專利名稱：一種利用木薯原料提高丁醇發酵生產效率和丁醇/丙酮比的工藝方法
技術領域：
本發明涉及一種提高丁醇生產效率和丁醇/丙酮比的方法，特別是一種通過向木薯原料中適時添加酵母浸粉提高丁醇發酵生產效率和丁醇/丙酮比的工藝方法。
背景技術：
丙酮丁醇發酵是利用厭氧性Clostridium種屬的產孢子細菌,在培養液中生產丙酮丁醇的發酵過程(簡稱丁醇發酵)。丁醇發酵的主產品-丁醇，既是一種極具潛力的新型生物燃料，又是一種十分重要的化工平臺化合物。隨著世界原油價格的劇烈波動以及溫室效應的日益突出，曾經沒落的丁醇發酵技術，作為一種能夠有效利用生物質原料生產丁醇燃料的技術，再次引起人們的關注。傳統的丁醇發酵技術存在諸多問題嚴重限制了其發展強烈的終產物抑制丁醇發酵受到來自丁醇的強烈的生長抑制，導致發酵生產強度和設備利用率的顯著下降。產品蒸餾精制過程中的能量成本高。原料大多是糧食且價格不斷上漲。針對上述問題科學工作者研究開發了許多新技術和新方法并積極尋求新的適合丁醇發酵的原料。選擇性萃取發酵是針對問題⑴而提出的解決方法。目的產物丁醇的產物抑制作用很強，出現抑制現象后發酵速度急劇下降。如果此時將發酵液中積累的丁醇轉移到與發酵液完全不相容的萃取相中，就可以將發酵液中丁醇的濃度保持在其抑制濃度以下，從而使發酵過程繼續高效的進行下去。油醇，因其對丁醇萃取系數高、對生產菌株毒性低的優點，被公認為是丁醇發酵最好的萃取劑。我們將本發明中的方法應用于油醇萃取發酵發現，與傳統發酵和生物柴油萃取發酵相比，生產效率和丁醇/丙酮比的提升更為顯著。即使采用選擇性萃取，丁醇在萃取劑中的濃度還是很低，在使用油醇的條件下也不會超過4-5%。因此蒸餾回收丁醇過程的大量能耗嚴重制約著丁醇工業發酵的發展。作為解決問題⑵的對策，必須考慮使用省去產品回收精制過程的新方法。我們之前的研究表明，將對丁醇具有一定萃取能力的生物柴油作為萃取劑進行原位萃取發酵，發酵結束后，生物柴油萃取有10g/L左右的丁醇，其性能得到有效改善可以直接使用。這樣用于蒸餾精制的能耗節省了 50%以上。我們同樣把本發明中的方法應用于生物柴油萃取發酵中發現，生 產效率和丁醇/丙酮比均有較大提升，同時生物柴油中丁醇濃度與以玉米為原料的發酵相比提高了 16%，進一步提高了改良型生物柴油的性能。玉米一直是丁醇發酵生產的主要原料。但是，由于可用耕地的減少、人口的激增以及價格的上漲，使用玉米等糧食作物進行清潔、可再生的能源生產就與糧食安全問題產生了矛盾。為同時保證糧食和能源安全、實現低碳經濟，“非糧”生物質資源，因其“不與人爭糧、不與糧爭地”的特征就被推上了發展清潔、可再生能源的前沿。在眾多非糧原料中，木薯以其淀粉含量高、加工技術簡單、價格便宜、產量高等優點被廣泛用于發酵工業；目前也是丁醇發酵過程中研究較多的一種原料。然而，木薯發酵產丁醇過程中會出現嚴重的相轉型延遲或者不能轉型的現象，不管是傳統發酵還是萃取發酵，發酵時間顯著延長，生產效率低下。本發明的方法就是針對這一問題開發出來的，效果十分顯著。丁醇發酵的最終產物為丁醇、丙酮和乙醇，其重量比大約為6:3:1。選擇性的提高丁醇的比例(丁醇/丙酮比)是目前丁醇發酵研究的一個重要課題。在該方面較為成熟的方法主要包括調控發酵體系的氧化還原電位，使用混合原料(包含還原性較強的糖類物質)，篩選高丁醇比的菌株，以及添加中性紅等電子載體等。然而這些方法要么是以犧牲總溶劑為代價，要么就是增加后續分離純化的難度。本發明的方法在一定程度上提高了丁醇/丙酮比和總溶劑濃度，而且對后續的分離純化過程沒有任何影響。本發明解決了木薯丁醇發酵過程中存在的相轉型延遲或無法轉型的問題，對于傳統發酵、油醇萃取發酵和生物柴油萃取發酵均起到了很好的效果，不但縮短了發酵時間，提高了生產效率和丁醇/丙酮比，還提高了生物柴油中丁醇的濃度，對于降低成本和減少能耗具有重要意義
