專利名稱：用于核酸恒溫擴增反應中防止核酸污染和指示其反應結果的方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域中核酸的分子生物學檢測方法，特別是涉及一種用于核酸恒溫擴增反應中防止核酸污染和指示反應結果的方法。
背景技術：
核酸恒溫擴增方法目前主要包括以下幾種環介導恒溫擴增(loop -mediated isothermal amplification, LAMP)、切口酶核酸恒溫擴增(nicking enzymemediated amplification, NEMA)、鏈替代擴增(strand displacement amplification,SDA)、滾環擴增(rolling circle amplification, RCA)、依賴解旋酶的恒溫基因擴增(helicase — dependent isothermal DNA amplification, HAD)、轉錄依賴的擴增系統(transcription 一 based amplification system, TAS)、依賴核酸序列的擴增(NASBA)又稱自主序列復制系統(self — sustained sequence replication, 3SR)、QB 復制酶擴增(Q —beta replicase — amplified assay)等。恒溫擴增擺脫了熱循環的限制,使其應用范圍大大增加，而且目前應用的恒溫擴增方法都有較高的敏感性和特異性，在核酸檢測中應用范圍非常廣。但敏感性高會帶來擴增物污染和假陽性的問題，從而導致反應結果判讀不準確。其中，環介導恒溫擴增技術(LAMP)是一種快速、特異、敏感的核酸檢測方法，再加之其操作簡單，不需要昂貴復雜的儀器，近十多年發展迅速，廣泛應用于基因檢測的各個領域。雖然LAMP技術已日趨成熟，但將其真正應用到病原微生物實際臨床檢測或檢疫單位檢測病原微生物的實例卻少之又少，大多都局限于實驗室內的基因篩查，究其主要原因，就是假陽性的問題，也就是擴增產物污染不可控。因為LAMP具有非常高的敏感性，任何一點擴增物的溢出都將給LAMP實驗帶來不可控的污染問題，因此，迫切需要一種用于環介導恒溫擴增技術(LAMP)中防止核酸污染和指示反應結果的方法。
發明內容
為解決現有核酸恒溫擴增反應中擴增物易污染和易產生假陽性導致結果判讀不準確的問題，本發明的目的是提供一種用于核酸恒溫擴增反應中防止核酸污染和指示反應結果的方法。本發明所提供的用于核酸恒溫擴增反應中防止核酸污染的方法，是將熔點低于核酸恒溫擴增反應溫度0-25°C、直徑與反應管管徑相同的柱狀全精煉固態石蠟塊或半精煉固態石臘塊加入到反應管中反應液的上方，然后蓋上蓋，將反應管置于恒溫容器進行核酸恒溫擴增反應，在反應溫度下全精煉固態石蠟塊或半精煉固態石蠟塊融化成為液態石蠟覆蓋在反應液上表面，使反應液在封閉狀態下進行反應，反應結束后冷卻至室溫液態石蠟又恢復為固態，最后用濁度儀對反應液進行結果判讀，在整個反應過程中反應液始終與外界隔離，可達到防止核酸污染和避免結果假陽性的目的。所述防止核酸污染的方法適用于所有恒溫核酸擴增技術，主要包括環介導恒溫擴增技術(LAMP)、切口酶核酸恒溫擴增技術、鏈替代擴增技術、滾環擴增技術、依賴解旋酶的恒溫基因擴增技術、轉錄依賴的擴增系統、依賴核酸序列的擴增技術(又稱自主序列復制系統)、QB復制酶擴增技術等，尤其適用于環介導恒溫擴增技術(LAMP)。