專利名稱：一種約氏乳桿菌及其制劑與應用的制作方法
一種約氏乳桿菌及其制劑與應用
技術領域：
本發明屬微生物領域，特別涉及一種約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)ZLJOlO菌株及其制劑在畜禽微生物飼料添加劑中的應用。
背景技術：
在養豬生產中，母豬占有很重要的地位，母豬的健康狀況和繁殖性能直接影響豬場的生產水平和經濟效益。有資料分析，每頭母豬年提供仔豬的數量越多，仔豬分攤的母豬生產成本就越低，年提供16頭仔豬的生產成本，要比提供22頭仔豬的多52%。因此，通過技術創新，提高母豬的繁殖性能具有重要意義。若有針對性地研發出高效益生菌制劑，調控好母豬腸道菌群平衡，促進飼料營養的吸收和新陳代謝，減少糞便中有害菌的排出量，就有可能提高胎兒及哺乳仔豬的成活率和增重速度，從而提高母豬的窩產仔數、窩斷奶頭數及斷 奶窩重等繁殖指標。但目前國內外關于益生菌的研究與應用多集中在仔豬上，很少見在母豬上的研究與報道。而實際生產中，母豬承擔著復雜而繁重的繁殖仔豬任務，再加之當前的集約化飼養方式限制了母豬的自由活動，很容易引起母豬腸道菌群失調、免疫力下降、體況變差、出現便秘和厭食等情況，嚴重者還影響母豬下一個繁殖周期的生產；另外，新生仔豬通過母豬產道、采食母乳、環境接觸等在腸道內定植多種菌群，如果母豬腸道菌群失調，會有大量的有害菌隨糞便排出，這就增加了仔豬接觸有害菌的幾率，進而影響哺乳仔豬的身體健康和增重速度。約氏乳桿菌(Lactobacillusjohnsonii )是乳酸桿菌屬(Lactobacillus)中的種群之一，是安全級(generally regarded as safe, GRAS)的有益菌。張鳳華等從小雞腸道中分離出一株約氏乳桿菌(HN/0711)，但沒有報道其特性；孫曉雯等從豬糞中分離到一株約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii SunOOl),發現該菌在ρΗ2· 5的模擬胃液中處理3h，存活率僅為68. 8% ;苗玉和等從仔豬腸道中分離到一株約氏乳桿菌(LY7株)，發現該菌在37°C、pH 5. 7、接種量2%、培養18h后的活菌數達到4. 7X108CFU/mL ;申請號為201110416416. 8，發明名稱為約氏乳桿菌及其菌劑、應用和預混料中公開了以約氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌、短小芽孢桿菌制成的混合菌劑在仔豬飼養中的應用。顯然這些研究還是初步的，如何制備出能夠在母豬養殖生產中效果好且使用方便的益生菌制劑，尚需要進一步研究。
發明內容本發明針對母豬飼喂，提供了一種可培養、生長好，且具有較強的產酸、耐酸、耐熱及具有抑菌作用的約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)ZLJO10,同時對其培養基、凍干制劑和生產工藝進行優化。本發明提供了一種約氏乳桿菌ZLJ010菌株，其微生物保藏編號為=CGMCCNo.5762。
所述約氏乳桿菌ZLJ010具有以下特性①在35°C下培養16h后，進入生長穩定期；②在35 °C下培養30h后，pH達到3. 85 ;③在人工胃液及人工腸液中處理2 4h，活菌數在109CFU/mL以上；④在65°C下處理30 60s，存活率在70. 9%以上。約氏乳桿菌ZLJ010在制備抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌藥物或試劑中的用途。