發明內容
本發明的目的在于提供一種提高木薯原料發酵生產丁醇的生產效率和丁醇/丙酮比的工藝方法，以解決由于嚴重相轉型延遲或無法實現轉型而造成的木薯丁醇發酵過程中生產效率低下的問題，并通過該方法有效的提高丁醇/丙酮的比例。丁醇發酵一般分成兩個階段第一階段為產酸階段，丁酸和乙酸大量生成，pH迅速下降；第二階段為產溶劑階段，生成的丁酸和乙酸被逐步消耗，丁醇和丙酮開始大量積累，PH逐漸回升。兩個階段之間能否順利過渡(相轉型)，決定了發酵過程的成敗。木薯丁醇發酵過程中會出現嚴重的相轉型延遲或者不能轉型的現象，即在產酸期向產溶劑期過渡時出現PH在谷底徘徊，產氣停滯，糖耗量驟降，溶劑產率很低等現象，導致發酵時間延長，生產效率下降甚至發酵失敗等結果。本發明根據木薯丁醇發酵過程中相轉型延遲出現時，PH和產氣的變化規律，適時向發酵體系中添加酵母浸粉，有效的改善了發酵性能，提高丁醇/丙酮的比例。本發明特制在于丙酮丁醇梭菌利用木薯原料生產丁醇過程中，pH在谷底徘徊沒有明顯回升，產氣停滯(每小時產氣體積為O. 5-0. 6L) IOh左右即相延遲發生時，向發酵液中添加酵母浸粉。所述酵母浸粉添加量，使發酵液中酵母浸粉的終濃度達到2. 5g/L-發酵液。我們將此方法應用于傳統分批發酵，以及使用油醇或生物柴油作為萃取劑的分批萃取發酵中，結果表明以木薯為原料并適時添加酵母浸粉的發酵與單純木薯發酵相比，相應發酵方式的生產效率均大幅提高，分別提高了 80. 4%, 79. 8%和22%，丁醇/丙酮比分別提高了 11%，21.2%和14. 1%;以木薯為原料并適時添加酵母浸粉的發酵與以玉米為原料的發酵相比，相應發酵方式的生產效率相當或有所提高，丁醇/丙酮比分別提高了 12. 9%，61%和6. 7% ;另外，利用本方法所得生物柴油中丁醇濃度與以玉米為原料的發酵相比提高了 16%，進一步提高了改良型生物柴油的性能。本發明解決了木薯丁醇發酵過程中存在的相轉型延遲或無法轉型的問題，對于傳統發酵、油醇萃取發酵和生物柴油萃取發酵均起到了很好的效果，不但縮短了發酵時間，提高了生產效率和丁醇/丙酮比，還提高了生物柴油中丁醇的濃度，對于降低成本和減少能耗具有重要意義。
具體實施例方式實施例I (玉米丁醇發酵)菌種丙酮丁醇梭狀芽抱桿菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC824,適宜發酵淀粉質原料，于5%(w/v)的玉米醪中培養成孢子液，4°C冰箱保存。種子培養基活化和保藏菌種均采用玉米醪培養基，市售黃玉米粉40目過篩。活化、保藏菌種均采用5%(w/v)的玉米醪培養基,通過高溫糊化60min制備,pH自然，121°C滅菌 50min。
菌種活化方法將保藏于4°C冰箱中的菌種在厭氧培養箱中接入裝有40mL活化培養基的厭氧瓶中，接種量體積分數為10%。抽真空2min以驅除培養基中的溶解氧，于沸水中熱處理lmin，于冰水中冷處理lmin，最后置于37°C水浴鍋中培養，培養24h后作為發酵菌種。玉米發酵培養基傳統和生物柴油萃取發酵培養基玉米粉濃度均為15%(w/v)，油醇萃取發酵玉米粉濃度為30%(w/v)，通過添加液化酶(8u/g淀粉，沸水浴下液化45min)和糖化酶(120u/g淀粉，62°C下糖化60min)制備，pH自然，121°C滅菌30min。發酵方法為了保證發酵罐內的厭氧環境，接種前向裝有玉米發酵培養基(傳統發酵2. 