食品中鯊魚成分的實時熒光pcr檢測方法和試劑盒的制作方法

專利名稱：食品中鯊魚成分的實時熒光pcr檢測方法和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學和核酸檢測技術領域。具體地，本發明涉及食品中鯊魚成分的實時熒光PCR檢測方法和試劑盒。
背景技術：
鯊魚指軟骨魚綱板鰓亞綱鯊魚總目的魚類。鯊魚不但在維持海洋生態平衡方面起著重要作用，而且是對人類十分有益的經濟魚類。鯊魚鰭加工制成的魚翅是價值較高的海產品之一，研究報道其富含膠原蛋白，有預防骨骼老化，防癌抗癌，滋補養顏、延年益壽等功效。鯊魚軟骨中提取的鯊魚硫酸軟骨素不僅能降低血脂，防治冠心病和心肌梗塞等心血管疾病，而且還常用作保護關節的膳食補充劑。鯊魚肝中提煉的鯊魚肝油富含多種維生素和多不飽和脂肪酸，是最理想的保健營養品。然而，一些不法商販為追求巨大的經濟利益，將不含真魚翅成分的假魚翅標成真魚翅出售，將其他動物成分加工成的硫酸軟骨素標注成鯊魚硫酸軟骨素混入市場，極大地擾亂了市場秩序，侵害了消費者的合法權益，影響了國際貿易。為保證進出口產品質量和進出口貿易的順暢流通，必須建立鯊魚類產品中鯊魚源性成分的真實性鑒別方法。國外對鯊魚類產品的研究主要集中在魚翅的鯊魚種屬來源鑒定、魚翅貿易引起的世界范圍內鯊魚種類和數量的變化、世界范圍內魚翅貿易的監控和管理方以及鯊魚硫酸軟骨素和鯊魚肝油的生理保健功能和療效等。國內對鯊魚產品的研究主要有魚翅營養成分的提取和定量分析、魚翅的加工工藝和仿魚翅的研制以及鯊魚硫酸軟骨素的提取優化和含量測定。目前，國內外對食品中鯊魚源性成分真實性的鑒定方法研究都還很少，因此迫切需要開發有效的鑒定方法，以規范市場，保護消費者權益。

發明內容
本發明的目的在于提供食品中鯊魚成分的實時熒光PCR檢測方法和試劑盒。在本發明的第一方面，提供一種鑒定鯊魚成分的方法，所述方法包括以待測樣品的DNA為模板，以SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的引物進行PCR 擴增；若發生特異性擴增，則表明待測樣品中包含鯊魚成分。在一個優選例中，所述的選自(但不限于)狗鯊；加勒比斜鋸牙鯊；鼠鯊；大青鯊；澳洲半沙條鯊；路氏雙髻鯊；尖吻斜鋸牙鯊；尖吻鯖鯊；舒氏星鯊。在另一優選例中，所述的PCR是STOR Green實時熒光PCR。在另一優選例中，所述的待測樣品是食品。在另一優選例中，所述方法的檢測靈敏度為10_4ng/y L DNA。在本發明的另一方面，提供一種引物，所述引物是引物對，其序列如SEQID NO 1 和 SEQ ID NO 2 所示。在本發明的另一方面，提供所述的引物的用途，用于從待測樣品中鑒定鯊魚成分。
在本發明的另一方面，提供一種鑒定鯊魚成分的試劑盒，其中包括所述的引物。在另一優選例中，所述試劑盒中還包括含有鯊魚成分的檢測標準品(如鯊魚陽性對照質粒)。在另一優選例中，所述試劑盒中還包括選自以下的試劑DNA提取試劑(或試劑盒)，PCR 緩沖液，DNA 聚合酶，STOY Green Pre Mix。在另一優選例中，所述的試劑盒中還包括說明鑒定鯊魚成分的方法的使用說明書。本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1、鯊魚DNA的STOR Green實時熒光PCR(SG-PCR)擴增曲線。圖中曲線按箭頭處從左到右依次為1 鯊魚陽性對照質粒；2 狗鯊；3 加勒比斜鋸牙鯊；4 鼠鯊；5 大青鯊；6 澳洲半沙條鯊；7 路氏雙髻鯊；8 尖吻斜鋸牙鯊；9 尖吻鯖鯊；10 舒氏星鯊。 圖2、鯊魚DNA的SG-PCR溶解曲線。箭頭所指曲線為鯊魚陽性對照質粒的PCR溶解曲線。該圖縱坐標為熒光增量，式子-d(RFU)/dT。圖3、48種非鯊魚動植物的SG-PCR擴增結果。箭頭所指曲線為鯊魚陽性對照質粒的PCR擴增結果。圖4、48種非鯊魚動植物的SG-PCR溶解曲線。箭頭所指曲線為鯊魚陽性對照質粒的PCR溶解曲線。該圖縱坐標為熒光增量，式子-d(RFU)/dT。圖5、狗鯊DNA檢測靈敏度擴增曲線。