專利名稱：一種刺參高溫脅迫應答基因pcsk9的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程領域，具體涉及是一種刺參高溫脅迫應答基因的全序列及其表達特性。
背景技術：
溫度是影響水生生物生長和生理活動的重要因子，直接影響到生物個體的生長發育、攝食代謝、繁殖存活等生命過程。刺參是我國北方海參的主要養殖種類，主要分布在黃、渤海，是典型的溫帯物種，限制其分布的主要因素就是海水溫度。刺參具有“夏眠”的生態習性，夏眠期間消化道退化，體重也減輕，因此這一生態習性的存在明顯延緩了刺參的生長速度，延長了養殖周期，給人工養殖造成了很大的弊端。
刺參的地域性分布和夏眠的生態習性都與溫度相關，關于溫度對刺參的影響以及刺參對溫度變化響應等方面的研究，在國內外已經有許多報道，但在分子水平上的研究很少，溫度影響刺參活動及分布的分子機制尚不清楚。如能通過分析溫度脅迫下刺參基因的差異表達，就有可能獲得脅迫相關基因，并在分子水平上闡明其表達調控的模式。獲得可以作為刺參熱應激指標的標記基因，可為探討刺參應答高溫脅迫的內在分子機理提供新的資料，為熱抗性刺參品種選育改良和刺參夏眠機制研究提供分子基礎。
發明內容
本發明的目的在于提供一種刺參高溫脅迫應答基因序列及其表達特性，為研究刺參的熱激脅迫反應機理提供基因資源。本發明提供了一種刺參高溫脅迫應答基因是前蛋白轉化酶枯草溶菌素9 -pcsk9基因，其cDNA序列全長為1338bp，如SEQ ID NO :1所示，其中l_31bp為5’非翻譯區，1163-1338bp為3’非翻譯區，開放閱讀框為32-1162位核苷酸，編碼376個氨基酸，如SEQID NO :2所示。本發明公開的前蛋白轉化酶枯草溶菌素9基因是篩選自刺參高溫脅迫差異消減文庫中的差異表達基因，消減文庫克隆SSHP3H7T7測序獲得前蛋白轉化酶枯草溶菌素9部分序列，后利用RACE技術獲得該基因cDNA序列全長。常溫正常培養條件下pcsk9基因在刺參各組織中均有表達，體壁中的表達量最聞，在呼吸樹中表達量最少(圖I);聞溫脅迫后pcsk9在各組織中均表現為下調表達,其中呼吸樹中表達量變化最顯著(圖2)。在15°C -30°C范圍內，pcsk9隨著溫度升高其表達量總體呈現下調表達，30°C約為15°C的1/2 (圖3)。在30°C高溫脅迫0-3 h時間內，pcsk9表現為表達下調，表達量最小值O. 5出現在2 h (圖4)。
圖I為常溫下pcsk9基因在刺參各組織相對表達量，以體壁組織中基因的表達量作基準為I ;圖2為高溫脅迫后pcsk9在各組織相對表達量，常溫下各組織中基因的表達量為基準I;圖3為15°C -30°C范圍內pcsk9相對表達量，以15°C條件下基因表達量作基準為I ;圖4為30°C高溫脅迫0-3 h時間內pcsk9相對表達量，以O h時間點基因的表達
量為基準I。
具體實施例方式下面對本發明做進ー步詳細說明。I、刺參前蛋白轉化酶枯草溶菌素9基因的克隆 選取體態結實，大小相似的6只刺參迅速放到30°C水槽中，作為高溫處理組，另取6只刺參作為常溫對照組，熱應激3h后，取出刺參解剖取體壁、縱肌、消化道和呼吸樹等組織，用Trizol (GIBC0L公司)提取總RNA;以DNaseI消化基因組污染，采用的Oligotex mRNA Kits (QIAGEN 公司)純化 mRNA。米用 Clontech 公司提供的 PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit進行抑制性消減雜交，正向消減雜交即將高溫組cDNA作為Tester,常溫cDNA為Driver，反向消減雜交反之。消減后2次PCR的產物連接到載體pGEM-T easy (Promega),轉化至E. coli DH5 α。正反向消減文庫中各隨機挑選384個陽性克隆，以32P dATP標記探針進行斑點雜交，篩選表達差異明顯克隆進行測序分析，得到克隆號為SSHP3H7T7的下調表達基因刺參前蛋白轉化酶枯草溶菌素9部分cDNA序列。根據獲得序列設計RACE用基因特異性引物(5’ -ATGGTCACGGAACTCACTGTGCTGG ；5’ -CAATGATGGAGTCCCCGTGATCGTT)，利用 SMART RACE (Clontech 公司)試劑盒擴增得到刺參前蛋白轉化酶枯草溶菌素9基因5’和3’端序列，進而拼接得到基因1338bp全長cDNA序列，如SEQ ID NO 1所示，其中l-31bp為5，非翻譯區，1163_1338bp為3，非翻譯區，開放閱讀框為32-1162位核苷酸，編碼376個氨基酸，如SEQ ID NO 2所示。