5L，萃取發酵2L)的7L發酵罐中持續通入氮氣15min，接種量體積分數為10%，使用循環水浴槽和發酵罐的內盤管將溫度控制在37°C下靜態培養。當需要添加生物柴油或油醇進行萃取發酵時，先通入氮氣15min以驅除生物柴油或油醇中的溶解氧，再以油水比1:1的比例(v/v)直接添加到接種好的發酵培養基上方。將發酵罐中的壓力維持的O. 04Mp，并定時測量產氣量和記錄pH變化，結果見表1，表2。pH的測定使用配置于發酵罐上的pH電極在線測定。產氣量的測定方法丙酮丁醇梭菌發酵主要生成丙酮、丁醇，還生成C02、H2，為了測定發酵過程中產氣量，我們利用排水法測定氣體體積，忽略CO2在水中的溶解度。量筒是氣體的收集與測量裝置，氣體通過硅膠管導入量筒中。實施例2 (木薯丁醇發酵)菌種丙酮丁醇梭狀芽抱桿菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC824,適宜發酵淀粉質原料，于5%(w/v)的玉米醪中培養成孢子液，4°C冰箱保存。種子培養基活化和保藏菌種均采用玉米醪培養基，市售黃玉米粉40目過篩。活化、保藏菌種均采用5%(w/v)的玉米醪培養基,通過高溫糊化60min制備,pH自然，121°C滅菌 50min。菌種活化方法將保藏于4°C冰箱中的菌種在厭氧培養箱中接入裝有40mL活化培養基的厭氧瓶中，接種量體積分數為10%。抽真空2min以驅除培養基中的溶解氧，于沸水中熱處理lmin，于冰水中冷處理lmin，最后置于37°C水浴鍋中培養，培養24h后作為發酵菌種。木薯發酵培養基傳統和生物柴油萃取發酵培養基木薯粉濃度均為15%(w/v)，油醇萃取發酵木薯粉濃度為25%(w/v)，通過添加液化酶(8u/g淀粉，沸水浴下液化45min)和糖化酶(120u/g淀粉，62°C下糖化60min)制備，pH自然，121°C滅菌30min。發酵方法為了保證發酵罐內的厭氧環境，接種前向裝有木薯發酵培養基(傳統發酵2. 5L，萃取發酵2L)的7L發酵罐中持續通入氮氣15min，接種量體積分數為10%，使用循環水浴槽和發酵罐的內盤管將溫度控制在37°C下靜態培養。當需要添加生物柴油或油醇進行萃取發酵時，先通入氮氣15min以驅除生物柴油或油醇中的溶解氧，再以油水比1:1的比例(v/v)直接添加到接種好的發酵培養基上方。酵母浸粉添加量，使發酵液中酵母浸粉的終濃度達到2. 5g/L-發酵液。將其配成適當體積溶液，115°C滅菌15min后按需要在發酵過程中通過蠕動泵打入發酵液內。將發酵罐中的壓力維持的O. 04Mp，并定時測量產氣量和記錄pH變化，結果見表1，表2。pH的測定使用配置于發酵罐上的pH電極在線測定。產氣量的測定方法丙酮丁醇梭菌發酵主要生成丙酮、丁醇，還生成C02、H2,為了測定發酵過程中產氣量，我們利用排水法測定氣體體積，忽略 CO2在水中的溶解度。量筒是氣體的收集與測量裝置，氣體通過硅膠管導入量筒中。可以理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據本發明的技術方案及其發明構思加以等同替換或改變，而所有這些改變或替換都應屬于本發明所附的權利要求的保護范圍。表I.不同發酵方式下，以玉米或木薯為培養基的丁醇發酵的性能比較
發酵批發酵時水相丁醇總溶劑濃度(g/L-broth) 丁醇/丙酮丁醇生產效總產氣量
次間(h) 濃度(g/L)Τ 丙酮比例(-) 率 g/(L.h)(L/L-broth)
Tl6511.6311.635^86 1.9850.17923.26
T25113.6113.616.07 2.2420.26739.71
E-OAl 1028.1935.87(27.68*) 20.37 1.7610.35286.13
