骨形成蛋白-2的制備方法

專利名稱：骨形成蛋白-2的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2 ；BMP-2)的制備方法，特別地，本發明涉及藉由改變培養基成分來増加骨形成蛋白_2的產量。
背景技術：
骨形成蛋白，簡稱BMPs，為骨基質中的糖蛋白聚勝肽，其包含雙硫鍵結構。骨形成蛋白的分子量介于26，000-32，000，屬于生長因子家族，且彼此具有類似的結構及功能。迄今為止，已發現43種骨形成蛋白。骨形成蛋白為ー種區域性的生長因子，可単獨促進骨組織的形成，促使未分化間葉細胞(mesenchymal cells)進入軟骨及骨。骨形成蛋白具有各種促進骨生成的能力。

BMPs的能力不限于骨生成，在其它組織，例如腦及腎臟也可發現高濃度的BMPs。已有相關文獻揭露BMPs在發生及分化上可能也扮演重要的角色(Wall，N.A. , Blessing, M. , Wright, C. V. E. , and Hogan, B. L. M. , J Cell Biol.，120:493-502 (1993);Ozkaynak, E. , Schnegelsberg, P. N. J. , Jin, D. F. , Clifford, G. M. , Warren, F. D. , Drier, E.A. , and Oppermann, H. , J. Biol. Chem. , 267: 25220-25227 (1992) ; Lyons, K. M. , Jones, C.M. , and Hogan, B. L. M. , Trends in Genetics, 7:408-412 (1991))。目前，BMPs 已被證實可促進神經細胞分化(Basler, K. , Edlund, T. , Jessell, T. M. , and Yamada, T. , Cell, 73:687-702(1993) ;Paralkar, V. M. , Weeks, B. S. , Yu, Y. M. , Kleinman, H. K.，and Reddi1A. H.，J. CellBiol.，119:1721-1728(1992))。在整個BMP家族中，BMP-2具有廣泛的骨生成能力，且被研究的最為透徹。具有骨生成活性的重組人類BMP-2已被證明具有安全性，可應用于骨的治療及再生。BMP-2的應用對傳統骨科、整型外科、牙周和顱面重建手術產生重大的影響。目前獲得BMP-2的方法主要有ニ種，分別為由脫I丐皮質骨(demineralized cortical bone)萃取BMP-2蛋白，和利用表達系統表達重組BMP-2蛋白。由骨組織分離BMP-2蛋白的方法需要大量的骨組織且產量非常低，每40kg的牛骨粉僅可獲得約 40 ii g 的 BMP 混合物(ffozney etal.，Science 242 (1988)，1528-1534)。再者，若由人骨組織分離BMP-2蛋白，會產生道徳上的問題，且會有致病源污染的風險(賈庫氏癥、HCV等)。同樣，由豬或牛分離BMP同源蛋白也會產生類似的污染風險。因此，目前主要是通過表達重組BMP-2來獲得BMP-2蛋白，表達方法包括真核表達系統及原核表達系統。原核表達系統的優點為操作簡單、成本低，且可獲得較高的產量。相對于真核表達系統，原核細胞無法表達正確的BMP-2前驅物，因此難以形成成熟的BMP-2蛋白。真核表達系統的缺點為需要較高的技術且產量較低。雖然真核表達系統可產生具活性的BMP-2蛋白，但真核表達系統的產量極低。先前有文獻指出添加低分子量(5，OOOMw)及高分子量(500，OOOMw)的硫酸葡聚糖可增加BMP-2蛋白的產量，但其產量仍顯不足。因此業界亟需ー種可增加BMP產量的方法。

發明內容
本發明提供了ー種骨形成蛋白-2的制備方法，所述方法包括提供一含有骨形成蛋白_2基因的細胞株，將該細胞株培養于培養基中，其中所述培養基包含硫酸葡聚糖和/或肌肽。為了讓本發明的上述和其它目的、特征和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，并配合所附圖示，對本發明作詳細說明。