以環介導恒溫擴增技術(LAMP)為例，本發明防止核酸污染的方法包括以下步驟I)將熔點為40_60°C的全精煉固態石蠟或半精煉固態石蠟融化后導入模具后再降溫使其凝固，將石蠟制成適用于反應管大小(直徑與反應管管徑相同)的柱狀固態石蠟塊；2)在反應管中將LAMP反應液混合好，將石蠟塊加入到反應液的上方；3)蓋上蓋，將反應管置于60_65°C恒溫容器中進行環介導恒溫擴增反應，在反應溫度下固態石臘塊融化成為液態石臘覆蓋在反應液上表面，使反應液在封閉狀態下進行反應；4)反應結束后，冷卻至室溫，待液態石蠟恢復為固態后用濁度儀進行結果判讀。 本發明所提供的用于核酸恒溫擴增反應中指示反應結果的方法，具體為用于核酸恒溫擴增反應中用指示劑進行結果判讀并可避免指示劑抑制反應的方法，是將熔點高于核酸恒溫擴增反應溫度5-25°C的全精煉固態石蠟或半精煉固態石蠟融化后與指示劑混勻，降溫后制成直徑與反應管管徑相同的柱狀固態石蠟塊，然后將石蠟塊加入到反應管中反應液的上方，蓋上蓋，將反應管置于恒溫容器進行核酸恒溫擴增反應，在反應過程中固態石蠟覆蓋在反應液上表面，使反應液在封閉狀態下進行反應，反應結束后將溫度升高至固態石臘的熔點以上使固態石蠟融化成液態石蠟，石蠟中的指示劑釋放到反應液中，根據反應液的顏色變化進行結果判讀。所述方法適用于所有恒溫核酸擴增技術，主要包括環介導恒溫擴增技術(LAMP)、切口酶核酸恒溫擴增技術、鏈替代擴增技術、滾環擴增技術、依賴解旋酶的恒溫基因擴增技術、轉錄依賴的擴增系統、依賴核酸序列的擴增技術(又稱自主序列復制系統)、QB復制酶擴增技術等，尤其適用于環介導恒溫擴增技術(LAMP)。所述指示劑包括鈣黃綠素、羥基萘芬蘭、溴化乙錠、GeneFinder核酸染料、Goldview核酸染料、YBER green I核酸染料、GelRed和GelGreen核酸染料。以環介導恒溫擴增技術(LAMP)為例，所述用指示劑進行結果判讀的方法包括以下步驟I)將熔點為70_85°C的全精煉固態石蠟或半精煉固態石蠟融化后與指示劑混勻，導入模具后再降溫使其凝固，將石蠟制成適用于反應管大小(直徑與反應管管徑相同)的柱狀固態石蠟塊；2)在反應管中將LAMP反應液混合好，將石蠟塊加入到反應液的上方；3)蓋上蓋，將反應管置于60_65°C恒溫容器中進行環介導恒溫擴增反應，在反應過程中固態石臘覆蓋在反應液上表面，使反應液在封閉狀態下進行反應；4)反應結束后，將溫度升高至固態石蠟的熔點以上使固態石蠟融化成液態石蠟，石蠟中的指示劑釋放到反應液中，根據反應液的顏色變化進行結果判讀。環介導恒溫擴增技術(LAMP)中，所述指示劑為鈣黃綠素或羥基萘芬蘭。本發明提供了一種用于核酸恒溫擴增反應中防止核酸污染和指示反應結果的方法，并以LAMP反應為例進行了說明。用于LAMP反應中防止核酸污染的方法是采用熔點為40-600C的全精煉石蠟或半精煉石蠟，利用其在LAMP反應溫度(60_65°C )時為液態，反應結束后冷卻至室溫又恢復為固態的原理來防止污染。如果通過濁度來判斷結果則不需要加指示劑，如果通過指示劑來指示反應結果且使指示劑(例如鈣黃綠素、羥基萘芬蘭等)不抑制恒溫擴增反應便可以將抑制LAMP反應的指示劑放入熔點為70°C _85°C的全精煉石蠟或半精煉石蠟中，待恒溫擴增反應結束后再將溫度升至石蠟熔點使石蠟融化，指示劑釋放便可以指示恒溫擴增反應結果。本發明具有以下優點I)特殊熔點蠟塊容易配制，價格低廉；2)固態封閉效果好，可永久封閉，從而避免了擴增物受到污染，液 態封閉劑如果口打開后仍能造成污染；3)該方法可以有效防止核酸恒溫擴增反應結果的假陽性；4)對核酸恒溫擴增反應無任何影響；5)應用此方法可以不用嚴格的實驗分區，反應區和加樣區可以合二為一；6)應用范圍廣，本發明適用于所有核酸恒溫擴增反應。下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。
