一種植物乳酸桿菌atcc 8014與蘆薈共發酵飲料的制備方法
【專利摘要】一種植物乳酸桿菌ATCC 8014與蘆薈共發酵飲料的制備方法，其特征是利用庫拉索蘆薈原汁與植物乳酸桿菌ATCC 8014共發酵，通過設定不同的溫度梯度和PH梯度，經活菌計數后，確定其最佳發酵條件。用蘆薈發酵液對致病菌進行抑菌實驗，確定其抗菌能力；并通過對其抗氧化性指標的測定，如DPPH自由基清除能力的測定、鐵離子螯合能力的測定和總還原力的測定等，初步確定了該蘆薈益生菌發酵液的抗氧化能力，并進行評價，以實現蘆薈洗液和蘆薈飲品的研制。
【專利說明】一種植物乳酸桿菌ATCC 8014與蘆薈共發酵飲料的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明主要涉及植物乳酸桿菌ATCC 8014與蘆薈原汁共發酵條件的摸索及其抗氧化性和抑菌效果的研究，將發酵液進行抑菌試驗，測定其并抑菌效果；并對發酵液的抗氧化能力進行了測定和評價，主要用于今后相關蘆薈洗液和蘆薈飲品的研制，具體涉及一種植物乳酸桿菌ATCC 8014與蘆薈共發酵飲料的制備方法。
【背景技術】
[0002]蘆薈屬百合科草本植物，蘆薈凝膠中含有豐富的多糖、蛋白質、氨基酸、維生素、活性酶及對人體十分有益的微量元素。它具有多重功效，美白、保濕、控油、除痘等作用。并且蘆薈提取液常添加在食品、藥品、牙膏及化妝品中，不僅具有抗細菌、防止皮膚干裂或油脂分泌多、對治療雀斑、青春痘和防止脫發、去頭屑、消炎、愈合傷口、免疫、抗腫瘤都有極好的療效。
[0003]益生菌是指一類對人和動物有益的細菌，指投入后通過改善宿主腸道菌群生態平衡而發揮有益作用，提高宿主健康水平和使宿主健康達到最佳狀態的活菌制劑及其代謝產物，各種食品中更是添加多種益生菌，增強食品營養價值。
[0004]植物性乳酸菌是從泡菜、腌菜、豆瓣醬等傳統的植物性發酵食品中分離篩選出來的一類乳酸菌，包括植物乳桿菌、干酪乳桿菌、短乳桿菌等。
[0005]目前人們所食用的酸奶等乳酸菌制品多是動物性乳酸菌發酵而來的；然而植物性乳酸菌與動物性乳酸菌相比，耐酸和耐膽鹽能力更強，且能在營養不均的惡劣環境下生存，所以進入人體腸道存活率更高，定植能力更強。故植物性乳酸菌制品在改善腸道環境、提高人體免疫力方面更有優勢。
[0006]本發明，采用植物乳酸桿菌ATCC 8014與蘆薈原汁進行共發酵，研究了發酵液的抗氧化能力和發酵液的抑菌能力，并進行了評價。
【發明內容】
[0007]本發明主要用于蘆薈洗液和蘆薈飲品的研制，對研制前期的蘆薈發酵液最佳條件進行探索，并進行抗氧化性的測定，評價蘆薈發酵液產品研制過程中具有的優勢，本發明提供一種植物乳酸桿菌ATCC 8014與蘆薈共發酵飲料的制備方法。
[0008]本發明所述制備方法包括下列步驟:
1、蘆薈的選擇和制備:采選新鮮、飽滿、肉質肥厚的蘆薈葉片，剔除帶有病斑、軟腐的葉片，葉片均重30(T400 g;葉片采用75%酒精進行表面消毒，去除蘆薈葉表面皮層，采用榨汁機榨汁，分裝后，6000 rpm/min離心10 min，再次分裝，制成蘆薈原汁，所述蘆薈為庫拉索
Sifc
尸衣ο
[0009]2、采用巴氏消毒法將蘆薈原汁滅菌，55 °C處理30 min,4 °C保存備用。
