一種應用于核酸擴增實時電化學pH檢測的反應體系和檢測方法
【專利摘要】本發明提供了一種應用于核酸擴增實時電化學pH檢測的反應體系及檢測方法。所述反應體系為恒溫擴增反應體系，含有引物、反應液、DNA聚合酶、和待檢DNA；所述反應體系中的反應液含有TritonX-100、dNTP、甜菜堿、Mg2+、K+與NH4+，反應體系的反應液中有額外添加的OH-。本發明具有以下特點，本發明是利用對pH敏感的電化學傳感器對核酸擴增進行實時檢測：對于陰性樣本，擴增反應過程中由于不產生質子因此反應前后pH無變化，而對于陽性樣本，隨擴增反應進行，氫離子作為副產物不斷產生，因此反應前后pH發生變化；該反應液能夠替代普通核酸擴增的反應緩沖液，不僅能保證核酸擴增正常進行，且對擴增過程中氫離子的產生足夠敏感，產生明顯的pH變化。
【專利說明】—種應用于核酸擴增實時電化學pH檢測的反應體系和檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬電化學分析、核酸分析領域，涉及應用于核酸擴增實時電化學PH檢測的反應體系。
【背景技術】
[0002]核酸擴增技術被廣泛應用在農業、醫學及食品工業領域，特別是醫療診斷及食品安全檢測方面。由于傳統DNA擴增需要有單鏈模板的產生、引物與模板的結合以及引物的延伸等循環，需要有變性(95°C)、退火(55飛(TC)、延伸(72°C)等步驟；而且DNA擴增的實時檢測常常依賴于熒光染料，因此對儀器的溫度控制精度有較高要求并且需要較龐大的光學檢測設備，從而限制了實時核酸擴增技術的成本和應用范圍。恒溫擴增技術是近年發展起來的一類新型擴增技術，由于能夠在恒定溫度條件下實現核酸擴增，因此不需要使用昂貴的、精密控制溫度的PCR儀器、消耗大量電力，從而得到廣泛關注。其中發展較快的有交叉引物恒溫擴增技術(CPA)、環介導恒溫擴增技術(LAMP)等等。盡管恒溫擴增技術擺脫了精密的溫控設備，但仍然 需要復雜、龐大的光學設備對其擴增產物進行實時檢測。
【發明內容】
[0003]本發明的第一個目的在于提供一種應用于核酸擴增實時電化學pH檢測的反應體系。為此，本發明采用以下技術方案:
一種應用于核酸擴增實時電化學PH檢測的反應體系，其為恒溫擴增反應體系，含有引物、反應液、DNA聚合酶、和待檢DNA ;所述反應體系中的反應液含有Triton X_100、dNTP、甜菜堿、Mg2+、K+與NH4+,其特征在于所述反應體系的反應液中有額外添加的OH'
[0004]在采用上述技術方案的基礎上，本發明還可采用以下進一步的技術方案:
所述反應體系的反應液中K+的工作濃度在50mM。
[0005]所述反應體系的反應液中K+主要由KCl *K2S04提供，KCl的工作濃度在22-48mM，K2SO4的工作濃度在ll-24mM。
[0006]所述反應體系的反應液中0H—由KOH提供，所述反應液中KOH的工作濃度在2_8禮。
[0007]所述的反應液中NH4+的工作濃度在10_60mM。
[0008]所述的反應液中NH4+由(NH4)2SO4或NH4Cl提供。
[0009]所述DNA聚合酶為具有鏈置換功能的DNA聚合酶，例如Bst DNA聚合酶，GspF DNA
聚合酶。
[0010]本發明的第二個目的是提供一種基于核酸擴增中PH變化的電化學傳感器實時監測恒溫擴增的方法。為此，本發明采用以下技術方案:
一種基于核酸擴增中PH變化的電化學傳感器實時監測恒溫擴增的方法，其特征在于它包括以下步驟:
(I)、提取待檢樣品核Ife ；(2)、在反應管中配置權利要求1所述的反應體系；
(3)、擴增反應:將配置好反應體系的反應管混勻后，油封，并插入電極，于60-65°C水浴或金屬浴反應50min ；
(4 )、通過電極連接的數據窗口實時讀取pH數據。
[0011]所述待檢樣品可以為DNA，也可以為RNA，如果待檢樣品為RNA，則需通過逆轉錄為DNA后進行檢測。
[0012]所述油封是指在反應液表面滴加20_50ul油,所用油可以是礦物油或者石臘油。
[0013]所述電極是對pH敏感的電極,例如8220 BNWP Thermo ROSS Ultra復合電極,也可以是其他對PH敏感的電化學傳感器。[0014]本發明所提供的檢測方法可用于交叉引物恒溫擴增(CPA)的產物檢測，其引物包含有:正向外圍引物、反向外圍引物、正向交叉引物、反向交叉引物、正向檢測引物和反向檢測引物。本發明所提供的檢測方法同樣適用于其他核酸恒溫擴增產物檢測。