約氏乳桿菌ZLJ010的培養基蔗糖20g、大豆蛋白胨20g、牛肉膏20g、酵母浸粉7. 5g、無水乙酸鈉5g、檸檬酸氫二銨 2g,K2HPO4 *3H20 2g、MgS04 ·7Η20 O. 58g、MnS04 .H2O O. 19g、吐溫 _801mL、蒸餾水 IOOOmL0一種約氏乳桿菌凍干制劑，包括約氏乳桿菌ZLJ010和凍干保護劑。所述約氏乳桿菌凍干制劑的優化方案為脫脂乳15. 70g、海藻糖7. 68g、L-半胱氨酸I. 60g、乳糖4g、L-賴氨酸O. 5g、谷氨酸鈉lg、糊精5g、甘油lmL、蒸懼水100mL。約氏乳桿菌凍干制劑的制備方法，包括如下工藝步驟①菌種活化將于_70°C下保存的約氏乳桿菌ZLJ010以1%的接種量接種于液體培養基中，在35°C下培養18h后，為一級種子液；一級種子液再以1%的接種量接種于液體培養基中，于35°C下培養18h，為二級種子液，待用；②擴大培養將約氏乳桿菌ZLJ010的二級種子液以1%的接種量接種，在35°C下培養22h ；③離心離心分離步驟②中擴大培養制得的發酵液，得到菌泥；④乳化將保護劑和菌泥混合均勻，采用高剪切分散乳化機乳化20min，制成菌懸液；⑤真空冷凍干燥乳化后的菌懸液先預凍2h，然后在冷凝溫度為_50°C、真空度9Pa的條件下真空冷凍干燥20h，得凍干粉；⑥凍干制劑定時收取凍干粉，粉碎、分裝，鋁箔袋真空貯藏。約氏乳桿菌ZLJ010在制備動物飼料添加物、動物用醫療組合物中的應用。本發明提供的約氏乳桿菌ZLJ010具有以下特性①可培養、生長好在35°C下培養16h后，進入生長穩定期；培養30h后，pH達到3. 85 ；②耐酸在人工胃液及人工腸液中處理2 4h，活菌數在109CFU/mL以上；③耐熱在65°C下處理30 60s，存活率在70. 9%以上；④抑菌作用對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌具有抑制作用。本發明提供的約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii),保藏名稱為約氏乳桿菌ZLJ010，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，地址北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵政編碼100101，保藏編號為CGMCC No. 5762 ;保藏日期為2012年02月16日，菌種名稱為:約氏乳桿菌Lactobacillusjohnsonii,生物保藏存活信息存活。本發明優化了約氏乳桿菌ZLJ010的培養基配方蔗糖20g、大豆蛋白胨20g、牛肉膏20g、酵母浸粉7. 5g、無水乙酸鈉5g、檸檬酸氫二銨2g、K2HPO4 · 3H202g、MgS04 · 7H20O. 58g、MnSO4 · H2O 0. 19g、吐溫_801mL、蒸餾水1000mL。利用該培養基配方，可使該菌的培養效率大幅提高，活菌數不低于2. OX 109CFU/mL，是普通培養基效果的3 4倍。本發明還篩選出了約氏乳桿菌ZLJ010的最優凍干保護劑配方脫脂乳15. 70g、海藻糖7. 68g、L-半胱氨酸I. 60g、乳糖4g、L-賴氨酸O. 5g、谷氨酸鈉lg、糊精5g、甘油lmL、蒸餾水100mL。利用該保護劑配方，可使該菌的凍干存活率達到87%以上，凍干粉活菌數達到6. OX 109CFU/g以上，是普通凍干保護劑效果的5 8倍。