一種核酸擴增方法
【專利摘要】本發明屬于生物【技術領域】，公開了一種核酸擴增方法及其試劑盒。本發明利用限制性切刻酶進行雙鏈DNA和/或單鏈DNA的擴增。除額外加入限制性切刻酶外不需要添加任何另外的試劑，也就不存在這些物質對后續TMA或NASBA反應的影響，因此可以避免額外添加限制性寡核苷酸造成的擴增效率降低、非特異產物增加的問題。本發明所述方法及試劑盒可以用于任何類型的DNA、樣品中待檢病毒DNA以及基因組DNA，不僅可以用于DNA混合樣本的多重檢測，還適用于DNA和RNA混合樣本的多重檢測，與其他相關技術結合，能廣泛地應用于分子診斷、科學研究、防疫檢測、法醫鑒定等領域。
【專利說明】一種核酸擴增方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，尤其涉及一種核酸擴增方法。
【背景技術】
[0002]聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)技術是20世紀80年代分子生物學領域的一項革命性突破。經過幾十年的改進，PCR方法已從定性發展為定量，能夠在幾個小時內從幾個拷貝或單個細胞開始擴增到數十億特異性的核酸片段。
[0003]盡管PCR技術長期占據著核酸擴增技術的壟斷地位，但后續研發的一系列等溫(isothermal)核酸擴增技術正逐漸成為PCR技術的替代方法而被廣泛應用。這些擴增技術應用不同的原理和方法，可在某一特定溫度條件下(如37°C)，實現核酸(DNA或RNA)的擴增。國際國內已有的恒溫擴增技術如:核酸序列擴增技術(Nucleic acidsequence based amplification, NASBA)、轉錄介導擴增技術(transcription-mediatedamplification, TMA)、鏈置換擴增技術(Strand Displacement Amplification, SDA)>滾環擴增技術(Rolling Circle Amplification, RCA)、解鏈酶擴增技術(HelicaseDependant Amplification, HAD)、單引物等溫擴增技術(Single primer isothermalamplification, SPIA)和切刻內切酶核酸恒溫擴增(Nicking endonuclease mediatedamplification, NEMA)等等。其中，核酸序列擴增技術(NASBA)和轉錄介導擴增技術(TMA)是目前國際上最成熟的恒溫擴增技術，在研究及臨床檢驗領域被廣泛應用。本發明方法與這兩種技術緊密相關。
[0004]NASBA和TMA兩種核酸擴增方法都需要四種酶活性來完成:依賴RNA的DNA聚合酶活性、依賴DNA的DNA聚合酶活性、RNA酶H活性和RNA聚合酶活性。這些活性中的一些可以聯合在一種酶中，所以通常只有2或3種酶是必需的。兩種方法的區別在于所選擇的逆轉錄酶不同，NASBA方法使用禽成肌細胞瘤病毒(AMV)逆轉錄酶，而TMA方法選用莫洛尼屬白血病病毒(M-MLV)逆轉錄酶。它們的擴增原理相似:目標序列在逆轉錄酶作用下，以引物為引導進行逆轉錄，逆轉錄酶的RNA酶H活性將雜合鏈上的RNA降解以后，合成帶雙鏈T7啟動子序列的DNA，并在T7 RNA多聚酶作用下，轉錄出成千上萬個目標RNA序列，這些RNA又可以作為模板進行下一個循環，整個反應是一個自催化過程。最后可通過一些方法(比如添加分子信標探針)檢測擴增產物來定量或定性靶核酸。實際上，從樣品中的單鏈RNA開始，一旦將所有的成分放在一起，并將混合物置于適當的溫度以讓酶都有活性，整個一系列事件就會發生，無需人為干預。