圖I顯示硫酸葡聚糖分子量與濃度對BMP-2蛋白產量的影響。圖2顯示分子量為6，500-10, 000MW或12，000MW的硫酸葡聚糖濃度對BMP-2蛋白
產量的影響。圖3a顯示肌肽濃度(10-30mM)對細胞密度的影響。圖3b顯示肌肽濃度(10-30mM)對細胞存活的影響。圖3c顯示肌肽濃度(10-30mM)對BMP-2產量的影響。圖4a顯示肌肽濃度(30_50mM)對細胞密度的影響。圖4b顯示肌肽濃度(30_50mM)對細胞存活的影響。圖4c顯示肌肽濃度(30-50mM)對BMP-2產量的影響。圖5a顯示硫酸葡聚糖(100-500 ii g/ml)與肌肽(30mM)對細胞密度的影響。圖5b顯示硫酸葡聚糖(100-500 u g/ml)與肌肽(30mM)對細胞存活的影響。圖5c顯示硫酸葡聚糖(100-500 U g/ml)與肌肽(30mM)對BMP-2產量的影響。圖6a顯示硫酸葡聚糖(500 U g/ml)與肌肽(10-30mM)對細胞密度的影響。圖6b顯示硫酸葡聚糖(500li g/ml)與肌肽(10_30mM)對細胞存活的影響。圖6c顯示硫酸葡聚糖(500 u g/ml)與肌肽(10-30mM)對BMP-2產量的影響。圖7a顯示丙氨酸與組氨酸(10-50mM)對細胞密度的影響。圖7b顯示丙氨酸與組氨酸(10-50mM)對細胞存活的影響。圖7c顯示丙氨酸與組氨酸(10-50mM)對BMP-2產量的影響。圖7d顯示丙氨酸與組氨酸(100-200mM)對細胞存活的影響。圖7e顯示丙氨酸與組氨酸(100-200mM)對細胞密度的影響。
具體實施例方式本發明提供ー種骨形成蛋白-2的制備方法，所述方法包括提供一含有骨形成蛋白_2基因的細胞株，將此細胞株于適當的條件下培養于培養基中，其中所述培養基包含硫酸葡聚糖和/或肌肽。本發明所述“細胞株”指任何用于蛋白質表達的細胞株，包括動物細胞、低等真核生物或原核生物，優選動物細胞。所述動物細胞包括，但不限于，猴COS細胞、CHO細胞、人類腎臟293細胞、人類表皮A431細胞、人類Colo205細胞、3T3細胞、CV-I細胞、其它經轉殖的靈長類細胞、正常的雙套細胞、由體外培養的原生組織衍生的細胞株、原生移殖體、HeLa細胞、老鼠し細胞、8皿、1-60、現37、他1(、？61^6、勵5或11^1 ^細胞等。在一個實施方式中，本發明的細胞株優選CHO細胞。所述細胞株中具有骨形成蛋白_2(以下簡稱BMP-2)基因，所述BMP-2基因可為所述細胞自源性的BMP-2基因，也可為轉染至細胞內的外源性BMP-2基因或重組BMP-2基因。BMP-2基因可來自人類或非人類動物(例如，小鼠、大鼠、倉鼠、兔子或駱駝等)。在ー個實施方式中，所述BMP-2基因為人類BMP-2基因，并將此BMP-2基因轉染至CHO細胞中。本發明中所述的“適當條件”指可促進細胞存活、細胞生長和/或特定物質表達的條件。所述適當條件可為一般的細胞培養條件，且本領域技術人員可依照不同的需求而選擇不同的培養條件。在一個實施方式中，所述適當條件為動物細胞的培養條件，優選CHO細胞的培養條件。在一個實施方式中，所述適當條件可為37°C下，含3%至10%C02及5%至7%02的潮濕空氣。本發明中所述的培養基特別為用于動物細胞的培養基。本發明使用的細胞培養基并無特別限制，其可為任何動物細胞培養基。所述動物細胞培養基包括含血清培養基 以及不含動物成分的培養基，例如，無血清培養基、無蛋白質培養基及其類似物。在本發明中優選使用無血清或無蛋白質培養基，例如，RPMI 1640培養基、Eagle' sMEM培養基、Dulbecco' s modified MEM(DMEM)培養基、199 培養基、F12 培養基、Iscove' s modifiedDulbecco' s 培養基(頂DM)、EX_CELL 302 培養基、EX-CELL -CD-CH0 及 EX-CELL 325 培養基、CHO培養基、CD-CH0 培養基、CD Opti CH0 培養基、CD FortiCHO 培養基、BD CHO培養基、及⑶DG 44 培養基、IS⑶-CH0 培養基及Ultra CH0 培養基，或上述經修飾、混合或濃縮的培養基，及其類似物，更優選DMEM培養基、IMDM培養基、CD Opti CH0 培養基、CD FortiCHO 培養基、Ultra CH0 培養基或其類似物。