擴增曲線從左到右依次為1 IOng/ μ L ；2 Ing/ μ L ；3 KT1Iig/ μ L ；4 l(T2ng/ μ L ；5 :l(T3ng/y L ；6 :l(T4ng/y L。圖6、鯊魚肉粉(W/W)檢測靈敏度擴增曲線。擴增曲線從左到右依次為1 狗鯊肉粉；2 狗鯊肉粉；3 :0. 狗鯊肉粉；4 :0. 01%狗鯊肉粉。圖7、常見鯊魚產品SG-PCR擴增曲線。擴增曲線從左到右依次是1 鯊魚陽性對照質粒；2 泡發魚翅1(購自上海人家飯店)；3:泡發魚翅2 (由上海波特曼麗嘉酒店提供)；4:泡發魚翅(購自上海馥園楊姐食品公司)；5 泡發魚翅(由上海松江檢驗檢疫局提供)；6 泡發魚翅(購自上海小南國飯店)；7:鯊魚肉(購自大連中天水產有限公司)；8:鯊魚片(購自大連匯能海產品有限公司)；9 干鯊魚鰭(由上海機場檢驗檢疫局提供)；10 干魚翅(由上海波特曼麗嘉酒店提供)；11 干魚翅(由上海松江檢驗檢疫局提供)；12:干魚翅(購自上海銅川水產品市場)； 13 干魚翅(購自上海家樂福超市)；14:凍干魚翅(上海養中堂生物科技有限公司)；15: 鯊魚源硫酸軟骨素初級加工品(由上海祥源生物科技有限公司提供)；16:美國天然元鯊魚軟骨素膠囊(購自上海家樂福超市)；17:日本百傲鯊鯊魚軟骨素膠囊(購自上海易初蓮花超市)。圖8、常見鯊魚產品SG-PCR溶解曲線。箭頭所指曲線為鯊魚陽性對照質粒的PCR溶解曲線。該圖縱坐標為熒光增量，式子-d(RFU)/dT。
具體實施例方式本發明人經過廣泛而深入的研究和試驗，首次揭示一種可特異性鑒定鯊魚成分的引物，所述引物針對含有鯊魚成分的DNA可發生特異性擴增，而對沒有鯊魚成分的DNA不發生特異性擴增。因而，所述引物可良好地應用于鑒定鯊魚成分，并且具有良好的再現性、靈敏度。本發明人通過對引物的篩選，獲得一類可特異性鑒定鯊魚成分的引物，其對于多種類的鯊魚的DNA均發生特異性擴增，而對沒有鯊魚成分的DNA不發生特異性擴增。因此，本發明提供一種引物，所述的引物具SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。本發明的這些引物還可以用放射性同位素、生物素、酶、熒光素或其他化學發光物質進行標記。利用本發明的引物，只需進行常規的PCR反應和/或瓊脂糖凝膠電泳，并通過判斷相應的PCR產物的有無，就可以準確、快速地判斷待測樣品是否含有鯊魚成分，而且所需的樣品量很少。基于本發明所提供的適用于鑒定鯊魚成分的特異性引物，本發明還提供了一種鑒定鯊魚成分的方法，所述方法包括以待測樣品的DNA為模板，以SEQID NO :1和SEQ ID NO 2所示的引物進行PCR擴增；若發生特異性擴增，則表明待測樣品中包含鯊魚成分聚合酶鏈反應(PC 技術是本領域技術人員熟知的技術，其基本原理是體外酶促合成特異DNA片段的方法。本發明的方法可采用常規的PCR技術進行。作為本發明的優選方式，利用所述引物，采用STOR Green實時熒光PCR方法來進行鯊魚成分的鑒定。STOR Green(SG)是一種熒光染料，能結合到DNA雙螺旋的小溝。處于溶解狀態的未結合染料顯示低的熒光強度，一旦結合到雙鏈DNA之后熒光信號增強。SG的這種特性被利用在實時PCR擴增中，由于在擴增反應中DNA增加，染料結合到擴增產物上， 熒光信號增強，通過熒光信號相對背景水平的增加進行分析。根據擴增序列的長度有多個熒光染料的分子結合到雙鏈DNA上。因為不需要設計序列特異性探針和新的引物對，這種方法是一種簡便，性價比較高的實時監測方法。SG染料可以在反應末尾對擴增產物進行溶解，稱為溶解曲線分析。在溶解曲線分析過程中，隨著溫度從低于產物溶解點緩慢升到高于產物溶解點，實時儀器連續監測每個樣品的熒光值。基于產物長度和G/C含量的不同，擴增產物會在不同的溫度點解鏈。隨著產物的解鏈，可以看到熒光值的降低并被儀器所測量。對溶解曲線進行微分可以計算出溶解峰。獲取待測樣品的DNA的方法是本領域技術人員所熟知的技術，例如可采取傳統的酚/氯仿/異戊醇法，或者可采用一些商購的DNA提取試劑盒。作為本發明的優選方式，采用海洋動物基因組提取試劑盒。