[0005]勿庸置疑，TMA或NASBA技術擴增方法對于單鏈RNA的擴增特別有效。然而當對只以雙鏈DNA的形式存在(環狀或線性)的靶核酸實施TMA或NASBA的擴增方法時，必須將DNA轉變成單鏈核酸，合成出RNA。
[0006]在EP397269中描述了一種方法，雙鏈DNA用限制性內切酶進行預處理，之后用加熱分離步驟使其形成單鏈DNA。在該方法中使用第一引物Pl (啟動子引物)，其3'部分含有與DNA雙鏈中的一條3'末端準確互補的序列，以及5'末端含有可被RNA聚合酶(如T7)識別的啟動子序列。其中第一引物的5'啟動子序列可以作為用于從DNA鏈3'末端開始延伸反應的模板。因此，通過依賴DNA的DNA聚合酶可形成雙鏈啟動子，結果產生的復合物可以作為對于依賴DNA的RNA聚合酶的模板從而合成RNA的多重拷貝。隨后的反應進程與普通的TMA或NASBA方法完全一致。其反應過程如圖1。當DNA是單鏈時，限制性寡核苷酸(RP)或限制性引物含有與包括目標DNA的限制位點的區域互補的序列，將其和限制性內切酶一起添加，如圖2。限制性寡核苷酸的功能可以合并入含有可被依賴DNA的RNA聚合酶識別的啟動子序列的寡核苷酸內。bioMerieux公司采用該方法解決HBV的等溫擴增(NASBA)問題,95%的檢出率為242 WHO IU/mL，50%的檢出率為35 WHO IU/mL。
[0007]內切酶酶切變性使待測DNA變成單鏈進而形成所需RNA的設計打破了 NASBA或TMA不能擴增DNA的禁錮，無疑具有非凡的意義。但是也存在明顯的缺點:
[0008]1、該方法的使用前提是必需首先明確待測樣本為單鏈還是雙鏈DNA，從而采取不同的策略(是否添加RP)來進行。
[0009]2、額外核苷酸序列(RP)的添加勢必會對擴增反應體系產生不利影響，引物間非特異性結合的幾率增大；酶切之后的產物勢必會引起非特異性產物的增加等等。而引物間非特異性結合的幾率增大和非特異性產物的增加都將導致整個體系的有效擴增效率降低。
[0010]3、即便限制性寡核苷酸的功能可以合并入含有可被依賴DNA的RNA聚合酶識別的啟動子序列的寡核苷酸內，但其經酶切后仍然會形成兩條額外序列(這兩條序列對整個擴增反應體系而言不是必需的)，仍無法避免非特異性產物增加的問題。
【發明內容】
[0011]有鑒于此，本發明的目的針對現有技術中額外添加RP造成的擴增效率降低、非特異產物增加的問題，提供一種擴增效率高、非特異產物少的切刻酶耦聯轉錄介導的核酸擴增方法。
[0012]為實現本發明的目的，本發明采用如下技術方案:
[0013]一種核酸擴增方法為在含有所選限制位點切割DNA的限制性切刻酶的反應混合物中進行轉錄擴增。
[0014]本發明利用限制性切刻酶進行雙鏈DNA和/或單鏈DNA的擴增。除額外加入限制性切刻酶外不需要添加任何另外的試劑(比如限制性寡核苷酸RP)，也就不存在這些物質對后續TMA或NASBA反應的影響，因此可以避免額外添加RP造成的擴增效率降低、非特異產物增加的問題。
[0015]進一步的，該方法從存在于樣品中的DNA開始，其具體包括以下步驟:
[0016]A、在擴增緩沖液中溫育待測樣品，該溫育體系中含有:
[0017]一或多種能夠在所選限制位點切割DNA的限制性切刻酶，該限制性切刻酶在該DNA的一條鏈上形成特定的3'末端；
[0018]啟動子引物,該啟動子引物的5'區域包含被依賴DNA的RNA聚合酶所識別的啟動子序列且其3'區域與該DNA鏈的特定的3'末端反向互補；
[0019]第二或反向引物，其具有與啟動子引物相反的極性且含有目標序列的5'末端；
[0020]B、將如此形成的反應混合物在適當的條件下保持足夠的時間，以進行限制性切刻酶的消化；[0021]C、將樣品以足以失活限制性切刻酶和/或導致雙鏈的單鏈化的溫度和時間進行加熱處理；