[0010]3、植物乳酸桿菌ATCC 8014的活化 A從-80 1:冰箱取出植物乳酸桿菌ATCC 8014，按培養基體積的5%接種于5 mL MRS培養基中，于37 °C恒溫培養箱中培養過夜。
[0011]B取過夜培養的植物乳酸桿菌ATCC 8014，按培養基體積的5%接種5 mL培養基中，
二次活化。
[0012]4、發酵條件的設定
A、設定發酵溫度梯度分別為25°C、30 °C、37 °C、42 °C，在上述不同的發酵溫度條件下取5 mL蘆薈原汁，加入蘆薈原汁體積的10%脫脂乳和2%葡萄糖，植物乳酸桿菌ATCC8014接種量為蘆薈原汁體積的5%，發酵20 h，得到不同溫度條件下的蘆薈發酵液；
B、取上述各蘆薈發酵液，加生理鹽水按11?16比例稀進行活菌計數，確定最佳發酵溫度。
[0013]C、在最佳發酵溫度的條件下，設定蘆薈原汁PH梯度為3、4、5、6、7、8、9，在上述不同的PH條件下取5 mL蘆薈原汁，加入蘆薈原汁體積的10%脫脂乳和2%葡萄糖，植物乳酸桿菌ATCC 8014接種量為蘆薈原汁體積的5%，發酵20h，采用PH計調節PH。
[0014]D、取上述各蘆薈發酵液，加生理鹽水按11?16比例稀釋，取50 μ L涂板，過夜培養，進行活菌計數，確定最佳發酵ΡΗ。
[0015]5、最佳條件發酵及發酵后處理:在步驟4確定最佳PH和最佳溫度后，取5 mL蘆薈原汁，加入蘆薈原汁體積的10%脫脂乳和2%葡萄糖，接種蘆薈原汁5%的植物乳酸桿菌ATCC8014，發酵48 h，10000 rpm/min離心10 min,重新分裝，獲得植物乳酸桿菌ATCC 8014蘆薈發酵液，4 °C保存備用。
[0016]6、蘆薈發酵液抗氧化性指標的測定和后期評價
A、DPPH自由基清除能力的測定
取2ml蘆薈發酵液，加入2ml DPPH乙醇溶液，黑暗下室溫反應30min，然后用等體積的三氯甲烷抽提，取上清517nm測0D，對照為去離子水加DPPH溶液。
[0017]B、羥基自由基清除能力的測定
取2 mmol/L的硫酸亞鐵溶液I mL, 6 mmol/L過氧化氫I mL, 6 mmol/L水楊酸I mL,并加入蘆薈發酵液I mL，靜置30 min，以蒸餾水為參比，在510 nm處測定吸光度，計算羥自由基的清除率。
[0018]C、3，5- 二硝基水楊酸法測定還原糖
a、標準曲線的制作:取8支15 mmX 180 mm試管,分別編號為O至7,向其中依次加入
0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.4、1.6、2.0 mL的I mg/mL的葡萄糖標準溶液,然后用蒸懼水定容到2 mL再依次加入1.5 mL水楊酸，水浴5 min，取出立即冷卻到室溫，加21.5 mL蒸餾水，搖勻，在540 nm處測定吸光度。
[0019]b、樣品中還原糖含量的測定:以標準曲線制作中O號為對照，向15 mmX 180 mm試管中加入I mL樣品溶液，I mL蒸餾水和1.5 mL水楊酸，水浴5 min，取出立即冷卻到室溫，加21.5 mL蒸餾水，搖勻，在540 nm處測定吸光度。
[0020]D、對Fe2+的螯合能力的測定
取0.5 mL蘆薈發酵液中加入0.4%的FeS04溶液0.1 mL混合均勻后，再加入0.1 mL1%的抗壞血酸溶液和0.2 mol/L氫氧化鈉溶液I mL，37°C下反應20 min，然后用10%的三氯乙酸去除蛋白6000 rpm, 10 min,4°C,取0.4 mL上清并加入4 mL 0.1%鄰二氮菲，室溫反應10 min，測定536 nm處吸光度。