減少了約氏乳桿菌的凍干損失，提高了凍干粉的活菌數，降低了菌劑的單位生產成本。在母豬懷孕90d至母豬哺乳25d斷奶這個特殊的生理階段，在日糧(粉料)中添加約氏乳桿菌ZLJ010凍干制劑，使日糧中的活菌數達到6. OX 109CFU/kg，母豬的窩產活仔數提高了 7. 71% (0.81頭)，窩斷奶仔豬數提高了 9. 33% (0. 88頭)，活仔率提高了 3個百分點，仔豬25d斷奶個體重提高了 0. 14kg，母豬的便秘率下降，母豬糞便中的有害細菌數量大幅度下降，其中大腸桿菌數量下降了 54. 67%，金黃色葡萄球菌數量下降了 35. 91%，母豬的血清IgG含量提高了 14. 68%，母豬血清中的結合珠蛋白水平降低了 11. 29%，飼喂約氏乳桿菌 制劑后，改善了母豬的健康狀況，有利于繁殖潛能的發揮。在母豬妊娠后期和哺乳期日糧中添加約氏乳桿菌制劑后，母豬的腸道健康改善，糞便中有害菌數量下降，機體免疫力提升，母豬生產能力提高，有利于豬場生產成本的降低和生廣效益的提聞。
圖I約氏乳桿菌ZLJ010菌體及菌落圖片，圖Ia為MRS培養基，于37°C下，培養48h后的菌體形態(革蘭氏染色)，圖Ib為MRS培養基，于37°C下，培養48h后的菌落形態；圖2約氏乳桿菌ZLJ010培養過程OD6tltol變化曲線；圖3約氏乳桿菌ZLJ010培養過程pH變化曲線。
具體實施方式實施例I分離、篩選與鑒定豬源約氏乳桿菌ZLJ010從北京某標準化種豬場內，采集健康的妊娠后期和哺乳期母豬新鮮糞便，放入無菌袋中，立刻用冷藏盒帶回實驗室。稱取Ig糞樣加入已滅菌的99mL無菌生理鹽水中，混勻。取ImL懸液，用無菌生理鹽水分別稀釋為10-5、10-6、10_7，各取0. ImL分別涂布于MRS固體培養基、SL固體培養基和LBS固體培養基上，37°C厭氧培養。48h后挑取疑似乳桿菌的乳白色菌落，進行厭氧純培養。48h后，挑取半個培養后的菌落進行H2O2酶試驗和革蘭氏染色鏡檢，凡是革蘭氏染色陽性、H2O2酶試驗陰性、菌體形態為桿狀的菌株可初步確定為乳桿菌。然后將剩下的半個菌落進行劃線培養，直至確定為純菌，然后對分離得到的116株菌進行分類編號，并進行冷凍保存。對分離得到的116株菌，通過產酸、耐酸和耐膽鹽試驗，篩選出了綜合特性最好的一株乳桿菌，送到中國微生物菌種保存中心進行鑒定。中國工業微生物菌種保藏管理中心對該菌株進行了形態學特征、生理生化特征和PheS基因序列系統發育分析，鑒定為約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)。該菌株的理化特征見表1，DNA序列見序列表I。
菌株的菌體和菌落形態見圖I。在MRS固體培養基上，該菌菌落呈乳白色、不規則、凸起、濕潤、液滴狀、不透明、邊緣不整齊。菌體呈桿狀，O. 68X1. 46 3. 65 μ m，單個、成對或成鏈狀排列；革蘭氏染色陽性。表I約氏乳桿菌ZLJ010的生理生化特征
試驗項目結果試驗項目結果試驗項目結果試驗項冃結果
苦杏仁苷- 阿拉伯糖 - 纖維二糖 - 七葉靈-
果糖- 半乳糖- 葡萄糖+ 葡萄糖酸鈉 -
乳糖- 麥芽糖+ y'露醇-露糖- 松三糖- 蜜二糖- 棉子糖+w 鼠李糖-
核糖- 水楊苷- 山梨醇- 蔗糖+w