[0022]D、向樣品中加入下列試劑，
[0023]具有依賴RNA的DNA聚合酶活性的酶
[0024]具有依賴DNA的DNA聚合酶活性的酶
[0025]具有RNaseH活性的酶
[0026]具有RNA聚合酶活性的酶
[0027]F、將如此形成的反應混合物在適當的條件下保持足夠的時間，以進行擴增。
[0028]在一些實施例中，所述樣品中的DNA為雙鏈且該DNA具有一種或多種限制性切刻酶酶切位點，所述啟動子引物含有可被依賴DNA的RNA聚合酶識別的啟動子序列且其3'區域與該DNA酶切鏈特定的3'末端反向互補。即對于雙鏈DNA模板，先將雙鏈DNA用限制性切刻酶進行預處理使得在其一條鏈的特定位置形成缺刻，之后用加熱分離步驟使雙鏈DNA彼此分離形成單鏈，并且被切刻的一條鏈在切刻位置斷開暴露出該位置的3'端。在該方法中使用第一引物Pl (啟動子引物)，其3'部分含有與該暴露的3'末端準確互補的序列，以及5'末端含有可被RNA聚合酶(如T7)識別的啟動子序列。其中第一引物的5'啟動子序列可以作為用于從DNA鏈3'末端開始延伸反應的模板。因此，通過依賴DNA的DNA聚合酶可形成雙鏈啟動子，結果產生的復合物可以 作為對于依賴DNA的RNA聚合酶的模板從而合成RNA的多重拷貝。后續反應為普通的TMA或NASBA過程。其反應示意圖如圖3。
[0029]在一些實施例中，所述樣品中的DNA為單鏈且該DNA具有一種或多種限制性切刻酶酶切位點，所述啟動子引物含有與包括目標單鏈DNA的限制位點的區域互補的序列和可被依賴DNA的RNA聚合酶識別的啟動子序列。即對于單鏈DNA模板，啟動子引物先與單鏈DNA復性形成切刻酶酶切位點。在該方法中使用啟動子引物，其3'部分含有與切點位置的3'末端準確互補的序列，以及5'末端含有可被RNA聚合酶(如T7)識別的啟動子序列。復性后的產物用限制性切刻酶進行預處理使得在待測DNA的特定位置形成缺刻，之后用加熱分離步驟使模板DNA在切點位置斷裂，暴露出該位置的3'端。隨后的復性過程，啟動子引物與切點位置的3'末端準確互補，該引物的5'啟動子序列可以作為用于從DNA鏈3'末端開始延伸反應的模板。因此，通過依賴DNA的DNA聚合酶可形成雙鏈啟動子，結果產生的復合物可以作為對于依賴DNA的RNA聚合酶的模板從而合成RNA的多重拷貝。后續反應為普通的TMA或NASBA過程。其反應示意圖如圖4。
[0030]在一些實施例中，所述樣品中的DNA為單鏈和雙鏈的混合物且該兩種或多種DNA具有一種或多種相同或不同的限制性切刻酶酶切位點，實現不同核酸模板的同時檢測。
[0031]進一步的，本發明所述核酸擴增方法的具體步驟為:
[0032]a)在限制性切刻酶發揮活性的溫度及離子濃度條件下溫育，
[0033]對于雙鏈DNA模板，限制性切刻酶識別特異性核酸序列，在其中一條核酸鏈上切割形成一個切口；
[0034]對于單鏈DNA模板，啟動子引物(Pl)與單鏈DNA結合形成限制性切刻酶識別的特異性核酸序列，在模板鏈上切割形成一個切口 ；
[0035]b)加熱使被切的那條鏈在切刻位置斷開暴露出該位置的3'端，雙鏈DNA或者啟動子引物(Pl)與單鏈DNA結合形成的局部雙鏈彼此分離，同時限制性切刻酶也被失活；[0036]c)隨后進行復性過程，啟動子引物(PD的3'部分與該暴露的3'末端準確互補，其5'末端含有可被RNA聚合酶識別的啟動子序列，該序列可以作為用于從DNA鏈3'末端開始延伸反應的模板；
[0037]d)向反應體系中加入酶混合物，依賴DNA的DNA聚合酶活性以啟動子引物為模板，從DNA鏈3'末端和啟動子引物的3'末端同時開始延伸反應使形成雙鏈DNA (含啟動子引物序列)；
