專利名稱：一種表達抗凝血酶iii的重組羊胎兒成纖維細胞的制作方法
技術領域：
本發明屬于轉基因克隆細胞技術領域，具體涉及一種表達抗凝血酶III的重組羊胎兒成纖維細胞。
背景技術：
抗凝血酶III (antithrombinIII,簡稱ATIII)屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑,是人體血漿中的一種重要的抗凝血因子，它在血漿中承擔著60% 70%的抗凝血活性，在維持血液生理性凝血與抗凝血中起著重要的作用。抗凝血酶III的合成場所為肝臟，其主要通過與凝血酶Xa及XIa結合等方式滅活凝血酶，從而發揮抗凝血的作用。抗凝血酶III在人體中含量減少常見于以下病例a)遺傳性抗凝血酶III缺乏；·b)獲得性抗凝血酶III缺乏，見于肝硬化、肝癌晚期等各種肝臟疾病；c)抗凝血酶III丟失增多，見于腎臟疾病；d)抗凝血酶III消耗增多，見于各種原因造成的血液凝固性增高；e)由抗凝血酶III先天或后天缺乏導致血栓的形成而引起的腦血栓或心肌梗塞
等疾病。目前人抗凝血酶III蛋白多來自于人類血漿提取，隨著市場需求的不斷擴增以及血漿原料的不斷萎縮，血漿來源的人抗凝血酶III逐漸呈現出供不應求的態勢。鑒于此種情況，利用重組DNA技術在體外高效表達與天然蛋白結構功能均類似的重組蛋白替代品便成為了解決血漿蛋白供不應求的不二之選。已有報道的重組人抗凝血酶III蛋白表達體系包括酵母、CHO細胞及轉基因動物等。其中美國GTC生物治療公司的顯微注射法轉基因胚胎所培育的山羊乳腺生物反應器表達體系所生產達到重組人抗凝血酶III蛋白表達量最高，其結構與功能最接近天然蛋白。但是，GTC公司所制作的轉基因細胞系(胚胎)，由于隨機整合等因素，難以保持外源基因的穩定遺傳，一般外源基因會隨細胞系傳代或轉基因動物繁育而逐漸丟失，不利于優良轉基因形狀的保持及目的蛋白的高效表達。因此，如何獲得一種能夠高效表達目的蛋白且外源基因可以隨之穩定遺傳的細胞系，成為了動物生物反應器制藥行業一項亟待解決的難題。
發明內容
本發明的目的是提供一種表達抗凝血酶III的重組羊胎兒成纖維細胞，即一種作為核供體細胞的包含rhATIII乳腺特異性表達載體的奶山羊胎兒成纖維細胞系，為制作高質量的rhATIII轉基因奶山羊反應器提供堅實的基礎，從而彌補現有技術的不足之處。本發明的表達抗凝血酶III的轉hATIII基因成纖維細胞SMlsCh-AT已于2012年8月15日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC C 2012103。本發明的重組羊胎兒成纖維細胞的制備方法，是將攜帶有整合了人的抗凝血酶III蛋白基因的表達載體轉染入羊胎兒成纖維細胞內，再篩選出目的基因rhATIII已整合到基因組上的山羊胎兒成纖維細胞。本發明的重組羊胎兒成纖維細胞在制備奶山羊生物反應器中的應用。本發明通過構建的rhATIII乳腺特異性表達載體，使目的基因rhATIII整合到羊胎兒成纖維細胞的基因組上。通過在rhATIII基因兩端克隆山羊β酪蛋白基因的5’和3’調控區，山羊β酪蛋白基因的5’和3’調控區可以指導目的基因在山羊乳腺組織中特異的高效表達。而且，本發明使用基因打靶技術，使含有目的基因rhATIII的特異性表達載體可以定點整合至山羊胎兒成纖維細胞基因組中，避免了由于隨機整合而對目的基因表達帶來的不確定性，使目的基因rhATIII的表達效率更高。本發明的包含目的基因rhATIII的山羊胎兒成纖維細胞可作為核移植構建轉基因克隆胚的核供體細胞，通過體細胞核移植法獲得轉基因克隆胚，將所得胚胎移入受體羊的子宮即可高效率生產出轉rhATIII基因的奶山羊生物反應器。
具體實施例方式本發明首先是構建攜帶有抗凝血酶III (ATIII)基因的重組表達載體，載體構建方法可以參照申請號為2011102521955的專利說明書中的描述來進行，其具體步驟如下I、包含目的基因rhATIII的重組載體構建從人類肝臟組織中提取總RNA，以oligo(dT)為引物合成cDNA第一鏈。以合成的 cDNA第一鏈為模板，根據已公開的ATIII基因序列(GenBank，D29832)設計PCR引物，并在引物5’端引入一個唯一的XhoI酶切位點，進行PCR擴增，將PCR產物克隆至pUC19載體上，通過DNA測序分析確定載體所包含的ATIII序列與已公開ATIII序列一致。上述的ATIII基因序列也可以根據GenBank中記錄的序列人工合成。