在細胞培養的過程中，可加入硫酸葡聚糖(Dextran sulfate)以增加BMP-2蛋白的產量。所使用的硫酸葡聚糖并無特別限制，其分子量可介于5，000至500，OOOMw之間，優選介于6，500至12，OOOMw之間，或8，000至10，OOOMw之間。硫酸葡聚糖的添加量并無特別限制，原則上硫酸葡聚糖濃度與BMP-2蛋白的產量具有濃度依賴性(dose dependent)，換言之，BMP-2蛋白的產量會隨著硫酸葡聚糖濃度的增加而增加。培養基中硫酸葡聚糖的濃度可為約0. Iy g/ml以上，優選為約IOy g/ml以上，更優選為約200 u g/ml以上，最優選介于約500至約1，000 u g/ml之間。在一個實施方式中，硫酸葡聚糖可將BMP-2蛋白的產量增加I倍以上，優選為1-5倍。此外，在細胞培養的過程中，亦可加入肌肽(Carnosine，C9H14N403)。肌肽為N-3 -Alanyl-L-histidine，其為由P -丙氨酸和組氨酸組成的肽。肌肽為哺乳動物細胞的氮源，可作為組氨酸的來源，在緊迫時可有助于組氨酸的合成。肌肽存在于哺乳動物的心臟和骨骼肌肉組織，受緊迫(例如，骨折，感染)的動物會消耗心臟的肌肽。受緊迫(敗血癥)時，會降低心臟的收縮。本發明中所使用的肌肽可為一般的市售肌肽，優選為左旋肌肽。由于高濃度的肌肽會抑制細胞生長，因此最好在不影響細胞存活的條件下，選擇肌肽的添加量。一般來說，肌肽的濃度可為約50mM以下，優選為約40mM以下，更優選為約10 至約 30mM。相較于單獨使用硫酸葡聚糖或肌肽，同時加入硫酸葡聚糖與肌肽更可提升BMP-2
的產量。
在一個實施方式中，當培養基中肌肽的濃度為10至30mM，且硫酸葡聚糖(6，500至12，OOOMw)的濃度介于500至1，000 u g/ml時，可獲得最大的BMP-2產量。相較于對照組(不含肌肽與硫酸葡聚糖)，當培養基中具有30mM肌肽或500 U g/ml硫酸葡聚糖吋，BMP-2的產量皆可增加1-2倍，然而，當培養基同時具有30mM肌肽和500 u g/ml硫酸葡聚糖時，BMP-2的產量可增加5_7倍。相較于30mM的肌肽，當培養基同時具有30mM肌肽和500 U g/ml硫酸葡聚糖時，BMP-2的產量可增加約2-3倍。相較于500 U g/ml的硫酸葡聚糖(8，OOOMw)，當培養基同時具有30mM肌肽和500 u g/ml硫酸葡聚糖時，BMP-2的產量可增加約2_3倍。一般來說，BMP-2的產量可為約10mg/L至200mg/L。另ー方面，由于高濃度的丙氨酸與組氨酸會抑制細胞生長，若培養基中含有高濃 度的丙氨酸及/或組氨酸，會造成細胞死亡，因此丙氨酸及/或組氨酸的濃度小于約200mM，優選為約IOOmM以下，更優選為約50mM以下。實施例I.宿主表達細胞本實施例的宿主表達細胞使用缺少ニ氫葉酸還原酶的中國倉鼠卵巢細胞(CH0dfhr-)，其購買自臺灣食品エ業發展研究所的生物資源保存及研究中心(CCRC，60133)。將 CHO dfhr-細胞培養于 IMDM 培養基(Isocoves Modified DulbeccoJ s MediumIMDM; GibcoCat. 12200-36)中，其中含有 10% 的胎牛血清(Gibco Cat. 10091148)、次黃嘌呤與胸腺嘧啶(Gibco，Cat. 11067-030)以及2mM的L-谷氨酰胺(GibcoCat. 25030-081)。Dhfr (-)標志用于表達及篩選。通過使用ニ氫葉酸還原酶抑制劑“甲氨蝶呤(methotrexate,MTX) ”(Sigma Catno. M8407)使 dhfr 基因表達。當 dfhr 基因表達時，其它鄰近基因也被一起表達，使用ELISA (PEPR0TECH 900-K255)選擇表達量高的細胞株，將細胞培養于 37°C、5%C02 的培養箱中(Model 3326，Forma scientific)。 