[0021]E、總還原力的測定
取I mL的樣品，加入I mL的磷酸緩沖液P H=6.6和1%鐵氰化鉀溶液I mL，混勻，在50 °C下保溫20 min,加入10 %的三氯乙酸溶液I mL，振蕩混勻后取I mL的混合液，加入4 mL去離子水和0.1 %的三氯化鐵溶液0.4 mL，靜置10 min，用去離子水為空白，在700 nm下進行比色，吸光度的值越大，說明還原力越強。
[0022]7、抑菌試驗
A.活化鼠傷寒、腸炎沙門、志賀301、福氏志賀、單增ATCC、金黃色葡萄球菌大腸0157、痤瘡丙酸桿菌，過夜培養。
[0023]B.將8株致病菌的菌體濃度調至18 CFU/mL左右，分別取100 μ L菌液涂布于LB平板。
[0024]C.待菌液吹干后，在平板中小心放入無菌的牛津杯；將發酵液上清10000 rpm/min離心10 min,向牛津杯中加入發酵液上清。
[0025]D.37°C培養6-8 h，每隔2?3 h觀察。
[0026]E.測量平板中的抑菌圈直徑，并照相。
[0027]8、蘆薈發酵液后期評價
針對步驟6中的抗氧化性指標測定結果，對該蘆薈發酵液上清進行抗氧化能力的評價。
[0028]本發明的有益效果:本發明所制備的發酵飲料，安全無毒，將蘆薈本身原有的保健功能和植物乳酸桿菌ATCC 8014的益生效果完美結合在一起，具有美容、調節腸道菌群平衡、促進腸道蠕動等功效，有益于人體健康。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0029]圖1不同溫度活菌計數結果；
圖2不同PH活菌計數結果；
圖3植物乳酸桿菌ATCC 8014發酵液抗氧化參數測定；
圖4還源糖測定標準曲線；
圖5ATCC 8014蘆薈發酵液抑菌結果；
圖6ATCC 8014蘆薈發酵液抑菌圖片。
【具體實施方式】
[0030]實施例1:
一種植物乳酸桿菌ATCC 8014與蘆薈共發酵飲料的制備方法:
1、蘆薈的選擇和制備:采選新鮮、飽滿、肉質肥厚的蘆薈葉片，剔除帶有病斑、軟腐的葉片，葉片均重30(T400 g;葉片采用75%酒精進行表面消毒，去除蘆薈葉表面皮層，采用榨汁機榨汁，分裝后，6000 rpm/min離心10 min，再次分裝，制成蘆薈原汁，所述蘆薈為庫拉索尸衣ο
[0031]2、采用巴氏消毒法將蘆薈原汁滅菌，55 °C處理30 min,4 °C保存備用。
[0032]3、植物乳酸桿菌ATCC 8014的活化 A從-80 1:冰箱取出植物乳酸桿菌ATCC 8014，按培養基體積的5%接種于5 mL MRS培養基中，于37 °C恒溫培養箱中培養過夜。
[0033]B取過夜培養的植物乳酸桿菌ATCC 8014，按培養基體積的5%接種5 mL培養基中，
二次活化。
[0034]4、發酵條件的設定
A、設定發酵溫度梯度分別為25°C、30 °C、37 °C、42 °C，在上述不同的發酵溫度條件下取5 mL蘆薈原汁，加入蘆薈原汁體積的10%脫脂乳和2%葡萄糖，植物乳酸桿菌ATCC8014接種量為蘆薈原汁體積的5%，發酵20 h，得到不同溫度條件下的蘆薈發酵液；
B、取上述各蘆薈發酵液，加生理鹽水按11?16比例稀進行活菌計數，確定最佳發酵溫度。