2、重組基因打靶表達載體的構建將奶山羊的β —酪蛋白基因去除第二外顯子與第七外顯子及其之間的DNA序列，建立一個Notl酶切位點。在PCR擴增的ATIII序列片段加上一個Iox序列、一個polyA序列、一個新霉素(Neomycin)篩選基因和另一個Iox序列，使兩個Iox序列方向相同。最后將改造后的ATIII序列連接至奶山羊β —酪蛋白DNA載體的表達框架上。通過DNA測序分析確定重組表達載體序列與理論序列一致。將構建的重組載體轉染細胞，來構建穩定遺傳的細胞系。3、定點打靶載體的細胞轉染、篩選與鑒定從30d-45d胎齡的嶗山奶山羊胎兒中分離出胎兒成纖維細胞，將分離的細胞培養在添加10%胎牛血清(FCS)和抗菌素的DMEM-F12 (1:1)培養基中。用電穿孔或脂質體介導的方法將基因打靶載體轉入山羊胎兒成纖維細胞中。轉染細胞培養48小時后，培養液中加入G418 (600 μ g/mL)進行篩選培養。篩選出的細胞經PCR及Southern雜交檢測外源基因整合情況后冷凍保存。陽性轉基因細胞株傳代30代后，提取基因組DNA進行PCR及Southern雜交檢測，PCR引物序列如下正向引物5’-TGTGATAGGAACTGTAACCTCTGG -3’反向引物5’ -GCTTGGCTGTGCAGATGTC-3 ’
Southern雜交探針選用Pstl酶切Genome DNA plasmid片段,長度為440bp。檢測結果顯示，外源 基因插入片段仍保持完整，說明所得陽性轉基因細胞株中外源目的基因完全整合至細胞基因組中，并可隨之穩定遺傳；提取細胞株總mRNA進行Northern雜交檢測，雜交探針選用ATIII基因序列(GenBank,D29832)或部分序列。檢測結果顯示，經誘導后的陽性轉基因細胞株具有較高的目的基因轉錄水平，約為正常轉錄的人類肝臟細胞的3-5倍，說明所得陽性轉基因細胞株中外源基因可高效轉錄。該細胞株命名為轉hATIII基因成纖維細胞SMlsCh-AT，已于2012年8月15日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC C 2012103。4、以上述基因組整合了 ATIII目的基因的山羊胎兒成纖維細胞作為核供體細胞，構建轉基因克隆胚通過同期發情和超排處理獲得體內成熟的卵母細胞和寄母羊。陽性細胞體外饑餓2-5天后移入去核卵母細胞卵周隙內，用電刺激法使供核細胞與去核卵母細胞融合，體外培養4小時并用離子霉素(Ionomycin)激活5分鐘，之后在含有6- 二甲基苯胺嘌呤(6-DMAP)的培養基中培養5小時。最后將克隆胚移入正常培養基中培養過夜，第二天移入寄母羊輸卵管中。寄母羊通過妊娠期可產下定點整合的ATIII轉基因克隆羊。該克隆羊即為轉基因動物反應器，其乳汁中含有高效表達的ATIII藥用蛋白。
權利要求
1.一種表達抗凝血酶III的重組羊胎兒成纖維細胞，為轉hATIII基因成纖維細胞SMl sCh-AT，其保藏編號為 CCTCC C 2012103。
2.權利要求I所述的重組羊胎兒成纖維細胞的制備方法，是將攜帶有整合了人的抗凝血酶III蛋白基因的表達載體轉染入羊胎兒成纖維細胞內，再篩選出目的基因rhATIII已整合到基因組上的山羊胎兒成纖維細胞。
3.權利要求I所述的重組羊胎兒成纖維細胞在制備奶山羊生物反應器中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種表達抗凝血酶III的重組羊胎兒成纖維細胞，為轉hATIII基因成纖維細胞SMlsCh-AT,已于2012年8月15日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC C 2012103。本發明通過構建的rhATIII乳腺特異性表達載體，使目的基因rhATIII整合到羊胎兒成纖維細胞的基因組上。通過在rhATIII基因兩端克隆山羊β酪蛋白基因的5’和3’調控區，可以指導目的基因在山羊乳腺組織中特異的高效表達。本發明的包含目的基因rhATIII的山羊胎兒成纖維細胞可作為核移植構建轉基因克隆胚的核供體細胞，通過體細胞核移植法獲得轉基因克隆胚，將所得胚胎移入受體羊的子宮即可高效率生產出轉rhATIII基因的奶山羊生物反應器。
文檔編號C12R1/91GK102899292SQ20121036248
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月25日 優先權日2012年9月25日
發明者鄒賢剛, 趙雅琳, 袁三平 申請人:青島森淼實業有限公司