2. pND/BMP2表達載體的構建利用PCR，以全長人類 cDNA(LIFESEQ Catno. IHS1380-97652076)為模板復制出人類BMP-2基因片斷(正義引物ccttaattaagccaccatggtggccgggacccgc,反義引物gatatcctagcgacacccacaaccctc),并將 BMP-2 基因片斷摘入 pcDNA3. 1/Neo (+) /DHFR載體，形成pND/BMP2載體。此表達載體包含作為篩選標志的抗新霉素基因(neomycin-resIstance gene)。3.重組細胞株的建立將含有人類BMP-2基因的載體以電脈沖法(PA4000 PulseAgi le electroporator, Cyto Pulse Sciences)轉染至CHO dhfr-細胞內。首先將細胞以膜蛋白酶處理后，將細胞懸浮于CP-T緩沖液(Cyto pluse Cat. CP-T)中使細胞密度為3x IO6細胞/ml。將200 u I的細胞懸浮液(6xl05細胞)與10 ii g的pND/BMP2混合后進行電脈沖處理，將經電脈沖處理的細胞培養于不含篩選物質的完全培養基(含10%胎牛血清和HT補充物(HT Supplement)的MDM)使細胞恢復生長。在不含篩選物質的培養基中培養48小時后，將細胞移至含有頂DM、10%胎牛血清、L-谷氨酰胺和5nM甲氨蝶呤的含篩選物質的完全培養基中。在培養2周后，將細胞株移至96孔盤中，并利用ELISA (PEPR0TECH 900-K255)定量分析篩選出高表達rhBMP-2的細胞株。將篩選出的細胞培養于篩選培養基中。將細胞稀釋至I細胞/100 u I的濃度后移至96孔盤中培養至生長成細胞叢。利用ELISA檢測并定量BMP-2蛋白，再依據ELISA的結果篩選出高產量細胞并逐步增加MTX濃度從0. 005,0.01,
0.02、0. 05、0. I 至 0. 2 u M。4.硫酸葡聚糖對BMP-2產量的影響在本實施例中，分別使用分子量為5000MW(Fluka，FL_31404)、8000MW(Spectrum, DE131)、6500_10000MW(Sigma, D4911)、12000MW(Spectrum, DE133)和500000MW(Sigma, D8906)的硫酸葡聚糖。首先，將濃度IxlO5的實施例I的細胞培養于2. 5ml的IMDM培養基中，分別加入不同劑量的硫酸葡聚糖使其最終濃度為0、10、20、50、100、200、300,500,750及1，000 u g/ml后，將細胞于37°C下、5%C02的培養箱內培養7天后，收集培養基進行ELI SA分析。參照圖1，當硫酸葡聚糖的分子量介于6，500-12，000時，可有效促 進BMP-2蛋白的表達，且BMP-2蛋白的產量會隨著硫酸葡聚糖濃度的增加而增加。然而，若硫酸葡聚糖的分子量小于8，000或大于12，000吋，則不會對BMP-2蛋白的產量造成明顯影響。此外，與分子量5，OOOMw和500，OOOMw的硫酸葡聚糖相比，分子量介于6，500-12，000硫酸葡聚糖更可增加BMP-2蛋白的產量，分子量6，500Mw-12, OOOMw硫酸葡聚糖比分子量5，OOOMw及500，OOOMw硫酸葡聚糖所增加BMP-2蛋白的產量大I倍以上。另外，進ー步選用6，500-10，OOOMw(Sigma, D4911)及 12，000MW(Spectrum, DE133)的硫酸葡聚糖，分析硫酸葡聚糖在0、10、20、50、100、200、300、500、750、l，000ii g/ml濃度下時，BMP-2蛋白的產量。參照圖2，不管分子量為6，500-10, 000MW或12，000MW的硫酸葡聚糖，BMP-2蛋白的產量皆會隨著硫酸葡聚糖濃度的升高而增加，產量約可増加1-4倍。然而，當濃度大于500ug/ml后，BMP-2蛋白的產量就無明顯改變。5.