專利名稱：一種Bt蛋白Cry69Aa1、其編碼基因及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種Bt蛋白及其編碼基因和應用。
背景技術：
在人類生產過程中，蟲害是造成農業生產損失及影響人類健康的重要因素，據FAO 統計，全世界農業生產每年因蟲害造成的經濟損失高達14%，病害損失達12%，草害損失達11%。損失額高達1260億美元，相當于中國農業總產值的一半，英國的4倍多。另外， 蚊媒病在預防醫學中占有重要位置，其中登革熱和黃熱病等蚊媒病傳播力強、流行面廣、發病率高、危害性大。據WHO統計，全世界每年感染登革熱人數多達8000萬，我國的海南省在 1980和1986年曾經暴發過兩次登革熱，發病分別達到437469例和113589例。登革熱和黃熱病主要由埃及伊蚊傳播。為了減少這些損失，多年來，對農作物害蟲及蚊蟲普遍采用化學防治手段進行防治，但由于化學農藥的長期、大量使用，造成了對環境的污染，農副產品中農藥殘留量增加， 給人類的生存和健康帶來了危害。此外，化學農藥在殺滅害蟲的同時，也殺傷了天敵及其它有益物，破壞了生態平衡。與化學防治相比，生物防治具有安全、有效、持久的特點。并且避免了化學防治帶來的一系列問題。因此，生物防治技術成了人們研究的熱點。在生物殺蟲劑中，蘇云金芽孢桿菌是目前世界上用途最廣、產量最大的一類微生物殺蟲劑。蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是一種革蘭氏陽性細菌，它的分布極為廣泛，在芽孢形成的同時可形成具有殺蟲活性的由蛋白質組成的伴胞晶體，又名殺蟲晶體蛋白Gnsectididal crystal proteins，簡稱ICPs)，ICPs是由cry基因編碼的，對敏感昆蟲有強烈毒性，而對高等動物和人無毒性。近幾十年來，Bt已廣泛應用于控制多種鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等害蟲。此外，Bt還對膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目等多種害蟲及植物病原線蟲、螨類、原生動物有控害作用。目前在農田害蟲、森林害蟲及衛生害蟲的防治中Bt已成為化學合成農藥的有力替代品，Bt還是轉基因抗蟲工程植物重要的基因來源。自1981印f從菌株HD-I中克隆了第一個能表達殺蟲活性的基因以來 (Adang M. J et al，Gene，1985，36 (3) :289 300.)，人們已經分離克隆了 500 多種編碼殺蟲晶體蛋白的基因，根據編碼的氨基酸序列同源性它們被分別確定為不同的群、亞群、類和亞類(Crickmore N, et al. Microbiol Mol Biol Rev，1998，62 :807-813.)。一般而言， Cryl，Cry2和Cry9等毒蛋白對鱗翅目害蟲有效；其中研究的最多的是Cryl和Cry9類蛋白， 它們編碼的殺蟲晶體蛋白分子量為130-140kD，許多基因目前已被廣泛應用于植物的鱗翅目害蟲的防治(Kozie，Μ. G.，et al. Bio/Technology, 1993,11 :194-200 ；王飛，2001，碩士論文，南開大學·)°蘇云金芽胞桿菌以色列亞禾中(B. thuringiensis subsp. israelensis, 簡稱Bti)產生的毒素蛋白對蚊蟲具有很好殺蟲活性，被廣泛運用于蚊蟲的防治(Goldberg L J, et al. Mosqito News，37 :355-358.)。同時，Cyt蛋白具有溶細胞性，對某些Cry蛋白具有增效作用及延緩昆蟲的抗性(Wu, D.，et al. Mol. Microbiol. 13 :965-972.)。
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自本世紀初發現蘇云金芽胞桿菌至今已有100多年的歷史，在農作物和園藝植物害蟲、森林害蟲以及衛生害蟲的防治方面得到廣泛的應用，也起到良好的效果。但是，由于大規模和反復使用蘇云金芽胞桿菌，許多昆蟲種群已相繼在不同程度上對殺蟲晶體蛋白產生了抗性。以Bt殺蟲晶體蛋白為基礎的殺蟲劑的使用已有50多年的歷史，最初一直沒有檢測到昆蟲對Bt的抗性，但是，上世紀80年中期開始，抗性問題不斷在實驗室及田間試驗中得到證實(McGaughey, W. H. 1985. Science. 229 :193-195)，原因主要是持續使用單品種及亞致劑量的Bt以及Bt轉基因抗蟲植物的應用造成昆蟲種群長期受到殺蟲劑的選擇壓力。 1985 年，McGaughey 報道倉庫谷物害蟲印度谷螟(Plodia interpunctella)在 Dipel (Bt subsp. kurstaik HD-I的商品制劑)的選擇壓力下，繁殖15代后，抗性增加97倍；在高劑量選擇壓力下，抗性可增加250倍。1990年，在夏威夷首次證實大田中的小菜蛾對Bt 殺蟲劑產生了明顯的抗性(Tabashnik，B. Ε.，et al. 