海藻糖- 木糖-注表中“ + ”表示彡90%菌株陽性，表示彡90%菌株陰性，“+w”表示偏陽性。菌種ZLJ010保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏信息如下菌株名稱約氏乳桿菌Lactobacillus johnsonii保藏名稱約氏乳桿菌ZLJ010保藏日期2012年02月16日生物保藏存活信息存活保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏地址北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所郵政編碼100101保藏編號CGMCCNo. 5762實施例2測定約氏乳桿菌ZLJ010的生物特性2. I生長曲線采用OD6tltlm^P pH值為指標，測定了約氏乳桿菌ZLJ010的生長特性。結果見圖2約氏乳桿菌ZLJ010培養過程OD6tltlnm變化曲線，圖3約氏乳桿菌ZLJ010培養過程pH變化曲線。由圖2、圖3可知，約氏乳桿菌ZLJO10在4 12h期間，菌液OD6tltlnm值迅速增加，pH值迅速下降；12 16h期間，菌液OD6ticin^P pH值變化逐漸減小，說明已經達到對數生長末期；16h以后OD6tltlnm和pH值變化不明顯，表明該菌進入了生長穩定期。2. 2耐酸性試驗2.2. I人工胃液的配制氯化鈉O. 2g、胃蛋白酶lg，用pH2. O或pH3. O的稀鹽酸溶液IOOmL充分溶解后，用微孔濾膜過濾除菌，待用。2. 2. 2將約氏乳桿菌ZLJ010接種于本發明的液體培養基中，35°C培養24h，取3mL菌液，10000r/min離心5min，棄上清液，分別加入已滅菌的含有生理鹽水(pH 6. 5)和已過濾除菌的不同PH的人工胃液3mL，37°C保溫，在0h、2h、4h取樣進行平板菌落計數，結果見表20表2約氏乳桿菌ZLJ010對人工胃液耐受性結果(lg CFU/mL)
pHOh2h 4h
2.09.239.139.02
3.09.259.169.08 6.59.229.19 9.丨 2由表2可知，約氏乳桿菌ZLJ010在pH2. O和pH3. O的人工胃液中，存活率較高，作用2h和4h后，活菌數可保持在109CFU/mL以上。說明約氏乳桿菌ZLJ010有較強的耐酸性，能適應動物的胃酸環境。2. 3耐人工腸液試驗2. 3. I人工腸液的配制磷酸二氫鉀O. 68g，加蒸餾水溶解，用O. 4%的氫氧化鈉溶液調節pH值,至體積為IOOmL,pH6. 8。然后加Ig胰蛋白酶，充分溶解后用微孔濾膜過濾除菌，待用。2. 3. 2將約氏乳桿菌ZLJ010接種于本發明的液體培養基中，35°C培養24h，取3mL菌液，10000r/min,離心5min，棄上清，分別加入已滅菌的含有生理鹽水和已過濾除菌的人工腸液(PH6. 8)中，37°C保溫，在0h、2h、4h取樣進行平板菌落計數，結果見表3。表3約氏乳桿菌ZLJOlO對人工腸液耐受性結果(Ig CFU/mL)
處理Oh2h4h
人工腸液9.249.229.24
生理鹽水9 229.199.12由表3可知，約氏乳桿菌ZLJOlO在人工腸液中作用，其活菌數沒有顯著變化，活菌數超過109CFU/mL，說明約氏乳桿菌ZLJOlO不受人工腸液的影響，能適應動物的腸道環境。2. 4耐熱試驗約氏乳桿菌ZLJOlO在65°C條件下保持30s、40s、50s和60s時，存活率為87. 42%、85. 87%、81%和 70. 9% ;在701條件下作用 30s、40s、50s 和 60s 時，存活率為 38. 95%, 27. 79%、7. 34%和4. 77% ;在80°C條件下作用30s，其活性僅有O. 1%。由存活率來看，外界溫度65°C時，短時間內對該約氏乳桿菌的損傷較小，而70°C以上對該菌損傷較大。2. 