[0035]C、在最佳發酵溫度的條件下，設定蘆薈原汁PH梯度為3、4、5、6、7、8、9，在上述不同的PH條件下取5 mL蘆薈原汁，加入蘆薈原汁體積的10%脫脂乳和2%葡萄糖，植物乳酸桿菌ATCC 8014接種量為蘆薈原汁體積的5%，發酵20h，采用PH計調節PH。
[0036]D、取上述各蘆薈發酵液，加生理鹽水按11?16比例稀釋，取50 μ L涂板，過夜培養，進行活菌計數，確定最佳發酵ΡΗ。
[0037]5、最佳條件發酵及發酵后處理:在步驟4確定最佳PH和最佳溫度后，取5 mL蘆薈原汁，加入蘆薈原汁體積的10%脫脂乳和2%葡萄糖，接種蘆薈原汁5%的植物乳酸桿菌ATCC8014，發酵48 h，10000 rpm/min離心10 min,重新分裝，獲得植物乳酸桿菌ATCC 8014蘆薈發酵液，4 °C保存備用。
[0038]實施例2:抗氧化指標的測定及評價
1、相關試劑配制:0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液:0.007886 g DPPH溶于100 mL乙醇，避光配制，現配現用；150 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl:2.364 g Tris-HCl 溶于 100 mL 蒸餾水中；1.2 mmol/L鄰苯三酚:0.01513 g鄰苯三酚10 mM HCl，加蒸餾水定容至100 mL，避光保存；0.4% FeS04: FeS04*7H20:0.7315 g溶于100 mL蒸餾水中，避光保存；1%抗壞血酸:抗壞血酸I g溶解于100 mL蒸餾水中，避光保存；0.2 mol/L氫氧化鈉:NaOH 0.8 g溶解于100 mL蒸餾水中；10%三氯乙酸:三氯乙酸10 g溶于100 mL蒸餾水中；0.1%鄰二氮菲:鄰二氮菲0.1 g溶解于100 mL蒸餾水中；磷酸緩沖液P H=6.6:1M磷酸鹽緩沖液配制；
0.1%三氯化鐵:FeC13 0.1 g溶解于100 mL蒸餾水中。
[0039]2、確定最佳PH和溫度后，發酵48 h, 10000 rpm/min離心10 min,重新分裝,獲的植物乳酸桿菌ATCC 8014蘆薈發酵液，4 °C保存備用。
[0040]3、抗氧化指標的測定
A、DPPH自由基清除能力的測定
取2ml蘆薈發酵液，加入2ml DPPH乙醇溶液，黑暗下室溫反應30min，然后用等體積的三氯甲烷抽提，取上清517nm測0D，對照為去離子水加DPPH溶液。
[0041]B、羥基自由基清除能力的測定
取2 mmol/L的硫酸亞鐵溶液I mL, 6 mmol/L過氧化氫I mL, 6 mmol/L水楊酸I mL,并加入蘆薈發酵液I mL，靜置30 min，以蒸餾水為參比，在510 nm處測定吸光度，計算羥自由基的清除率。
[0042]C、3，5-二硝基水楊酸法測定還原糖 a、標準曲線的制作:取8支15 mmX 180 mm試管,分別編號為O至7,向其中依次加入
0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.4、1.6、2.0 mL的I mg/mL的葡萄糖標準溶液,然后用蒸懼水定容到2 mL再依次加入1.5 mL水楊酸，水浴5 min，取出立即冷卻到室溫，加21.5 mL蒸餾水，搖勻，在540 nm處測定吸光度。
