專利名稱：一種乳酸桿菌及其發酵方法
技術領域：
本發明涉及一種乳酸桿菌及其發酵方法，屬于生物技術領域。
背景技術：
抗生素在飼料中的應用創造了養殖業和飼料工業的革命，規模養殖在全世界得到了迅速發展，畜禽飼料中添加抗生素對于提高畜禽抗病力、改善生產性能有良好的效果，但飼料中抗生素的長期使用、濫用存在著嚴重的負面效應。主要表現為病原菌耐藥性的產生及畜產品中抗生素的殘留。病原菌耐藥性的產生對人類及畜禽疾病治療與防控帶來極大困難，而畜產品中抗生素的殘留通過食物鏈進入人體后對人的健康產生嚴重危害。許多國家都制定了相應的法規來限制使用或取消飼用抗生素。在抗生素的替代品研究中，新的綠色飼料添加劑的應用是一種必然趨勢，益生素則是新一代產品的典型代表，它們在動物體內主要是通過調節腸道微生態平衡、抑制腸道內的病原微生物、幫助動物建立有利于宿主的微生態區系、提高機體免疫機能、改善飼料利用效率等，達到促進動物生長、預防疾病的作用。由于微生態制劑安全無毒、無殘留、不產生抗藥性，克服了抗生素使用存在的弊端，因此，它的研究及應用受到了極大的關注。隨著人們對食品安全的重視和健康的關注，微生態制劑的研究及應用將會越來越為深入、廣泛。乳酸菌是一類能利用可發酵碳水化合物產生大量乳酸細菌的總稱。目前已發現的這類菌在在細菌分類學上至少包括18個屬，其中，乳酸桿菌屬和雙歧桿菌屬是動物腸道中的優勢菌群，這些菌屬的益生素制劑應用歷史更早，制劑種類更多，其中包括乳酸菌發酵飼料、乳酸菌粉及乳酸菌提取物。能夠作為飼料添加劑的乳酸桿菌有嗜酸乳酸桿菌、乳酪乳酸桿菌、發酵乳酸桿菌和植物乳酸桿菌、唾液乳酸桿菌、短小乳酸桿菌等。雙歧桿菌是許多益生素產品標簽中注明含有的一種益生菌株。由于雙歧桿菌是人體和動物腸道中的優勢菌， 其數量常作為腸道微生態平衡的一個重要指標，益生素產品中經常使用的雙岐桿菌菌株有嬰兒雙岐桿菌、青春雙歧桿菌、長雙歧桿菌、短雙歧桿菌等。盡管乳酸菌可以提高動物的免疫力和生產性能，但是由于乳酸菌抗逆性較差，阻礙了這類細菌在生產實踐中的應用，例如對溫度敏感，氧氣對其殺傷力很強等。盡管隨著機械加工工藝的不斷發展，利用造粒，包被及低溫干燥技術已經使乳酸桿菌在飼料工業上的應用已成為可能，但是從菌種出發解決乳酸菌制劑的抗逆性問題，是生產這類微生態制劑的根本方法。
發明內容
本發明的第一個目的是提供一種乳酸桿菌，該乳酸桿菌能夠耐受較高的溫度和空氣中的氧氣，同時具有耐胃酸和膽鹽，并產生乳酸，可以對大腸桿菌的生長和繁殖產生抑制作用。本發明的第二個目的是提供一種含有上述乳酸桿菌的發酵方法。本發明的第三個目的是提供一種含有上述乳酸桿菌微生態制劑，該制劑對調節動物腸胃微生物群落，維持腸道菌群平衡，提高生產性能等方面具有良好的促進作用。為實現本發明的第一個目的提供一種乳酸桿菌，該乳酸菌2010年1月27日保臧在《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》的乳酸桿菌Lactobacillus sp.，保藏中心登記入冊編號CGMCC No. 3614。所述的乳酸桿菌(LactcAacillus sp. )CGMCC No. 3614，是一種分離于仔豬糞便，為革蘭氏陽性、厭氧桿菌，其DNA中G+C含量37m0l%，形態成細長桿狀、兩端圓、為 0. 6 μ mX 1. 