專利名稱：一種利用枯草芽孢桿菌發酵生產胞外多糖的方法
技術領域：
本發明屬于發酵技術領域，具體涉及一種利用枯草芽孢桿菌發酵生產胞外多糖的方法。
背景技術：
核酸、蛋白質和多糖是最重要的三種生物大分子，核酸和蛋白質在生命現象中的重要性已為世人所知，而多糖的研究比核酸和蛋白質落后許多，真正對其研究僅是最近幾十年的事。近20年來，國內外有關活性多糖的研究非常的活躍，目前主要從動物、植物組織以及藻類和微生物發酵液中提取多糖。本世紀生命科學的焦點是對細胞生物多糖高層次的生命現象解釋，所以糖類作為生物體內細胞識別及調控信息分子，因此對其研究是非常重 要的。微生物胞外多糖是一種高粘度的大分子物質，近年來已發展成為一類新型的發酵產品。除具有大多數植物多糖和合成的高分子聚合物所特有的性質外，還具有低濃度下呈高黏度，假塑性，熱穩定性，可與多種鹽類配伍及形成有用的膜等特性，同時具有生產周期短，生產不受季節、地理條件、病害的限制等優點。另外，微生物多糖的無毒、不污染環境等特點又使其在將來有可能取代高分子聚合物，消除高聚物受石油資源制約、毒性、污染等弊病。微生物多糖除具有藥用外還可作為增稠劑、懸浮劑和穩定劑而廣泛地應用于化工、石油開采、醫藥加工、食品和化妝品等領域。根據D. E. Eveleigh統計，已經發現49屬76中微生物產胞外多糖，但真正有應用價值并已經進行或接近工業化生產的僅十幾種。近幾年，隨著對微生物多糖研究的深入，世界上微生物多糖的產量和年增長量均在10%以上，而一些新型多糖年增長量在30%以上。目前為止，已大量投產的微生物胞外多糖主要有黃原膠、結冷膠、右旋糖苷、硬葡聚糖、異淀粉等。據估計，全世界微生物多糖年加工業產值可達50-100億美元。近幾十年來，由于微生物胞外多糖在產品結構、性能及生產方面所具有的優勢特點而得到大力研究和開發，微生物胞外多糖的開發已成為工業微生物研究的熱點之
O本專利以枯草芽孢桿菌為出發菌株，對影響發酵生產胞外多糖的發酵溫度、接種量、轉速、裝液量、培養基PH及發酵時間進行了研究。
發明內容
本發明提供了一種利用枯草芽孢桿菌發酵生產胞外多糖的方法，本專利以枯草芽孢桿菌為出發菌株，對影響發酵生產胞外多糖的發酵溫度、接種量、轉速、裝液量、培養基PH及發酵時間進行了研究。I. 一種利用枯草芽孢桿菌發酵生產胞外多糖的方法，其特征在于發酵時，在100mL三角瓶中裝入一定體積的發酵培養基，接入一定量的枯草芽孢桿菌種子液到發酵培養基中，分別在不同的初始PH值條件下發酵培養以一定的轉速和溫度下發酵一定的時間。2.步驟I所述的發酵培養基(g/L):蔗糖25，蛋白胨15，牛肉膏3. 0，檸檬酸三鈉1.0。pH值根據發酵條件選定。3.步驟I所述的種子培養液的制備方法為將在固體培養基上培養的菌落接種到發酵培養基培養12 d，制成種子培養液。4.步驟3所述的固體培養基(g/L):葡萄糖5，蛋白胨5，牛肉膏3，氯化鈉5，瓊脂15-20。5.步驟I所述的最佳發酵溫度為40°C。6.步驟I所述的最佳接種量為3%。7.步驟I所述的最佳轉速為160 rpm。
8.步驟I所述的最佳裝液量為30 mL。9.步驟I所述的最佳培養基pH值為6. O。10.步驟I所述的最佳發酵時間為35 h。
圖I培養溫度對菌株胞外多糖產量的影響。圖2不同接種量對菌株胞外多糖產量的影響。圖3不同轉速對菌株胞外多糖產量的影響。圖4不同裝液量對菌株胞外多糖產量的影響。圖5不同培養基初始pH對菌株胞外多糖產量的影響。圖6發酵時間對菌株胞外多糖產量的影響。
具體實施例方式下面的實施例對本發明作詳細說明，但對本發明沒有限制。本專利所用的菌株為枯草芽孢桿菌，購買于ATCC，編號為ATCC02733。實施例I
本實施例說明不同培養溫度對菌株胞外多糖產量的影響，將種子培養液以1% (V/V)的接種量接種于發酵培養基，初始PH值為6，于200 r/min振蕩培養，培養基裝液量為50mL/500 mL三角瓶，發酵培養30 h，培養溫度分別為25°C，30°C，35°C，40°C，45°C，結果如圖I所示。由圖I可以看出，不同的發酵溫度，菌株胞外多糖的產生情況明顯不同。從圖中可以看出在30°C以上菌株的胞外多糖產量較高，當溫度達到40°C時，胞外多糖產量最高，而超過這個溫度胞外多糖產量卻逐漸下降。因此實驗選擇40°C為最佳生產胞外多糖的溫度。實施例2
本實施例說明不同接種量對菌株胞外多糖產量的影響，將種子培養液以2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%，10% (V/V)的接種量接種于發酵培養基，初始pH值為6，于37°C，200 r/min振蕩培養，培養基裝液量為50 mL/500 mL三角瓶，發酵培養30 h，結果如圖2所示。由圖2可以看出，當菌株接種量為3%時，胞外多糖產量最高，隨著接種量的增加，胞外多糖的產量并沒有增加，反而有所下降。這可能是由于菌株是好氧菌，當接入量過高時，生長空間一定，密度增加，氧氣量供應不足，影響其生長繼而影響產物的產出；還可能的原因是底物量一定，當接入過多菌種后，底物量只能滿足其生長需求，其次級代謝產物還沒有來的及產生已消耗盡，所以造成產糖量的減少。實施例3