5抑菌試驗采用牛津杯法進行抑菌試驗，發現該約氏乳桿菌ZLJOlO的發酵液對106CFU/mL活性的有害菌——大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌有較強的抑制作用，抑菌圈直徑分別達到 20. 1mm、18. 7mm 和 16. Omm。實施例3制備約氏乳桿菌制劑乳酸菌制劑以凍干粉的形式添加到豬的日糧中，效果好且方便，一則因為凍干狀態的乳酸菌制劑便于儲藏，活性穩定；二則因為固態的制劑便于向飼料中添加，利于混合均勻。而在凍干制劑的生產過程中，培養基配方、凍干保護劑以及凍干工藝是三個重要技術環節，直接影響生產過程中的活菌存活率、凍干制劑活菌數以及單位生產成本。本發明對這三個技術環節進行了技術改進，取得了顯著效果。3. I改進約氏乳桿菌ZLJ010的培養基針對約氏乳桿菌ZLJ010的生物學特性，以MRS培養基為基礎配方，采用正交試驗設計L16(45)法，對其中的蔗糖、大豆蛋白胨、酵母浸粉和牛肉膏用量進行了優化篩選。最終篩選出效果最佳的培養基配方為鹿糖20g、大豆蛋白胨20g、牛肉膏20g、酵母浸粉7. 5g、無水乙酸鈉 5g、檸檬酸氫二銨 2g、K2HPO4 · 3H20 2g、MgSO4 · 7H20 0. 58g、MnSO4 · H2O 0. 19g、吐溫-801mL、蒸餾水1000mL。將以上成分混合，加熱溶解，校正pH6. 5，分裝，121°C高壓滅菌15min。用此培養基培養的約氏乳桿菌，活菌數不低于2. 0X109CFU/mL，是普通培養基效果的3 4倍。3. 2優化約氏乳桿菌ZLJ010的凍干保護劑
采用響應曲面法，對約氏乳桿菌凍干粉的凍干保護劑成分進行了優化。用Plackett-Burman設計,發現脫脂乳、海藻糖和L-半胱氨酸等物質對約氏乳桿菌ZLJ010的存活率有影響顯著，利用最陡爬坡法逼近最大響應區域，由中心組合設計和響應面法分析確定最優凍干保護劑的復配比例，即脫脂乳15. 70g、海藻糖7. 68g、L-半胱氨酸I. 60g、乳糖4g、L-賴氨酸0.5g、谷氨酸鈉lg、糊精5g、甘油lmL、蒸餾水100mL。用該配方，可使約氏乳桿菌ZLJ010的凍干存活率達到87%以上，凍干粉活菌數達到6. OX 109CFU/g以上，是普通凍干保護劑效果的5 8倍。3. 3優化約氏乳桿菌ZLJ010的凍干工藝①菌種活化將于_70°C下保存的ZLJ010菌種以1%的接種量接種于50mL培養基中，于35°C下培養18h，為一級種子液；一級種子液再以1%的接種量接種于3瓶400mL的液體培養基中，在35°C下培養18h，為二級種子液，待用；②擴大培養配制45L液體培養基，分裝于三角瓶中，高壓滅菌；將約氏乳桿菌ZLJ010 二級種子液，以1%的接種量分別接種于每個三角瓶中，于35°C下培養22h ；或者配制30L液體培養基，裝入發酵罐中，高壓滅菌，將約氏乳桿菌ZLJ010 二級種子液以1%的接種量接種，35°C下培養22h ；③離心在19000pm條件下以管式離心機分離步驟②中制得的發酵液，得到菌泥；④乳化將保護劑和菌泥混合均勻，采用高剪切分散乳化機以4000rpm/min,乳化20min ；⑤真空冷凍干燥乳化好的菌懸液先預凍2h，然后在冷凝溫度為_50°C、真空度9Pa的條件下真空冷凍干燥，時間為20h，得凍干粉；⑥凍干制劑定時收取凍干粉，粉碎、分裝，鋁箔袋真空貯藏。3. 4約氏乳桿菌ZLJ010凍干制劑的耐酸和耐膽鹽試驗在225mL的人工胃液(ρΗ2· 0)中和225mL的豬膽鹽溶液(0. 3%)中，分別加入25g的約氏乳桿菌ZLJ010凍干制劑，混合均勻，37°C保溫，在0h、2h、4h和6h時，分別取樣進行平板菌落計數，結果見表4。表4約氏乳桿菌ZLJ010凍干制劑耐酸、耐膽鹽試驗結果(Ig CFU/mL)