5 μ m，以單個、成雙或成鏈出現，不運動，無鞭毛，無芽孢，菌落粗糙，培養基中加入吐溫80，則菌落光滑；深層菌落呈分枝的不規則形狀，無色素；發酵碳水化合物產生大量乳酸；過氧化氫酶陰性，不產生細胞色素，不液化明膠，不分解酪蛋白，不產生吲哚和硫化 Μ,ο本發明提供的乳酸桿菌(LactcAacillus sp. )CGMCC No. 3614除具有上述生物學特征之外，還具有耐高溫和耐氧能力強，同時具有耐胃酸和膽鹽，并抑制大腸桿菌生長等性能穩定的菌種1)該乳酸桿菌在溫度80攝氏度的環境中，在2分鐘以內存活率達到95%以上。一般地，乳酸桿菌在65-75攝氏度會死亡，而本發明的乳酸桿菌在這種溫度下，存活率很高。2)該乳酸桿菌在非厭氧條件下可以正常生長和繁殖，有氧和厭氧條件下，菌體發酵密度相同。由于乳酸菌是厭氧菌或兼性厭氧菌，氧對細菌有強殺傷力，因此，大多數乳酸菌必須在厭氧條件下才能生長繁殖。3)該乳酸桿菌在PH= 2的環境中，在3小時以內存活率達到93%以上。一般地， 動物胃液的PH在2 5，這種酸性環境條件對微生物的致死率有很強的殺傷作用，而本發明的乳酸桿菌在這種酸性條件下，存活率很高。4)該乳酸桿菌在豬膽鹽含量為0. 5%的環境中，處理3小時，存活率在97%以上。 膽鹽具有殺菌和抑菌作用，在食糜中的含量一般在0. 2-0. 6%左右，因此，本發明的菌種可以耐受膽鹽。5)大腸桿菌和沙門氏菌菌是導致動物發生消化道疾病的主要微生物，所以抑制大腸桿菌和沙門氏菌菌的生長可以控制消化道疾病的發生，本發明所述的菌種可以對大腸桿菌和沙門氏菌菌的生長和繁殖產生抑制作用，其抑菌半徑分別為1. 3厘米和1. 5厘米左右。本發明的第二個目的是提供一種含有上述乳酸桿菌的發酵方法。所述的乳酸桿菌發酵方法包括如下步驟1)種子培養物制備乳酸桿菌(LactcAacillus sp. ) CGMCC No. 3614保存于種子培養基，并利用該培養基進行接種。所述的種子培養基配方為蛋白胨，IOg;牛肉浸膏，IOg;酵母浸粉，5g;磷酸氫二鉀，2g ；枸椽酸二銨，2g ；葡萄糖，20g ；醋酸鈉，5g ；吐溫80，Ig ；蒸餾水，1000ml，用冰醋酸調節pH至5. 4。將乳酸桿菌接種于種子培養基于厭氧管進行培養，得到的種子培養物。所述的培養過程為微生物培養、發酵常用的方法。其優選，所述的培養是在溫度為35 38°C的條件下，培養10_30小時。其優選，乳酸桿菌接種于厭氧管，在溫度為37°C恒溫箱中培養M小時，作為種子培養物。2)搖瓶培養物制備所述的搖瓶培養基配方為奶粉，2g ；蛋白胨，Ig ；牛肉膏，0. 5g ；乳糖，1. 5g ；酵母膏，0. 5g ；蒸餾水，1000ml，用冰醋酸調節pH至5. 4。將厭氧管中的種子培養物，接種于搖瓶培養基中，接種比例為1. 0-20%。所述的接種方法為微生物培養、發酵常用的方法。所述的培養過程為微生物培養、發酵常用的方法。其優選，所述的培養是在溫度為35 38°C的條件下，培養10-30小時。其優選，乳酸桿菌接種于搖瓶，接種比例為10%，在溫度為37°C恒溫箱中培養12 小時，作為搖瓶培養物。3)發酵罐培養物的制備所述的發酵培養基配方為奶粉，0.2% ；蛋白胨，0. ；牛肉膏，0.05% ；蔗糖， 0. 15% ；酵母膏，0. 05%，用冰醋酸調節pH至5. 4。將搖瓶中的培養物，接種于發酵罐培養基中，接種比例為1. 0-20%。所述的接種方法為微生物培養、發酵常用的方法。所述的培養過程為微生物培養、發酵常用的方法。其優選，所述的培養是在溫度為35 37°C的條件下，培養10_30小時。其優選，乳酸桿菌接種于發酵罐，接種比例為10%，在溫度為37°C發酵罐中培養 20小時，作為大罐培養物。保藏說明菌株酸桿菌 Lactobacillus sp.保藏日期2010年1月27日保藏單位中國微生物菌種保減管理委員會普通微生物中心保藏編號CGMCCNo. 361具體實施方式