[0043]b、樣品中還原糖含量的測定:以標準曲線制作中O號為對照，向15 mmX 180 mm試管中加入I mL樣品溶液，I mL蒸餾水和1.5 mL水楊酸，水浴5 min，取出立即冷卻到室溫，加21.5 mL蒸餾水，搖勻，在540 nm處測定吸光度。
[0044]D、對Fe2+的螯合能力的測定
取0.5 mL蘆薈發酵液中加入0.4%的FeS04溶液0.1 mL混合均勻后，再加入0.1 mL1%的抗壞血酸溶液和0.2 mol/L氫氧化鈉溶液I mL，37°C下反應20 min，然后用10%的三氯乙酸去除蛋白6000 rpm, 10 min,4°C,取0.4 mL上清并加入4 mL 0.1%鄰二氮菲，室溫反應10 min，測定536 nm處吸光度。
[0045]E、總還原力的測定
取I mL的樣品,加入I mL的磷酸緩沖液p H=6.6和1%鐵氰化鉀溶液I mL,混勻，在50°C下保溫20 min,加入10 %的三氯乙酸溶液I mL，振蕩混勻后取I mL的混合液，加入4 mL去離子水和0.1 %的三氯化鐵溶液0.4 mL，靜置10 min，用去離子水為空白，在700 nm下進行比色，吸光度的值越大，說明還原力越強。
[0046]實施例3:抑菌試驗
實驗材料:植物乳酸桿菌ATCC 8014、鼠傷寒、腸炎沙門、志賀301、福氏志賀、單增JΤ?Γ、金黃色葡萄球菌com/77、大腸0157、痤瘡丙酸桿菌、庫拉索蘆薈、MRS培養基、LB培養基、SLB培養基、牛津杯。
[0047]實驗步驟
一.活化植物乳酸桿菌ATCC 8014、鼠傷寒、腸炎沙門、志賀301、福氏志賀、單增J/tT、金黃色葡萄球菌ccwanl、大腸0157、痤瘡丙酸桿菌，過夜培養。
[0048]二.將8株致病菌的菌體濃度調至18 CFU/mL左右，分別取100 μ L菌液涂布于LB平板。
[0049]三.待菌液吹干后，在平板中小心放入無菌的牛津杯；將發酵液上清10000 rpm/min離心10 min,向牛津杯中加入發酵液上清。
[0050]四.37°C培養6-8 h，每隔2?3 h觀察。
[0051]五.測量平板中的抑菌圈直徑，并照相。
[0052]為評價植物乳酸桿菌ATCC 8014能否在蘆薈原汁中大量生長及評價其最適發酵溫度和pH，我們對不同溫度和pH蘆薈原液中的嗜熱鏈球菌ATCC 14485進行了計數，如圖
1、2，結果表明，植物乳酸桿菌ATCC8014蘆薈發酵液在發酵20 h后，當溫度為37 °C，PH=7時，活菌計數結果細菌數量最多，基本達到18數量級。因此，我們將植物乳酸桿菌ATCC8014蘆薈發酵液發酵最佳條件設定為37 °C，PH=7。
[0053]為確保我們制備的蘆薈發酵液具有良好的抗氧化性，我們對常見的幾個抗氧化性指標進行了評價。如圖3、4結果表明，在37 °C, PH=7的條件下發酵48 h, 10000 rpm/min10離心后，發酵液澄清透亮。DPPH自由基清除能力實驗中，清除率達到29.92%，說明植物乳酸桿菌ATCC 8014蘆薈發酵液對自由基清除能力較弱；羥基自由基清除能力的測定實驗，清除率為50.60%，說明植物乳酸桿菌ATCC 8014蘆薈發酵液對羥基自由基清除能力較強J^Fe2+的螯合能力的測定中，螯合率為81.48%，說明植物乳酸桿菌ATCC 8014蘆薈發酵液對鐵離子的螯合能力較強；總還原力的測定實驗，數值為0.164，說明植物乳酸桿菌ATCC8014蘆薈發酵液具有一定還原力，但還原力較弱；在還原糖測定實驗中，根據標準曲線計算得出還原糖含量為28.35 mg/mL。
