻率，超聲10min，4。C下以12000g的離心力離心20min，取上清液為粗酶。以該粗酶為催化劑，考察底物濃度的影B向，具體過程如下取1ml的粗酶液，分別添加底物濃度為10mM、30mM、50mM、70mM、90mM或llOmM的氯乙酸鈉，繼續添加水至2ml的反應體系，3(TC振蕩反應0.5h，添加200ul的10X硝酸沉淀所有的蛋白質以終止反應，HPLC檢測產物的量，作底物與對應的初始速率的圖，如圖2。從圖2中可得，當底物濃度超過30mM時，初始速率隨底物濃度升高反而下降，因此較佳的底物濃度為30mM。緩沖溶液pH值和反應溫度的確定配制兩組不同pH緩沖溶液的反應體系，每組體系的配制方法如下，取lml的上述提取的粗酶，分別添加500ul的pH5、6、7、8、9、9.5、10或11的緩沖溶液，其中一組添加直接30mM的氯乙酸鈉為底物，分別在20°C、25°C、30°C、35°C、40°C、50°C下測定其酶活，另一組預先在20°C、25°C、30°C、35°C、40°C、50°C對應的溫度下放置24h后，再分別添加30mM的氯乙酸鈉為底物，并加水至2ml，然后在各自對應的溫度下測定其殘余酶活，數據見表3。從表3可見，雖然在各種pH條件下，溫度為50°C時的酶活最高，但是放置24h后殘余酶活幾乎為零。而溫度為25t:35t:雖然活性并不是最高，但是放置24h后殘余酶活較高，于是綜合考慮活性及穩定性，較佳的pH和溫度分別為8.010.0和25°C35°C。表3:緩沖溶液pH值和反應溫度對酶活的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(注表3中的"前"指酶不經過預先放置而直接進行反應，"后"指酶先預先放置24h后再測定酶活。)—次性添加底物法制備羥基乙酸取上述所提取的粗酶10ml，添加50mM的氯乙酸鈉為底物，添加5ml的0.2mol的pH10.0的甘氨酸/氫氧化鈉緩沖溶液，繼續加水至總體積為20ml，3(TC振蕩反應12h，添加2ml的10%硫酸沉淀蛋白，HPLC檢測分析結果如見圖3，從圖中可見，反應產物中只有羥基乙酸，沒有其他雜質。該產物的濃度為49.7mM，產率達99.4%。多次添加底物法制備羥基乙酸先取上述所提取的粗酶50ml，置250mlpH可控的搖瓶(NCBIOsHpH-6，上海國強)中，添加25ml的0.2mol的pH10.0的甘氨酸/氫氧化鈉緩沖溶液，在3(TC振蕩反應，初始底物為30mM的氯乙酸鈉，每個半小時取樣，并通過HPLC檢領"當底物濃度低于15mM時，添加15mM的底物使其繼續反應，經過15h，中間共添加8次，最后得到羥基乙酸濃度為148mM，回收率為98%以上，純度為99%以上。權利要求一種惡臭假單胞菌株，其特征是該菌株命名為惡臭假單胞菌株CA15，菌種保藏號為CGMCCNo.3267。2.—種權利要求1的惡臭假單胞菌株作為生物催化劑的應用，其特征是該惡臭假單胞菌用于制備羥基乙酸。3.—種使用權利要求l的惡臭假單胞菌株制備羥基乙酸的方法，其特征是包括如下步驟(1)添加誘導劑對惡臭假單胞菌CA15進行誘導培養，離心獲得細胞或者在獲得細胞后進一步經過破胞提取粗酶；(2)以獲得的靜息細胞或者粗酶液為催化劑，在緩沖溶液中添加氯乙酸鹽作為底物進行反應，然后從反應液中收集羥基乙酸。4.如權利要求3所述的制備羥基乙酸的方法，其特征是在步驟(1)中，所述誘導培養的培養條件如下所述誘導劑為1070mM的氯乙酸鈉；培養溫度為2050°C。5.如權利要求4所述的制備羥基乙酸的方法，其特征是所述培養溫度為2540°C。6.如權利要求3或4所述的制備羥基乙酸的方法，其特征是在進行誘導培養時還添加輔助碳源，所述輔助碳源為0.510g/L的蔗糖或甘油。7.如權利要求3或4所述的制備羥基乙酸的方法，其特征是在步驟(2)中，所述緩沖溶液的pH為5ll，反應溫度為2050°C。8.如權利要求7所述的制備羥基乙酸的方法，其特征是所述緩沖溶液的pH為810，反應溫度為2535°C。全文摘要本發明公開了一種惡臭假單胞菌株及其在制備羥基乙酸中的應用，該菌株命名為惡臭假單胞菌株CA15，可用于制備羥基乙酸。本發明使用惡臭假單胞菌株CA15制備羥基乙酸的方法主要包括如下步驟添加誘導劑對惡臭假單胞菌CA15進行誘導培養，離心獲得細胞或者在獲得細胞后進一步經過破胞提取粗酶；以獲得的靜息細胞或者粗酶液為催化劑，在緩沖溶液中添加氯乙酸鹽作為底物進行反應，然后從反應液中收集羥基乙酸。本發明得到的產物羥基乙酸的轉化率在99％以上，純度可達99％以上。本發明方法具有反應條件溫和、無污染且工藝簡單等顯著特點。文檔編號C12P7/42GK101705196SQ20091015412公開日2010年5月12日申請日期2009年11月5日優先權日2009年11月5日發明者吳堅平,徐剛,楊立榮,林春嬌申請人:浙江大學