本發明還涉及一種用于鑒定鯊魚成分的試劑盒，所述試劑盒中含有SEQ IDNO=I 和SEQ ID NO :2所示的引物。此外，所述的試劑盒還可含有其它鑒定鯊魚成分的試劑，如(但不限于)(A)各種PCR反應用試劑，例如但不限于PCR緩沖液，dNTP, DNA聚合酶等；或(B)各種提取DNA(即制備PCR反應模板)所需的試劑，例如但不限于酚、氯仿、 異戊醇、NaCl等；或(C)提取DNA的試劑盒。此外，所述的試劑盒中還可含有鑒定鯊魚成分的使用說明書和/或標準操作程序。本發明所述的試劑盒可實現快速檢測、批量檢測鯊魚成分的目的。本發明的主要優點在于(1)首次揭示一種可特異性鑒定鯊魚成分的引物，所述的引物特異性良好，對于各種類鯊魚都能夠實現特異性擴增，而對于鯊魚以外的其它通常用作仿制鯊魚成分的物質則不能特異性擴增。并且，所述引物具有良好的再現性、結果穩定可靠。(2)利用所述的引物或含有所述引物的檢測試劑盒，可快速、大批量地檢測鯊魚成分，從待測樣品中快速準確地區分真假鯊魚成分，并且所需樣品量少，操作簡單。(3)較佳地，本發明應用STOR Green實時熒光PCR技術，可快速實現食品中鯊魚源性成分的準確鑒定。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，科學出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。1、材料與方法1. 1實驗材料大青鯊、尖吻斜鋸牙鯊、澳洲半沙條鯊、舒氏星鯊、鼠鯊、加勒比斜鋸牙鯊、尖吻鯖鯊由中國檢驗檢疫科學研究院提供。狗鯊由上海松江檢驗檢疫局提供。黃魚、黑魚、帶魚、鯧魚、羅非魚、秋刀魚、黃菇魚、白菇魚、劍魚、鰣魚、長江茴魚、鯽魚、巴沙魚、黃鰭金槍魚、籃鰭金槍魚、鳳尾魚、真鯛、白水魚、鱈魚、鱸魚、鱖魚、鳊魚、石斑魚、多寶魚、竹莢魚、大西洋鮭、馬鮫魚、鰨魚、鰻魚、鮐魚、黃蓋鰈、鰲蝦、豬、牛、山羊、雞、鴨、 鵝、兔、狗、大豆、綠豆、瓊脂、玉米、小麥、馬鈴薯、紅薯及海帶等48種常見非鯊魚動植物材料樣品購自上海家樂福、易初蓮花等大型超市及農貿市場。出口日本泡發魚翅、日本進口干魚翅、出口日本干魚翅、泰國進口干魚翅、日本進口鯊魚肝油均由上海進出口口岸提供。泡發魚翅、鯊魚肉、干鯊魚鰭、仿干魚翅、泡發的仿魚翅、干魚翅、凍干魚翅、國產鯊魚肝油、美國天然元公司硫酸軟骨素膠囊及日本百傲鯊公司鯊魚軟骨素膠囊均購自上海市場或飯店。5個泡發魚翅分別購自上海人家飯店、上海馥園楊姐食品公司、上海小南國飯店和由上海波特曼麗嘉酒店、上海松江檢驗檢疫局提供。2個鯊
6魚肉分別購自大連中天水產有限公司和大連匯能海產品有限公司。干鯊魚鰭由上海機場檢驗檢疫局提供。4個干魚翅分別由上海波特曼麗嘉酒店、上海松江檢驗檢疫局提供，和購自上海銅川水產品市場和上海家樂福超市。凍干魚翅購自上海養中堂生物科技有限公司。鯊魚源硫酸軟骨素初級加工品由上海祥源生物科技有限公司提供。美國天然元鯊魚軟骨素膠囊購自上海家樂福超市。日本百傲鯊鯊魚軟骨素膠囊購自上海易初蓮花超市。食品標簽不含鯊魚成分的達能餅干、光明酸牛奶、匯源蘋果汁、牦牛肉干、雙匯火腿腸、鳳尾魚罐頭、金槍魚罐頭、上海梅林午餐肉、康師傅紅燒牛肉面、克麗絲汀面包等10 個樣品購自上海家樂福、易初蓮花等大型超市和專賣店。1.2樣品制備使用冷凍研磨機將上述樣品磨成粉末狀，用于物種特異性檢測。將狗鯊肉和草魚肉研磨成粉狀后，80°C烘干12h。用草魚肉粉將上述狗鯊肉粉配制成10 ^UW、0. 1%、0.01%及0.001% (W/W)的預混樣品，用于重量靈敏度測試。1.3樣品DNA提取使用天根海洋動物基因組提取試劑盒(天根生化科技有限公司，目錄號DP324) 提取鯊魚及硬骨魚類樣本DNA、動物基因組提取試劑盒(目錄號DP32;3)提取動物樣本 DNA、植物基因組提取試劑盒(目錄號DP3(^)提取植物樣本DNA，提取方法詳見試劑盒操作說明書。用BioPhotometer plus核酸蛋白含量測定儀(Eppendorf)測定DNA濃度，置于-20°C保存備用。1.4引物設計運用Primer5引物設計軟件，經過反復比較篩選，設計了適用于擴增鯊魚的特異性PCR引物，引物序列為Primerl :5，-CACCTTTAGGCAAACCAGCAC—3，(SEQ ID NO 1)；Primer2 :5，-GGGCCAGGGTCGAATCTCT-3，(SEQ ID NO :2)。