[0054]同時，我評價蘆薈發酵液對致病菌的拮抗能力，我們評價了蘆薈發酵液對幾種常見食源性致病菌的抑制效果。圖5、圖6結果表明，針對我們選用的八種致病菌:鼠傷寒、腸炎沙門、福氏志賀、大腸0157、單增ATCC、志賀301、金黃色葡萄球菌cowan 1、痤瘡丙酸桿菌，通過抑菌實驗我們發現植物乳酸桿菌ATCC 8014蘆薈發酵液對志賀301、金黃色葡萄球菌cowanl、痤瘡丙酸桿菌抑制效果最好；對鼠傷寒、福氏志賀、單曾ATCC效果次之；對腸炎沙門、大腸0157效果最差。
【權利要求】
1.一種植物乳酸桿菌ATCC 8014與蘆薈共發酵飲料的制備方法，其特征是: (1)蘆薈的選擇和制備:采選新鮮、飽滿、肉質肥厚的蘆薈葉片，剔除帶有病斑、軟腐的葉片，葉片均重30(T400 g;葉片采用75%酒精進行表面消毒，去除蘆薈葉表面皮層，采用榨汁機榨汁，分裝后，6000 rpm/min離心10 min,再次分裝,制成蘆薈原汁； (2)采用巴氏消毒法將蘆薈原汁滅菌，55°C處理30 min, 4 1:保存備用； (3)植物乳酸桿菌ATCC8014的活化 A從-80 1:冰箱取出植物乳酸桿菌ATCC 8014，按培養基體積的5%接種于5 mL MRS培養基中，于37 溫培養箱中培養過夜； B取過夜培養的植物乳酸桿菌ATCC 8014，按培養基體積的5%接種5 mL培養基中，二次活化； (4)發酵條件的設定 A、設定發酵溫度梯度分別為25°C、30 °C、37 °C、42 °C，在上述不同的發酵溫度條件下取5 mL蘆薈原汁，加入蘆薈原汁體積的10%脫脂乳和2%葡萄糖，植物乳酸桿菌ATCC8014接種量為蘆薈原汁體積的5%，發酵20 h，得到不同溫度條件下的蘆薈發酵液； B、取上述各蘆薈發酵液，加生理鹽水按11?16比例稀進行活菌計數，確定最佳發酵溫度; C、在最佳發酵溫度的條件下，設定蘆薈原汁PH梯度為3、4、5、6、7、8、9，在上述不同的PH條件下取5 mL蘆薈原汁，加入蘆薈原汁體積的10%脫脂乳和2%葡萄糖，植物乳酸桿菌ATCC 8014接種量為蘆薈原汁體積的5%，發酵20h，采用PH計調節PH ； D、取上述各蘆薈發酵液，加生理鹽水按11?16比例稀釋，取50μ L涂板，過夜培養，進行活菌計數，確定最佳發酵PH ； (5)最佳條件發酵及發酵后處理:在步驟4確定最佳PH和最佳溫度后，取5mL蘆薈原汁，加入蘆薈原汁體積的10%脫脂乳和2%葡萄糖，接種蘆薈原汁5%的植物乳酸桿菌ATCC8014，發酵48 h，10000 rpm/min離心10 min,重新分裝，獲得植物乳酸桿菌ATCC 8014蘆薈發酵液，4 °C保存備用。
2.根據權利要求1所述的一種植物乳酸桿菌ATCC8014與蘆薈共發酵飲料的制備方法，其特征是:所述蘆薈為庫拉索蘆薈。
【文檔編號】A23L2/38GK104382160SQ201410607551
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月3日 優先權日:2014年11月3日
【發明者】辛洪波, 王鑫, 陳廷濤 申請人:南昌大學