2、刺參前蛋白轉化酶枯草溶菌素9基因的表達特性以刺參看家基因β-actin為內參，采用實時熒光定量PCR技術，利用相對定量2_ΔΔα法對刺參前蛋白轉化酶枯草溶菌素9基因在不同脅迫時間、不同溫度下以及不同組織中的應激表達特性進行分析。不同組織高溫30°C和常溫15°C水槽中，處理3 h ;不同脅迫溫度設定15、18、21、24、27、30°C 6個溫度，高溫脅迫3 h ;不同脅迫時間30°C的水槽中的刺參，分別在O、O. 5、1、1· 5、2、2. 5、3 h等7個時間點。各組分別取出6只刺參解剖取其等量體壁、縱肌、消化道和呼吸樹等組織,在液氮中充分研磨，加入適量Trizol (Invitogen)提取總RNA,以DNase I (Promega)消化基因組污染，以Oligo nucleotide為反轉錄引物在M-MLV反轉錄酶(Promega)作用下轉錄合成單鏈cDNA。設計熒光定量PCR引物pcsk9,211bpF- TTCCATTGAACAACGGCTAC ； R-GGTGACTGATTTGGCGACAβ -actin, 262 bp F-CGGGAAATCGTTCGTGACA ； R-AGGACAAAGTTGGCGTACA在 ABI PRISM7300 FAST Real-Time PCR 擴增儀上進行，PCR 反應體系為SYBR Premix Ex TaqTM (2X) 10. 0 μ 1，上下游引物各 0. 4 μ I (IOmM), ROX ReferenceDye (50 X) 0. 4 μ 1，DNA 模板 2· O μ 1，加 dH20 至 20. O μ I。反應條件95°C 預變性 30s ;95°C變性5s，56°C退火30s，循環40次。pcsk9基因常溫條件下在刺參各組織中均有表達，體壁中的表達量最聞，在呼吸樹中表達量最少(圖I);高溫脅迫后pcsk9在各組織中均表現為下調表達，其中呼吸樹中表達量變化最顯著(圖2)。在15°C -30°C范圍內，pcsk9表現為下調表達，隨著溫度升高其表達量下降，pcsk9在30°C較27°C的表達量O. 54略微上升，但總體呈現下調表達(圖3)。在30°C高溫脅迫0-3 h時間內，pcsk9表現為表達下調，表達量最小值O. 5出現在2 h(圖4)。pcsk9作為刺參高溫脅迫后下調表達的ー種基因，是本是本研究首次發現的刺參新基因，其功能很可能與刺參脂類代謝的調節有關，其表達水平直接或間接影響酯酶的表達。pcsk9基因表達產物既有可能作為功能蛋白直接參與代謝調節，也有可能作為調節蛋白通過調控脅迫蛋白的表達及其蛋白質活性來提高刺參對高溫脅迫的耐受能力。該刺參高溫脅迫應答基因的克隆獲得，為研究刺參應答高溫脅迫的內在分子機理及刺參品種選育改良 提供候選基因基礎。
權利要求
1.一種刺參高溫脅迫應答基因，該基因是前蛋白轉化酶枯草溶菌素9基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示，該基因的cDNA序列全長為1338bp，其中1_31為5’非翻譯區，1163-1338為3’非翻譯區，開放閱讀框為32-1162位核苷酸，編碼376個氨基酸。
2.—種刺參高溫脅迫應答基因，其編碼的刺參前蛋白轉化酶枯草溶菌素9的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
全文摘要
本發明公開了一種刺參高溫脅迫應答基因，即刺參前蛋白轉化酶枯草溶菌素9基因，該基因全長cDNA序列為1338bp，編碼376個氨基酸。熒光定量PCR表明，該基因常溫條件下在刺參各組織均有表達，30℃高溫脅迫后在各組織中均表現為下調表達，其中呼吸樹中表達量變化最顯著；在15℃-30℃范圍內，pcsk9隨著溫度升高總體呈現表達量下降, 30℃約為15℃的1/2；在30℃高溫脅迫0-3 h時間內，pcsk9表現為表達下調，表達量最小值0.5出現在2 h。該刺參高溫脅迫應答基因的克隆獲得，為研究刺參應答高溫脅迫的內在分子機理及刺參品種選育改良提供候選基因基礎。
文檔編號C12N15/57GK102747095SQ20121020511
公開日2012年10月24日 申請日期2012年6月20日 優先權日2012年6月20日
發明者任利華, 孫國華, 李雪艷, 楊建敏, 郭婷婷 申請人:山東省海洋水產研究所