[0038]e)依賴DNA的RNA聚合酶活性的酶準確識別雙鏈啟動子序列，以雙鏈DNA為模板轉錄出與該DNA鏈互補的RNA鏈；
[0039]f)將第二引物P2和產生于步驟(e)中的RNA轉錄物退火；
[0040]g)在由依賴RNA的DNA聚合酶活性催化的反應中延伸第二引物形成第一 RNA/cDNA雜交核酸分子；
[0041 ] h)RNaseH的活性選擇性地除去第一 RNA/cDNA雜交核酸分子的RNA以獲得第一單鏈cDNA分子；
[0042]i)將啟動子引物(Pl)和獲得的第一單鏈cDNA序列退火；
[0043]j)使用啟動子引物(Pl)作為模板，在由DNA聚合酶催化的反應中延伸第一單鏈cDNA分子的3'末端，形成包含雙鏈啟動子位點的第一部分雙鏈DNA分子；
[0044]k)在由DNA依賴性RNA聚合酶催化的反應中，使用步驟(j )的第一部分雙鏈DNA分子制備多個與e)步極性一致的RNA轉錄物，所述DNA依賴性RNA聚合酶具有對于啟動子引物(Pl)中的啟動子序列的特異性；
[0045]I)循環重復步驟f)至步驟k)，進而合成RNA的多重拷貝，擴增反應緩沖液中加入檢測試劑(比如分子信標探針等)可實時監控RNA的生成。
[0046]在一些實施例中如果啟動子引物Pl的3'末端進行了封閉，使其不會延伸，則降低了副產物的生成，能提高體系的檢測靈敏度，此時依賴DNA的RNA聚合酶活性的酶準確識別雙鏈啟動子序列，以單鏈DNA為模板轉錄出與該DNA鏈互補的RNA鏈。
[0047]本發明所述方法，所述樣品可以為任何類型的DNA、待檢病毒DNA以及基因組DNA。作為優選，所述樣品為含有乙型肝炎病毒DNA的樣品或梅毒螺旋體病毒DNA的樣品。
[0048]在一些實施例中，所述溫育的溫度為35~45°C。更優選為41°C。
[0049]在一些實施例中，所述加熱的溫度為92~98°C。更優選為95°C。
[0050]限制性切刻酶為一類特異的核酸內切酶，通過辨別特異的核苷酸序列來切割雙鏈DNA的特定位點，其并不切斷DNA分子的雙鏈，而只切斷雙鏈中的一條鏈。然后利用聚合酶活性，以切口的3'末端為起點，以未被切斷的單鏈為模板，合成新鏈。目前已知的限制性切刻酶均適用于本發明所述核酸擴增方法，如，Nb.BtsI, Nt.CviPII, N.AlwI, Nb.BbvCI,Nt.BbvC1、N.BstNB1、Nb.Bsm0
[0051]其中，作為優選，所述限制限制性切刻酶為Nb.BtsI或Nt.CviPII。
[0052]在一個具體實施例中，所述樣品為含有乙型肝炎病毒DNA時，考慮到保守區域，所述限制性切刻酶為Nt.CviPII，其酶切位點如下:
[0053]5 …CCD …3
[0054]3 …GGH…5
[0055]其中，D=A或G或T，不為C ；H=A或C或T，不為G。[0056]本發明還提供了一種核酸擴增試劑盒，包括啟動子引物、反向引物、分子信標探針和限制性切刻酶。
[0057]進一步的，所述試劑盒還可以包括核酸擴增的其他組分，如反應緩沖液組分、TMA酶組分等。其中所述反應緩沖液組分包括Tris-HCl、MgCl2, KC1、DMSO, DTT、各種dNTP和NTP (即 dNTP 包括 dATP、d!TP、dGTP 和 dCTP，NTP 包括 ATP、UTP、GTP 和 CTP)，所述 TMA 酶組分包括海藻糖(Trehalose)、牛血清白蛋白(BSA)、M-MLV和T7 RNA聚合酶。
[0058]在一個具體實施例中，所述樣品為含有乙型肝炎病毒DNA時，所述試劑盒包括啟動子引物、反向引物、分子信標探針和限制性切刻酶，其中所述啟動子引物具有SEQ IDNo:1所示核苷酸序列,所述反向引物具有SEQ ID No:2所示核苷酸序列,所述分子信標探針具有SEQ ID No:3所示核苷酸序列，所述限制性切刻酶為Nt.CviPII。具體序列見表1。