下面結合實施例詳細介紹本發明，所述的實施例用來理解而并非限制本發明。實施例1本實施例為保藏號為CGMCC No. 3614的乳酸桿菌的篩選過程，具體步驟如下(1)、菌種的初篩利用Rogosa SL完全選擇性培養基對仔豬胃粘膜不同位置的微生物進行選擇行篩選，以獲得乳酸桿菌。其中Rogosa SL完全選擇性培養基配方為現有技術，具體為胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，葡萄糖10g，阿拉伯糖5g，蔗糖5g，醋酸鈉15g，枸椽酸銨2g，磷酸二氫鉀6g，七水硫酸鎂0. 58g，四水硫酸錳0. 25g，硫酸亞鐵0. 03g，吐溫80 lg，瓊脂13g，蒸餾水IOOOmL,用醋酸調節PH至5.0。(2)、乳酸桿菌的耐胃酸復篩 利用Rogosa SL培養基對初篩出的乳酸桿菌進行厭氧發酵，用醋酸調節PH為2，發酵3小時，進行復篩；
(3)、乳酸桿菌的耐膽鹽復篩利用Rogosa SL培養基對初篩出的乳酸桿菌進行厭氧發酵，豬膽鹽濃度為0. 5%, 發酵3小時，進行復篩；(4)、乳酸桿菌的耐溫特性復篩利用Rogosa SL培養基對初篩出的乳酸桿菌進行厭氧發酵，用醋酸調節pH為2，發酵12小時，然后放入80攝氏度恒溫箱中，觀察微生物的耐受情況，進行耐溫復篩；(5)、乳酸桿菌的耐氧特性復篩利用Rogosa SL培養基對初篩出的乳酸桿菌進行發酵，用醋酸調節pH為2，在非厭氧條件下，發酵12小時，然后觀察微生物的生長情況，進行耐氧復篩；(6)、乳酸桿菌的的抑菌特性利用麥康凱培養基對致病性大腸桿菌抑制性能的篩選，對治病性大腸桿菌和沙門氏菌抑制性能的篩選的標準為乳酸桿菌對致病性大腸桿菌的抑菌直徑要達到1. 2cm左右， 對沙門氏菌的抑菌直徑要達到1. 3cm左右。經過篩選，得到一株乳酸桿菌Lactobacillus sp.，2010年1月27日保藏于 《中國微生物菌種保臧管理委員會普通微生物中心》，保藏號為CGMCC No. 3614。該菌特性為為革蘭氏陽性、厭氧桿菌，其DNA中G+C含量37m0l%，形態成細長桿狀、兩端圓、為 0. 6 μ mX 1. 5 μ m，以單個、成雙或成鏈出現，不運動，無鞭毛，無芽孢，菌落粗糙，培養基中加入吐溫80，則菌落光滑；深層菌落呈分枝的不規則形狀，無色素；發酵碳水化合物產生大量乳酸；過氧化氫酶陰性，不產生細胞色素，不液化明膠，不分解酪蛋白，不產生吲哚和硫化 Μ,ο實施例2將實施例1得到的乳酸桿菌(LactcAacillus sp.)保藏號CGMCC No. 3614接種于厭氧管中，所用種子培養基配方為蛋白胨，IOg;牛肉浸膏，IOg;酵母浸粉，5g;磷酸氫二鉀，2g ；枸椽酸二銨，2g ；葡萄糖，20g ；醋酸鈉，5g ；吐溫80，Ig ；蒸餾水，IOOOmL,用冰醋酸調節PH至5. 4。在恒溫箱中溫度為37°C的溫度下培養M小時，得到種子培養物。該培養物可以冷凍保存，也可以直接接種。實施例3將實施例2得到的種子培養物接種于搖瓶培養基中，所用搖瓶培養基配方為奶粉，2g ；蛋白胨，Ig ；牛肉膏，0. 5g ；乳糖，1. 5g ；酵母膏，0. 