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91 4120-4124)，上世紀90年代以來，在我國應用Bt殺蟲劑時間較長的深圳、廣州、上海等地， 發現Bt殺蟲劑對小菜蛾防治效果明顯下降，意味著抗性已經形成(馮夏.1996.昆蟲學報， 39(3) =238-244 ’)。目前發現在實驗室及田間至少有十幾種昆蟲對Bt及其殺蟲晶體蛋白產生了抗性，用選擇壓力數學模型預測到，在Bt轉基因抗蟲植物選擇壓力的條件下，昆蟲將會產生抗性(Schn印f，Ε.，et al. Mol. Biol. Rev. 65(3) :775-806)。另外，有研究證明 Bti 在大田的使用中尚未發現抗性問題(Regis L，et al. ,2000. Instituto Oswaldo Cruz,95 207-210.)，但是蚊蟲對其抗性問題不斷在實驗室中得到證實，這種情況也可能會在大田中出現(Georghiou G P, and Wirth M C, 1997. Applied and Environmental Microbiology, 63 :1095-1101.)。為避免抗性昆蟲所造成的損失，尋找新的高毒力基因資源是解決這個問題的有效途徑，這對我國的生物防治有著十分重要的意義。
發明內容
本發明的第一個目的在于針對上述不足提供一種新的Bt毒力蛋白資源。本發明的另一個目的在于提供編碼所述蛋白的基因。本發明的再一個目的在于提供上述蛋白及基因的應用。本發明從四川省沐川原始森林地區土壤中分離得到的蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)新菌株此觀。該菌株已于2008年10月21日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區大屯路甲3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)，保藏號為CGMCC No. 2719。(該菌株的保藏證明及其保藏號已經在專利號為200910078894. 5專利上公開)通過對Μα8的毒力測試表明，Μα8對鱗翅目害蟲、雙翅目害蟲等等，均具有極高的毒力。從MC^S基因組及質粒測序結果中發現該菌株存在一個新的cry基因，進一步設計其全長基因引物，克隆得到cry69Aal基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 1所示，全長為3651bp，分析表明，GC含量為38. 07%，編碼1216個氨基酸組成的蛋白。經測定，其氨基酸序列如 SEQ ID No. 2 所示。在 softberry 網站采用 bacterial sigma 7. Opromoter 程序對全序列進行預測表明，在基因編碼區上游含有RNA聚合酶活化位點的序列，將其命名為 cry69Aal。Cry69Aal蛋白的氨基酸組成如表1。
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表1 Cry69Aal蛋白的氨基酸組成
權利要求
1.一種Bt蛋白Cry69Aal，其氨基酸序列是1)SEQID No. 2所示的氨基酸序列；或2)SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列經取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸且具有同等活性的氨基酸序列。
2.編碼權利要求1所述蛋白的基因。
3.如權利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQID No. 1所示。
4.含有權利要求2或3所述基因的表達載體。
5.由權利要求4所述表達載體轉化的宿主細胞。
6.如權利要求5所述的宿主細胞為植物宿主細胞。
7.含有權利要求1所述蛋白的殺蟲劑。
8.權利要求1所述蛋白在植物育種中的應用。
9.權利要求1所述蛋白在培育轉基因植物中的應用。
10.如權利要求9所述的應用，其特征在于，所述轉基因植物為農作物。
全文摘要
本發明提供了一種新的Bt蛋白Cry69Aa1及其編碼基因，所述蛋白具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列經取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸且具有同等活性的氨基酸序列。本發明蛋白可以用于制備Bt殺蟲劑，所述基因可以轉化棉花、玉米、水稻、蔬菜等農作物，使其具備相應的抗蟲活性，從而降低農藥的使用量，減少環境污染，具有重要的經濟價值和應用前景。
文檔編號C12N15/32GK102408474SQ20111040367
公開日2012年4月11日 申請日期2011年12月7日 優先權日2011年12月7日
發明者關鵬, 朱軍, 李雙成, 李平, 王世全, 鄧其明, 鄭愛萍 申請人:四川農業大學