[0059]表1擴增乙型肝炎病毒DNA的試劑盒的引物及探針序列
[0060]
【權利要求】
1.一種核酸擴增方法，其特征在于，該方法從存在于樣品中的DNA開始，其具體包括以下步驟: A、在擴增緩沖液中溫育待測樣品，該溫育體系中含有: 一或多種能夠在所選限制位點切割DNA的限制性切刻酶，該限制性切刻酶在該DNA的一條鏈上形成特定的3'末端； 啟動子引物，該啟動子引物的5'區域包含被依賴DNA的RNA聚合酶所識別的啟動子序列且其3'區域與該DNA鏈特定的3'末端反向互補； 第二或反向引物，其具有與啟動子引物相反的極性且含有目標序列的5'末端； B、將如此形成的反應混合物在適當的條件下保持足夠的時間，以進行限制性切刻酶的消化； C、將樣品以足以失活限制性切刻酶和/或導致雙鏈的單鏈化的溫度和時間進行加熱處理； D、向樣品中加入下列試劑， 具有依賴RNA的DNA聚 合酶活性的酶 具有依賴DNA的DNA聚合酶活性的酶 具有RNaseH活性的酶 具有RNA聚合酶活性的酶 F、將如此形成的反應混合物在適當的條件下保持足夠的時間，以進行擴增。
2.根據權利要求1的方法，其特征在于，所述樣品中的DNA為雙鏈且該DNA具有一種或多種限制性切刻酶酶切位點，所述啟動子引物含有可被依賴DNA的RNA聚合酶識別的啟動子序列且其3'區域與該DNA酶切鏈特定的3'末端反向互補。
3.根據權利要求1的方法，其特征在于，所述樣品中的DNA為單鏈且該DNA具有一種或多種限制性切刻酶酶切位點，所述啟動子引物含有與包括目標單鏈DNA的限制位點的區域互補的序列和可被依賴DNA的RNA聚合酶識別的啟動子序列。
4.根據權利要求1的方法，其特征在于，所述樣品中的DNA為單鏈和雙鏈的混合物且該兩種或多種DNA具有一種或多種相同或不同的限制性切刻酶酶切位點，實現不同核酸模板的同時檢測。
5.根據權利要求1的方法，其特征在于，所述樣品為含有乙型肝炎病毒DNA的樣品或梅毒螺旋體病毒DNA的樣品。
6.根據權利要求1的方法，其特征在于，所述溫育的溫度為35~45°C。
7.根據權利要求1的方法，其特征在于，所述加熱的溫度為92~98°C。
8.根據權利要求1的方法，其特征在于，所述限制性切刻酶為Nb.BtsI或Nt.CviPII。
9.一種核酸擴增試劑盒，其特征在于，包括啟動子引物、反向引物、分子信標探針和限制性切刻酶。
10.根據權利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述啟動子引物具有SEQID No:1所示核苷酸序列，所述反向引物具有SEQ ID No:2所示核苷酸序列,所述分子信標探針具有SEQ ID No:3所示核苷酸序列，所述限制性切刻酶為Nt.CviPII。
11.根據權利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述啟動子引物具有SEQID No:4所示核苷酸序列，所述反向引物具有SEQ ID No:5所示核苷酸序列,所述分子信標探針具有SEQ ID No:6所示核苷酸序列，所述限制性切刻酶為Nb.BtsI。
12.根據權利要求10或11所述的試劑盒，其特征在于，所述啟動子引物3'端帶有氨基修飾。
13.根據權利要求10或11所述的試劑盒，其特征在于，所述反向引物的5'端第13位為鎖核酸 堿基。
【文檔編號】C12N15/10GK103667252SQ201210332179
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月10日 優先權日:2012年9月10日
【發明者】周裕程, 楊文秀, 萬強 申請人:思洛生物技術股份有限公司