1.5PCR 擴增使用18S rRNA基因擴增真核生物內源基因，以確保所提取的DNA適合于PCR擴增。 檢測所用18S rRNA基因引物序列為5，-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3，(SEQ ID NO 3)；禾口5，-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3，(SEQ ID NO :4)。PCR 反應體系為:1XPCR緩沖液，2. 5mmol/L Mg2+，IU Taq 酶，200 μ mol/LdNTPs，引物 1 OOnmol/L,模板 50_100ng，反應體積為 25 μ L。擴增條件為-MV，3min ；94°C，20s, 54°C， 40s，72°C，40s，40 個循環。建立SYBR Green實時熒光PCR方法(SG PCR)對相應的DNA進行擴增，引物序列為Primerl :5，-CACCTTTAGGCAAACCAGCAC-3，(SEQ ID NO 1)；Primer2 :5，-GGGCCAGGGTCGAATCTCT-3，(SEQ ID NO :2)。反應體系 % 12. 5 μ L SYBY Green Pre Mix, 1 μ L Primerl (5 μ Μ), 1 μ Primer2 (5 μ Μ)，8. 5 μ L無菌去離子水，2 μ L模板DNA，反應體積為25 μ L。擴增條件為 95 °C, IOmin ；95 °C, 30s,64 °C,40s, 72 °C,45s, 35 個循環；95 °C，15s，64 °C，30s，99 °C，15s。 64°C收集熒光信號。
溶解曲線的獲得擴增反應完成后，通過逐漸增加溫度同時監測每一步的熒光信號來產生溶解曲線。1.6PCR產物的檢測取IOyL PCR產物，加IyL IOX上樣緩沖液點樣進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統記錄電泳圖譜。瓊脂糖凝膠濃度為2%。1. 7鯊魚陽性對照質粒的構建構建方法為使用SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的引物擴增藍鯊DNA，得到 PCR產物。由上海基康生物技術有限公司構建PCR產物質粒。2、結果與分析2. 1真核生物18S rRNA特異引物的檢測結果用真核生物18S rRNA特異性引物對所提取的所有DNA進行普通PCR擴增，除鯊魚肝油外，所有DNA樣品均出現137bp的特異性擴增條帶。結果表明，除鯊魚肝油因精加工程度過高DNA遭到破壞外，所有抽提的DNA溶液均適用于PCR測試。2. 2鯊魚源性成分引物的特異性檢測結果用建立的STOR Green實時熒光PCR方法，以鯊魚特異性PCR引物為引物，對9種鯊魚樣品DNA進行檢測，所有樣品均出現特異性擴增曲線(圖1)，且溶解曲線在84士 1. 5°C 的溫度范圍內出現峰值(圖2)。用建立的STOR Green實時熒光PCR方法，以鯊魚特異性PCR引物為引物，對48種非鯊魚類常見動植物樣品DNA進行STOR Green實時熒光PCR檢測，所有樣本均未出現擴增曲線(圖3)，且溶解曲線在84士 1.5°C的溫度范圍內未出現峰值(圖4)。結果表明，本發明建立的STOR Green實時熒光PCR方法對9種供試鯊魚種類具有特異性。2. 3鯊魚源性成分引物的靈敏度檢測結果用IXTE緩沖液將提取的狗鯊樣品DNA溶液稀釋至IOng/μ L、Ing/μ L、KT1ng/ yL、10-2ng/yL、10-3ng/yL、10-4ng/yL 禾口 10_5ng/μ L，按照建立的 SYBR Green 實時熒光 PCR方法對其進行擴增，并進行3次重復實驗，以確定該檢測方法的靈敏度。實驗表明IOng/μ L、lng/ μ L、KT1Iig/ μ L、l(T2ng/ μ L、l(T3ng/ μ L 禾口 l(T4ng/ μ L 的DNA稀釋液均出現穩定擴增曲線，如圖5。