[0015]電化學傳感器具有檢測靈敏度高、選擇性好、響應快速等特點，目前已被廣泛用于醫藥、臨床、工業和食品化學等領域的分析與檢測。PH計作為一種應用最為廣泛的電化學傳感器，因其價格低、易于微型化和集成化等特點，具有巨大的發展潛力。
[0016]在核酸擴增過程中，新的堿基替代磷酸骨架3’端羥基上的氫，并形成新的磷酸二酯鍵，從而實現鏈的延伸。因此，核酸擴增的過程實際上也是氫離子釋放的過程。本發明提出一種優化的核酸等溫擴增反應體系，并將之應用于基于核酸擴增中PH變化的電化學傳感器實時監測。本發明的優勢在于，對正常的核酸擴增體系而言，由于其穩定的緩沖環境，擴增過程中產生的氫離子難以對整個反應體系的pH變化做出貢獻，因此無法通過檢測核酸擴增過程中pH的變化實現對氫離子釋放過程的實時檢測，也就是說無法達到檢測核酸擴增的目的。本發明所提供的反應體系不僅能夠保證核酸擴增反應正常進行，而且能夠使反應體系對擴增過程中氫離子的產生足夠敏感，有明顯的PH變化的響應。
[0017]本發明與現有技術相比，具有以下特點，首先，本發明是利用對pH敏感的電化學傳感器對核酸擴增進行實時檢測:對于陰性樣本，擴增反應過程中由于不產生質子因此反應前后PH無變化，而對于陽性樣本，隨擴增反應進行，氫離子作為副產物不斷產生，因此反應前后PH發生變化；其次，該反應液能夠替代普通核酸擴增的反應緩沖液，不僅能保證核酸擴增正常進行，而且對擴增過程中氫離子的產生足夠敏感，產生明顯的pH變化。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1是核酸交叉引物恒溫擴增過程中pH值的變化。
[0019]圖2是使用不同反應液核酸交叉引物恒溫擴增過程中pH值變化。
【具體實施方式】
[0020]下面將結合附圖對本發明作詳細的介紹，但并不局限于此。
[0021]實例1:本發明用于檢測轉基因終止子T-Nos基因。
[0022]提取DNA:稱量0.5g轉基因大米粉末(過200目篩)，用CTAB法提取其基因組DNA，最終溶解于50ul去離子水中，-20°C貯存備用。
[0023]配置相應的反應液(10X，濃度為10倍于實際工作濃度):1% Triton X-100，30mM MgCl2, 4mM dNTP，0.075 M (NH4)2SO4,10 M Betaine, 30 mM KOH, 0.47 M KCl。
[0024]配置CPA恒溫擴增液:對于50ul CPA反應體系，需添加上述IOX反應液5ul、6U/ul的GspF DNA聚合酶lul、DNA模板Iul及引物，并最終用去離子水補足至50ul，添加50ul礦物油液封。引物來自杭州優思達生物技術公司轉基因NOS序列恒溫擴增試劑盒(貨號:1016-01 ;引物設計方法參照優思達公司公開的專利CN101638685B、CN102363815B、CN102363816B)。
[0025]CPA恒溫擴增與檢測:將8220 BNWP Thermo ROSS Ultra復合電極插入上述CPA反應液中，置于水浴鍋63度加熱，每分鐘讀數一次并記錄，pH變化如圖1所示。陰性樣本(不含模板)在整個CPA擴增過程中pH值不產生變化，而陽性樣本(含有擴增模板，約1000拷貝轉基因大米基因組DNA)的pH值在擴增過程中產生類似S型曲線的變化。具體來講，陽性樣品在反應初期變化緩慢，當反應的進行達到指數擴增期，產物迅速積累并同時釋放出大量氫離子，呈現出急劇下降的趨勢，隨著反應進行，擴增速率減慢，PH值的變化也趨于平緩。因此，根據反應過程中PH值是否有S型曲線的變化即可判斷該反應是否得到擴
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[0026]實例2:—種應用于檢測反應液pH變化的CPA擴增實時檢測技術的弱緩沖體系，所述的反應液(IX，實際工作濃度)包含:0.1% Triton X-100, 3 mM MgCl2,0.4mM dNTP,
7.5mM (NH4)2SO4, IM Betaine, 6.5mM KOH, 43.5mM KCl，其他同實例 I。
[0027]實例3:—種應用于檢測反應液pH變化的CPA擴增實時檢測技術的弱緩沖體系，所述的反應液(IX)包含:0.1% Triton X-100, 3mM MgCl2,0.4mM dNTP, IOmM (NH4)2SO4,IM Betaine, 8mM KOH, 42mM KCl，其他同實例 I。