肌肽對BMP-2產量的影響將濃度3xl06的實施例I的細胞培養于IOml的培養基中，分別加入不同劑量的肌肽(Sigma，Lot. BCBD7868V)使其最終濃度為10、20、30、50、IOOmM,以及不同劑量的硫酸葡聚糖(8000MW, Spectrum, DE131)使其最終濃度為 100、300、500 y g/ml，將細胞于 37°C 下、5%C02的培養箱內培養，每天收集培養基進行ELISA分析。對照組中不含肌肽和硫酸葡聚糖。參照圖3a_3c，肌肽可增加BMP-2蛋白的產量，且BMP-2蛋白的產量會隨著肌肽濃度的增加而增加。相較于對照組，當肌肽濃度為30mM吋，BMP-2蛋白的產量可增加2. 5倍。參照圖4a_4c，肌肽可增加BMP-2蛋白的產量。然而，高濃度的肌肽會抑制細胞生長，因此若肌肽濃度過高，BMP-2蛋白產量增加的程度會變小。參照圖5a_5c，當培養基中肌肽的濃度固定為30mM時，BMP-2蛋白的產量會隨著硫酸葡聚糖濃度的増加而增加。當培養基中含有30mM的肌肽和500 u g/ml的硫酸葡聚糖吋，可獲得最大的BMP-2產量。參照圖6a_6c，當培養基中硫酸葡聚糖的濃度固定為500 U g/ml吋，BMP-2蛋白的產量會隨著肌肽濃度的增加而增加。當培養基中含有30mM的肌肽和500 u g/ml的硫酸葡聚糖時，可獲得最大的BMP-2產量。由圖3-6可知，相較于對照組，當培養基中含有30mM的肌肽與500 U g/ml的硫酸葡聚糖吋，BMP-2蛋白的產量可增加5-7倍。6.丙氨酸和/或組氨酸對BMP-2產量的影響
將濃度3xl06的實施例I的細胞培養于IOml的培養基中，分別加入不同劑量的丙氨酸與組氨酸使其最終濃度為10、15、30、50、100、200mM，將細胞于37°C下、5%C02的培養箱內培養，每天收集培養基進行ELI SA分析。對照組中不含肌肽和硫酸葡聚糖。參照圖7a_7e所示，當丙氨酸與組氨酸的濃度在10_15mM時，不會影響細胞的生長。然而，當丙氨酸與組氨酸的濃度增加至50mM以上時，會抑制細胞的生長，導致細胞濃度降低，進而減少BMP-2的產量。雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其并非用以限定本發明，任何熟習此技 藝者，在不脫離本發明之精神和范圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護范圍當視后附之申請專利范圍所界定者為準。
權利要求
1.ー種骨形成蛋白-2的制備方法，包括 提供ー細胞株，其含有骨形成蛋白_2基因， 將該細胞株培養于培養基中，其中該培養基含有硫酸葡聚糖和/或肌肽。
2.如權利要求I所述的骨形成蛋白-2的制備方法，其中所述硫酸葡聚糖的分子量介于5，OOO 至 500，OOOMw 之間。
3.如權利要求I所述的骨形成蛋白-2的制備方法，其中所述硫酸葡聚糖的分子量介于6，500 至 12，OOOMw 之間。
4.如權利要求I所述的骨形成蛋白_2的制備方法，其中所述硫酸葡聚糖的濃度大于10u g/mlo
5.如權利要求I所述的骨形成蛋白_2的制備方法，其中所述硫酸葡聚糖的濃度介于500 至 l，000ii g/ml 之間。
6.如權利要求I所述的骨形成蛋白_2的制備方法，其中所述肌肽為左旋肌肽。
7.如權利要求I所述的骨形成蛋白_2的制備方法，其中所述肌肽的濃度為50mM以下。
8.如權利要求I所述的骨形成蛋白_2的制備方法，其中所述肌肽的濃度為IOmM至30mMo
9.如權利要求I所述的骨形成蛋白_2的制備方法，其中所述培養基還含有丙氨酸和/或組氨酸。
10.如權利要求5所述的骨形成蛋白_2的制備方法，其中所述丙氨酸和/或組氨酸的濃度為200mM以下。
全文摘要
本發明提供了一種骨形成蛋白-2的制備方法，所述方法包括提供一含有骨形成蛋白-2基因的細胞株，將該細胞株于適當的條件下培養于培養基中，其中所述培養基含有硫酸葡聚糖和/或肌肽。此外，本發明還提供一種增加骨形成蛋白-2產量的方法。
文檔編號C12R1/91GK102796791SQ20121016650
公開日2012年11月28日 申請日期2012年5月25日 優先權日2011年5月25日
發明者彭文君, 楊淑萍, 楊英如 申請人:聯亞生技開發股份有限公司