5g ；蒸餾水，lOOOmL，用冰醋酸調節 PH至5. 4。接種比例為10%，在溫度為37°C恒溫箱中培養12小時，作為搖瓶培養物。實驗例4將實施例3得到的搖瓶培養物接種于發酵罐培養基中，所用發酵罐培養基配方為奶粉，0. 2% ；蛋白胨，0. 1% ；牛肉膏，0. 05% ；蔗糖，0. 15% ；酵母膏，0. 05%，用冰醋酸調節？!1至5.4。接種于發酵罐，接種比例為10%，在溫度為37°C恒溫箱中培養20小時，作為大罐培養物。發酵結束時大罐培養物的菌體密度每毫升可達6. 2X 101°以上個活菌。該培養物干燥后可作為微生態制劑使用。
權利要求
1.一種乳酸桿菌，其特征在于，該乳酸桿菌為于2010年1月27日保藏在《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》的乳酸桿菌Lactobacillus sp.，保藏中心登記入冊編號CGMCC No. 3614。
2.根據權利要求1所述的乳酸桿菌，其特征在于，所述的乳酸桿菌的生物學特性如下1)是一種分離于仔豬糞便，為革蘭氏陽性、厭氧桿菌，其DNA中G+C含量37mol%，形態成細長桿狀、兩端圓、為0. 6 μ mX 1. 5 μ m，以單個、成雙或成鏈出現，不運動，無鞭毛，無芽孢，菌落粗糙，培養基中加入吐溫80，則菌落光滑；深層菌落呈分枝的不規則形狀，無色素； 發酵碳水化合物產生大量乳酸；過氧化氫酶陰性，不產生細胞色素，不液化明膠，不分解酪蛋白，不產生吲哚和硫化氫；2)在溫度80攝氏度的環境中，在2分鐘以內存活率達到95%以上；3)在非厭氧條件下可以正常生長和繁殖，有氧和厭氧條件下，菌體發酵密度相同；4)在pH= 2的環境中，在3小時以內存活率達到93%以上；5)在豬膽鹽含量為0.5%的環境中，處理3小時，存活率在97%以上；6)對大腸桿菌和沙門氏菌菌的生長和繁殖產生抑制作用，其抑菌半徑分別為1.3厘米和1. 5厘米左右。
3.權利要求2所述的乳酸桿菌采用以下步驟得到1)對仔豬糞便粘膜不同位置的微生物進行選擇行篩選；幻耐胃酸復篩；幻耐膽鹽復篩；4)耐溫特性復力)耐氧特性復篩；6) 抑菌特性復篩。
4.一種含有權利要求1或2所述乳酸桿菌的發酵方法，其特征在于分為以下步驟1)乳酸桿菌在種子培養基中經過充分培養、發酵后得到種子培養物；2)制成搖瓶培養物；3)制成發酵罐培養物。
5.根據權利要求4所述的搖瓶培養物，其特征在于，所述的培養、發酵過程得到的搖瓶培養物再接種于發酵生產培養基培養獲得終培養物，該培養物干燥后可作為微生態制劑使用。
全文摘要
本發明提供了一種乳酸桿菌及其發酵方法，屬于生物技術領域。所述的乳酸桿菌為于2010年1月27日保藏在《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》的乳酸桿菌Lactobacillus sp.，保臧中心登記入冊編號CGMCC No.3614，是一種分離于仔豬糞便，該菌種突出特性為耐高溫和耐氧能力較高，同時具有耐胃酸和膽鹽，產生乳酸并抑制大腸桿菌生長等性能穩定的菌種，該菌種經過奶粉肉湯培養基發酵后每毫升菌種數可達到6.2×1010以上個活菌。
文檔編號C12R1/225GK102399728SQ20111039472
公開日2012年4月4日 申請日期2011年12月2日 優先權日2011年12月2日
發明者吳連福, 江生, 胥學新, 邊桂萍 申請人:北京中科景明生物技術有限公司