本實施例說明不同轉速對菌株胞外多糖產量的影響，將種子培養液以3% (V/V)的接種量接種于發酵培養基，初始PH值為6，于37°C，轉速分別為120 r/min, 140 r/min, 160 r/min，180 r/min, 200 r/min振蕩培養，培養基裝液量為50 mL/500 mL三角瓶，發酵培養30h，結果如圖3所不。由圖3可以看出，隨著搖床轉速的提高，發酵液中胞外多糖的產量增大，但高于160 r/min后，轉速提高胞外多糖的產量卻下降。可見轉速過低，通氣效果不好，不利于菌體生長，提高搖床轉速，雖然有利于菌種生長，但營養成分消耗也較大，造成營養成分不足， 或者轉速過高對菌體產生機械損傷，引起菌體自溶，生物量減少。所以轉速過高，發酵液中胞外多糖的產量會降低。從圖中可以看出選擇轉速為160 r/min時，菌株胞外多糖產量最聞。實施例4
本實施例說明不同裝液量對菌株胞外多糖產量的影響，將種子培養液以3% (V/V)的接種量接種于發酵培養基，初始PH值為6，于37°C，160 r/min振蕩培養，不同培養基裝液量，發酵培養30 h，結果如圖4所示。由圖4可以看出，枯草芽孢桿菌是好氧性細菌，搖瓶中的氧氣量將直接影響細菌的生長和活性物質的產生。試驗結果顯示，500 mL三角瓶中裝入30 mL的培養液最適于菌株胞外多糖的產生，隨著裝液量增大，瓶中空氣量減少，菌體生長受到影響，因此其次級代謝產物胞外多糖產量減少。實施例5
本實施例說明不同初始PH培養基對菌株胞外多糖產量的影響，將種子培養液以3%(V/V)的接種量接種于發酵培養基，初始pH值分別為5-10，于37°C，160 r/min振蕩培養，培養基裝液量為30 mL/500 mL三角瓶，發酵培養30 h，結果如圖5所示。pH主要通過影響菌體細胞膜電荷、膜滲透性以及營養物質離子化程度，從而影響菌體對養分的吸收。由于搖瓶發酵過程中的PH難以控制，只能控制發酵液的初始pH。由圖5可以看出，pH對菌株胞外多糖的合成有較大的影響。較低或較高pH的情況下均不利于胞外多糖的產生。當PH低于6. O以下，因為酸的抑制作用，菌體不宜生長或生長緩慢，更是影響胞外多糖的產生。從圖中可以看出，當PH為6. O時，最利于菌株胞外多糖的產生。所以選擇培養基初始pH為6. O進行發酵培養。實施例6
本實施例說明發酵時間對菌株胞外多糖產量的影響，將種子培養液以3% (V/V)的接種量接種于發酵培養基，初始PH值為6，于37°C，160 r/min振蕩培養，培養基裝液量為30mL/500 mL三角瓶，發酵培養不同的時間，結果如圖6所示。由圖6可以看出菌株胞外多糖的產量隨著發酵時間的延長在不斷增加，當發酵時間為35 h時，菌株胞外多糖的產量達到最高。當繼續延長發酵時間菌株胞外多糖的產量反而下降，原因可能是因為底物的營養價值已被消耗盡無法繼續提供菌株細胞生長及胞外多糖的分泌，從而造成多糖產量的下降；也可能是由于大量多糖覆蓋在菌株細胞表面抑制了菌株的繼續生長及分泌多糖。目前許多研究也在傾向于胞外多糖產量隨發酵時間的延長而降低，可能與酶降解或培養基成分的減少有 關。
權利要求
1.一種利用枯草芽孢桿菌發酵生產胞外多糖的方法，其特征在于發酵時，在100 mL三角瓶中裝入一定體積的發酵培養基，接入一定量的枯草芽孢桿菌種子液到發酵培養基中，分別在不同的初始PH值條件下發酵培養以一定的轉速和溫度下發酵一定的時間。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，發酵培養基蔗糖25g/L，蛋白胨15 g/L，牛肉膏3.0 8/1，檸檬酸三鈉1.0 g/L ;pH值根據發酵條件選定。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于種子培養液的制備方法為將在固體培養基上培養的菌落接種到發酵培養基培養12 d，制成種子培養液。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于固體培養基葡萄糖5g/L，蛋白胨5 g/L,牛肉膏3 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂15-20 g/L。
5.根據權利要求I所述的方法，其特征在于發酵溫度為40°C。
6.根據權利要求I所述的方法，其特征在于接種量為3%。
7.根據權利要求I所述的方法，其特征在于轉速為160rpm。
8.根據權利要求I所述的方法，其特征在于裝液量為30mL。
9.根據權利要求I所述的方法，其特征在于培養基pH值為6.O。
10.根據權利要求I所述的方法，其特征在于發酵時間為35h。
全文摘要
本發明提供了一種利用枯草芽孢桿菌發酵生產胞外多糖的方法，本發明以枯草芽孢桿菌為出發菌株，對影響發酵生產胞外多糖的發酵溫度、接種量、轉速、裝液量、培養基pH及發酵時間進行了研究。
文檔編號C12R1/125GK102690850SQ20121020938
公開日2012年9月26日 申請日期2012年6月25日 優先權日2012年6月25日
發明者張斌 申請人:蘇州百趣食品有限公司