處理Oh2h41i6h
pH2.0 人工胃液9.799.749.679.62
0.3% 豬膽鹽溶液9.789.699.629.54由表4可見，在2 6h內，約氏乳桿菌ZLJ010凍干制劑在人工胃液(pH2. O)或豬膽鹽溶液(O. 3%)中的活菌數沒有顯著變化，均在109CFU/mL以上，說明約氏乳桿菌ZLJ010凍干制劑具有耐酸和耐膽鹽特性，能適應動物的胃腸道環境。3. 5約氏乳桿菌ZLJ010凍干制劑的安全性檢驗 將約氏乳桿菌ZLJ010凍干制劑送至農業部獸藥安全監督檢驗測試中心(北京)進行了安全性檢驗，經大鼠、小鼠經口急性毒性試驗，結果證明豬源約氏乳桿菌凍干制劑對于大鼠、小鼠經口 LD5tl大于5000mg/kg體重，說明豬源約氏乳桿菌ZLJ010凍干制劑是安全的，可以用于動物飼喂。實施例4約氏乳桿菌ZLJ010制劑對母豬健康及生產力的影響4. I試驗材料與方法試驗在北京某種豬場進行。試驗期母豬妊娠第90d至母豬哺乳25d斷奶這個特殊的生理階段。選擇健康且體況、胎次、預產期相近的妊娠后期大白豬母豬32頭，隨機分成2個組(對照組和試驗組)，每組16個重復，每個重復I頭母豬。妊娠后期母豬采用限位欄飼養，每頭每日飼喂飼料量3. 5kg，每天7:00和14:00飼喂兩次，自由飲水；母豬預產期前一周進入產房，產房為高床、漏縫式地板，室內溫度18 22°C，仔豬采用保溫箱保暖，仔豬哺乳25d后斷奶。母豬產仔后的前3d采用限制飼養，分別喂以2. O、2. 5和3. Okg/d飼料，3d后自由采食(以吃飽后料槽中略有剩料為準)，日喂2次(5:30、13:30)，母豬和仔豬均采用鴨嘴式飲水器自由飲水，免疫程序按常規進行。對照組飼喂基礎日糧；試驗組在基礎日糧中添加約氏乳桿菌ZLJ010凍干粉，混合均勻，使每千克飼料中有效活菌數達到6. OX 109CFU。日糧的組成及營養水平見表5。表5母豬妊娠后期和泌乳期日糧組成及營養水平(風干基礎)項目妊娠后期哺乳期
玉米67
雙低菜粕7-
苜蓿4-
豆油-3
妊娠母豬濃縮料22-
哺乳母豬濃縮料-30
介 U·IOL100 營養水平
消化能 MJ/kg)13.0113.74
粗蛋d質(％)14.3418.33
I 0.911.04
總磷0.440.48
賴氨酸0.720.96
蛋氨酸+胱氨酸0.380.56注1)妊娠母豬濃縮料為每千克飼料提供Cu 6mg ；Fe IOOmg ；Zn 80mg ；Mn 20mg ；SeO.3mg ；I 0. 3mg ；VA 4000IU ；VD3 500IU ；VE 60IU ；VK Img ^B1 Img ；VB2 4mg ；VB6 Img；VB12 0. 02mg ;生物素 0. 2mg ;葉酸 I. 5mg ;煙酸 12mg ;泛酸 12mg。2)哺乳母豬濃縮料為每千克飼料提供Cu IOmg ；Fe 120mg ；Zn IOOmg ；Mn 25mg ；I0. 5mg ；Se 0. 3mg ；VA 8000IU ；VD3 1000IU ；VE 75IU ；VK I. 5mg !VB1 Img ；VB2 4mg ；VB6 2mg ；VB12 0. 02mg ;生物素 0. 5mg ;葉酸 3. Omg ;煙酸 15mg ;泛酸 12mg。3)粗蛋白質、鈣、總磷和賴氨酸為實測值，其它營養水平數據為計算值。4. 2試驗結果母豬窩產活仔數、仔豬出生重、活仔率、斷奶育成率和平均日增重是反映母豬生產能力的重要指標。試驗結果見表6、表7。表6飼糧中添加約氏乳桿菌制劑對母豬生產力的影響