[0028]實例4: 一種應用于檢測反應液pH變化的CPA擴增實時檢測技術的弱緩沖體系，所述的反應液(IX )包含:0.1% Triton X-100, 3 mM MgCl2,0.4mM dNTP, IOmM (NH4)2SO4,IM Betaine, 8mM KOH, 22mM KCl，其他同實例 I。
[0029]實例5:—種應用于檢測反應液pH變化的CPA擴增實時檢測技術的弱緩沖體系，所述的反應液(IX)包含:0.1% Triton X-100, 3 mM MgCl2,0.4mM dNTP, 15mM NH4Cl, IMBetaine, 6.5mM KOH, 43.5mM KCl，其他同實例 I。
[0030]實例6:—種應用于檢測反應液pH變化的CPA擴增實時檢測技術的弱緩沖體系，所述的反應液(IX)包含:0.1% Triton X-100, 3 mM MgCl2,0.4mM dNTP,5mM (NH4)2SO4,IM Betaine, 5mM KOH, 22.5mM K2SO4，其他同實例 I。
[0031]實例7:—種應用于檢測反應液pH變化的CPA擴增實時檢測技術的弱緩沖體系，所述的反應液(IX )包含:0.1% Triton X-100, 3 mM MgCl2,0.4mM dNTP,30mM (NH4)2SO4,IM Betaine, 6.5mM KOH, 23.5mM KCl，其他同實例 I。
[0032]實例8:一種應用于檢測反應液pH變化的CPA擴增實時檢測技術的弱緩沖體系，所述的反應液(IX )包含:0.1% Triton X-100, 3 mM MgCl2,0.4mM dNTP, 7.5mM(NH4)2SO4, IM Betaine, 2mM KOH, 48mM KC1，其他同實例 I。
[0033]實例9:本發明用于檢測金黃色葡萄球菌檢測。
[0034]提取DNA:lml菌液12000g離心15min，并將沉淀復溶于去離子水，然后用SDS法裂解細菌、酚氯仿法提純，最終溶解于50ul去離子水中，_20°C貯存備用。
[0035] 引物來自杭州優思達生物技術公司金黃色葡萄球菌恒溫擴增核酸試劑盒(貨號:1011-01)，其他同實例I。
[0036]實例10:本發明用于沙門氏菌檢測。
[0037]引物來自杭州優思達生物技術公司沙門氏菌恒溫擴增核酸試劑盒(貨號:
1047-01)，其他同實例9。
[0038]實例11:本發明 用于志賀氏菌檢測。
[0039]引物來自杭州優思達生物技術公司志賀氏菌恒溫擴增核酸試劑盒(貨號:
1048-01)，其他同實例9。
【權利要求】
1.一種應用于核酸擴增實時電化學PH檢測的反應體系，其為恒溫擴增反應體系，含有引物、反應液、DNA聚合酶、和待檢DNA ;所述反應體系中的反應液含有Triton X_100、dNTP、甜菜堿、Mg2+、K+與NH4+,其特征在于所述反應體系的反應液中有額外添加的OH'
2.如權利要求1所述的反應體系，其特征在于所述反應體系的反應液中K+的工作濃度在 50mM。
3.如權利要求1所述的反應體系,其特征在于所述反應體系的反應液中K+主要由KCl或K2SO4提供，KCl的工作濃度在22-48mM，K2SO4的工作濃度在ll_24mM。
4.如權利要求1或3所述的反應體系，其特征在于所述反應體系的反應液中0H—由KOH提供，所述反應液中KOH的工作濃度在2-8mM。
5.如權利要求1所述的反應體系，其特征在于所述的反應液中NH4+的工作濃度在10_60mMo
6.如權利要求1所述的反應體系，其特征在于所述的反應液中NH4+由(NH4)2SO4或NH4Cl提供。
7.一種基于核酸擴增中PH變化的電化學傳感器實時檢測恒溫擴增的方法，其特征在于它包括以下步驟: (1 )、提取待檢樣品核fe ; (2)、在反應管中配置權利要求1所述的反應體系； (3)、擴增反應:將配置好反應體系的反應管混勻后，油封，并插入電極，于60-65°C水浴或金屬浴反應50min ； (4)、通過電極連接的數據窗口實時讀取pH數據。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于所述油封是指在反應液表面滴加20-50ul油，所用油可以是礦物油或者石蠟油。
9.如權利要求7所述的方法，其特征在于所述電極是對pH敏感的電極。
【文檔編號】C12Q1/68GK103923998SQ201410165263
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月23日 優先權日:2014年4月23日
【發明者】張芳, 俞永華, 吳堅 申請人:浙江大學