因此，本發明的方法的檢測靈敏度可達到 l(T4ng/y L。用草魚肉粉與狗鯊肉粉混合，配制成分別含有10%、1 %、0. 1%、0.01 %和 0. 001% (W/W)狗鯊肉粉的肉粉混合樣品，提取DNA后進行三次STOR Green實時熒光PCR， 10 %、1 %、0. 1 %和0. 01 %的預混樣品DNA均出現穩定擴增曲線，0. 001 %預混樣品未出現穩定擴增曲線，如圖6。因此，本發明的方法可檢測出0.01% (W/W)鯊魚肉的樣品。2. 4食品中鯊魚源性成分檢測的應用應用該方法對市場上常見的鯊魚產品鯊魚肉、干魚鰭、干魚翅、泡發魚翅、鯊魚源硫酸軟骨素初級加工品、鯊魚軟骨素膠囊、鯊魚肝油、仿干魚翅和泡發仿魚翅樣品進行檢測。其中，鯊魚肉、干魚鰭、干魚翅、泡發魚翅、鯊魚源硫酸軟骨素初級加工品、鯊魚軟骨素膠囊等含有鯊魚DNA的樣品均能出現特異性擴增曲線(圖7)，且溶解曲線在84士 1. 5°C內出現峰值(圖8)，能檢測出鯊魚成分；不含鯊魚成分的仿干魚翅和泡發的仿魚翅DNA樣品、精加工鯊魚肝油樣品(18S rRNA引物擴增為陰性)以及食品標簽不含鯊魚成分的10個樣品均未出現特異性擴增曲線，且溶解曲線在84士 1.5°C內未出現峰值，不能檢測出鯊魚成分。3、結論和討論該STOT Green實時熒光PCR檢測方法應用于食品中鯊魚源性成分真實性檢測， DNA濃度靈敏度可達0. OOOlng/ μ L，鯊魚肉粉重量靈敏度可達0. 01 % (W/W)，具有很高的可操作性和很強的實用性。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
權利要求
1.一種鑒定鯊魚成分的方法，其特征在于，所述方法包括以待測樣品的DNA為模板，以SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的引物進行PCR擴增； 若發生特異性擴增，則表明待測樣品中包含鯊魚成分。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的PCR是STORGreen實時熒光PCR。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的待測樣品是食品。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的檢測靈敏度為KT4ng/μL DNA。
5.一種引物，其特征在于，所述引物是引物對，其序列如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2 所示。
6.權利要求5所述的引物的用途，用于從待測樣品中鑒定鯊魚成分。
7.一種鑒定鯊魚成分的試劑盒，其特征在于，其中包括權利要求5所述的引物。
8.如權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括含有鯊魚成分的檢測標準品。
9.如權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括選自以下的試劑 DNA提取試劑，PCR緩沖液，DNA聚合酶，SYBY Green Pre Mix。
10.如權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中還包括說明鑒定鯊魚成分的方法的使用說明書。
全文摘要
本發明涉及食品中鯊魚成分的實時熒光PCR檢測方法和試劑盒。本發明首次揭示一種可特異性鑒定鯊魚成分的引物，所述引物針對含有鯊魚成分的DNA可發生特異性擴增，而對沒有鯊魚成分的DNA不發生特異性擴增。因而，所述引物可良好地應用于鑒定鯊魚成分，并且具有良好的再現性、靈敏度。
文檔編號C12Q1/68GK102337350SQ201110362019
公開日2012年2月1日 申請日期2011年11月15日 優先權日2011年11月15日
發明者張舒亞, 李富威, 諶鴻超, 郭云霞, 陳穎, 黃文勝 申請人:上海出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢驗檢疫技術中心