項目試驗組對照組
母豬頭數(頭)1616
權利要求
1.一種約氏乳桿菌Lactobacillus johnsonii ZLJOlO菌株,其微生物保藏編號為CGMCCNo. 5762。
2.如權利要求I所述的一種約氏乳桿菌，其特征在于所述約氏乳桿菌ZLJ010 ①在35°C下培養16h后，進入生長穩定期； ②在35°C下培養30h后，pH達到3.85 ； ③在人工腸液及人工胃液中處理2 4h，活菌數在109CFU/mL以上； ④在65°C下處理30 60s，存活率在70.9%以上。
3.如權利要求I所述的一種約氏乳桿菌，在制備抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌藥物或試劑中的用途。
4.一種如權利要求I 2任一所述的約氏乳桿菌的培養基,其特征在于 蔗糖20g、大豆蛋白胨20g、牛肉膏20g、酵母浸粉7. 5g、無水乙酸鈉5g、檸檬酸氫二銨2g、K2HPO4 · 3H20 2g、MgSO4 · 7H20 0. 58g、MnSO4 · H2O 0. 19g、吐溫-80 lmL、蒸餾水 IOOOmL0
5.一種約氏乳桿菌凍干制劑，包括約氏乳桿菌ZLJ010和凍干保護劑。
6.如權利要求5所述的約氏乳桿菌凍干制劑，其特征在于所述的凍干保護劑的優化方案為脫脂乳15. 70g、海藻糖7. 68g、L-半胱氨酸I. 60g、乳糖4g、L_賴氨酸O. 5g、谷氨酸鈉lg、糊精5g、甘油lmL、蒸懼水100mL。
7.—種如權利要求5所述的約氏乳桿菌凍干制劑的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括如下工藝步驟 ①菌種活化將于_70°C下保存的約氏乳桿菌ZLJ010以1%的接種量接種于液體培養基中，在35°C下培養18h后，為一級種子液；一級種子液再以1%的接種量接種于液體培養基中，于35°C下培養18h，為二級種子液，待用； ②擴大培養將約氏乳桿菌ZLJ010的二級種子液以1%的接種量接種，于35°C下培養22h ； ③離心離心分離步驟②中制備的發酵液，得到菌泥； ④乳化將保護劑和菌泥混合均勻，采用高剪切分散乳化機乳化20min，得到菌懸液； ⑤真空冷凍干燥乳化后的菌懸液先預凍2h，然后在冷凝溫度為-50°C、真空度9Pa的條件下真空冷凍干燥20h，得凍干粉； ⑥凍干制劑定時收取凍干粉，粉碎、分裝，鋁箔袋真空貯藏。
8.如權利要求I所述的約氏乳桿菌在制備動物飼料添加物、動物用醫療組合物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種約氏乳桿菌及其制劑和用途，還公開了本發明菌株的優化培養基及菌株凍干制劑的制備方法。本發明的約氏乳桿菌ZLJ010的微生物保藏編號為CGMCC No.5762。本發明菌株遺傳基礎明確，具有生長好、產酸、耐酸、耐熱和抑菌能力強的特性。本發明菌株凍干制劑作為母豬的飼料添加劑，可以改善母豬的腸道健康，降低糞便中有害菌數量，提高機體的免疫力，提高母豬的生產性能。
文檔編號C12R1/225GK102839136SQ201210166750
公開日2012年12月26日 申請日期2012年5月25日 優先權日2012年5月25日 公開號201210166750.發明者季海峰, 王四新, 劉輝, 張董燕, 王晶, 王雅民 申請人:北京市農林科學院