Ε-0Α2 1017.0734.37 (27.30*) 12.12 2.8360.34077.74
E-BDl 908.8018.37(9.57*) 8.95 2.0520.20432.87
E-BD2 908.3719.47 (11.10*) 8.89 2.1900.21648.16T :傳統發酵；Ε-0Α :油醇萃取發酵；E_BD :生物柴油萃取發酵。Tl :玉米培養基；T2 :木薯培養基(21h時添加酵母浸粉)；E_0A1和E-BDl :玉米培養基；E-0A2和E-BD2 :木薯培養基(分別在39h和28h添加酵母浸粉)。萃取劑中丁醇的濃度由表I中的實驗結果可以看出，以木薯為培養基并適時添加酵母浸粉的丁醇發酵批次與相應以玉米為培養基的發酵批次相比，丁醇的生產效率相當甚至有所提高。而丁醇/丙酮比例在傳統發酵、油醇萃取發酵和生物柴油萃取發酵中以木薯為原料批次與以玉米為原料批次相比分別提高了 12. 9%, 61%和6. 7%表2.不同發酵方式下，適時添加酵母浸粉的木薯發酵與單純木薯發酵的性能比較
權利要求
1.ー種利用木薯原料提高丁醇發酵生產效率和丁醇/丙酮比的エ藝方法，其特征在于首先制備木薯發酵培養基，木薯粉濃度視發酵方式而定；傳統發酵和生物柴油萃取發酵為15%，油醇萃取發酵為25%，所述百分比為質量體積比，在培養基中加入液化酶8U/g淀粉，沸水浴下液化45min，加入糖化酶120U/g淀粉，62°C水浴下糖化60min，裝罐后121 °C滅菌30min,接種前向裝有發酵培養基的發酵罐中持續通入氮氣15min,創造無氧環境；然后將活化后的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) ATCC824按體積分數10%接種；進行萃取發酵需要添加生物柴油或油醇時，先通入氮氣15min以驅除生物柴油或油醇中的溶解氧，再以油水比1:1的比例(v/v)直接添加到接種好的發酵培養基上方；溫度控制在37 0C靜態培養，當發酵液pH在谷底徘徊沒有明顯回升，產氣停滯IOh左右時，向發酵液中添加酵母浸粉。
2.權利要求I所述的方法，其特征在于所述酵母浸粉添加量為終濃度2.5g/L-發酵液。
3.權利要求I所述的方法，其特征在于所述pH的監測方法是在發酵體系中放入pH電極，將發酵液初始PH調節到6. 0并實時監測。
4.權利要求1-3任一所述的方法，其特征在于所述pH在谷底徘徊沒有明顯回升標準是發酵前期PH下降到某值后連續4-5h沒有變化或在其上下0. 02范圍內波動。
5.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述產氣停滯的標準是每小時所測量到的產氣為0. 5-0. 6し
全文摘要
本發明公開了一種提高木薯原料發酵生產丁醇的生產效率和丁醇/丙酮比的工藝方法，根據木薯丁醇發酵過程中相轉型延遲出現時，pH和產氣的變化規律，適時向發酵體系中添加酵母浸粉，有效的改善了發酵性能，提高丁醇/丙酮的比例。我們將此方法應用于傳統分批發酵，以木薯為原料并適時添加酵母浸粉的發酵與以玉米為原料的發酵相比，相應發酵方式的生產效率相當或有所提高，丁醇/丙酮比分別提高了12.9%，61%和6.7%(表1)。另外，利用本方法所得生物柴油中丁醇濃度與以玉米為原料的發酵相比提高了16%(表1)，進一步提高了改良型生物柴油的性能。
文檔編號C12R1/145GK102757983SQ201210203549
公開日2012年10月31日 申請日期2012年6月20日 優先權日2012年6月20日
發明者史仲平, 李樂, 李志剛, 李鑫, 鄭鈞屏 申請人:江南大學