圖I為石蠟塊及鈣黃綠素FD對LAMP反應的影響圖2為用兩套不同的LAMP引物驗證石蠟塊封閉效果的檢測結果圖3為不同熔點石蠟對LAMP反應的影響圖4A-圖4C顯示用于核酸恒溫擴增反應中防止核酸污染的方法的過程示意圖，圖4A為準備加入石蠟塊；圖4B為將石蠟塊加入到反應液的上方；圖4C為用濁度儀進行結果判讀；圖5為抑制LAMP反應的指示劑與石蠟混合后對LAMP反應的影響圖6A-圖6C顯示用于核酸恒溫擴增反應中指示反應結果的方法的過程示意圖，圖6A為準備加入石臘塊；圖6B為將石臘塊加入到反應液的上方；圖6C為根據反應液的顏色變化進行結果判讀。
具體實施例方式本發明提供了一種用于核酸恒溫擴增反應中防止核酸污染和指示反應結果的方法。本發明所提供的用于核酸恒溫擴增反應中防止核酸污染的方法，是將熔點低于核酸恒溫擴增反應溫度0-25°C、直徑與反應管管徑相同的柱狀全精煉固態石蠟塊或半精煉固態石臘塊加入到反應管中反應液的上方，然后蓋上蓋，將反應管置于恒溫容器進行核酸恒溫擴增反應，在反應溫度下全精煉固態石蠟塊或半精煉固態石蠟塊融化成為液態石蠟覆蓋在反應液上表面，使反應液在封閉狀態下進行反應，反應結束后冷卻至室溫液態石蠟又恢復為固態，最后用濁度儀對反應液進行結果判讀，在整個反應過程中反應液始終與外界隔離，可達到防止核酸污染和避免結果假陽性的目的。本發明所提供的防止核酸污染的方法適用于所有恒溫核酸擴增技術，主要包括環介導恒溫擴增技術(LAMP)、切口酶核酸恒溫擴增技術、鏈替代擴增技術、滾環擴增技術、依賴解旋酶的恒溫基因擴增技術、轉錄依賴的擴增系統、依賴核酸序列的擴增技術(又稱自主序列復制系統)、QB復制酶擴增技術等，尤其適用于環介導恒溫擴增技術(LAMP)。以環介導恒溫擴增技術(LAMP)為例，本發明防止核酸污染的方法可包括以下步驟I)將熔點為40_60°C的全精煉固態石蠟或半精煉固態石蠟融化后導入模具后再降溫使其凝固，將石蠟制成適用于反應管大小(直徑與反應管管徑相同)的柱狀固態石蠟塊；2)在反應管中將LAMP反應液混合好，將石蠟塊加入到反應液的上方；3)蓋上蓋，將反應管置于60_65°C恒溫容器中進行環介導恒溫擴增反應，在反應溫度下固態石臘塊融化成為液態石臘覆蓋在反應液上表面，使反應液在封閉狀態下進行反應；4)反應結束后,冷卻至室溫,待液態石臘恢復為固態后用濁度儀對反應液進行結果判讀。上述核酸恒溫擴增反應中用濁度儀進行結果判讀，不需要添加指示劑。本發明還提供了一種方便觀測的用指示劑進行結果判讀并可避免指示劑抑制反應的方法。本發明所提供的用指示劑進行結果判讀的核酸恒溫擴增反應方法，是將熔點高于核酸恒溫擴增反應溫度5_25°C的全精煉固態石蠟或半精煉固態石蠟融化后與指示劑混勻，降溫后制成直徑與反應管管徑相同的柱狀固態石蠟塊，然后將石蠟塊加入到反應管中反應液的上方，蓋上蓋，將反應管置于恒溫容器進行核酸恒溫擴增反應，在反應過程中固態石蠟覆蓋在反應液上表面，使反應液在封閉狀態下進行反應，反應結束后將溫度升高至固態石蠟的熔點以上使固態石蠟融化成液態石蠟，石蠟中的指示劑釋放到反應液中，根據反應液的顏色變化進行結果判讀。本發明所提供的用指示劑進行結果判讀的方法適用于所有恒溫核酸擴增技術，主要包括環介導恒溫擴增技術(LAMP)、切口酶核酸恒溫擴增技術、鏈替代擴增技術、滾環擴增技術、依賴解旋酶的恒溫基因擴增技術、轉錄依賴的擴增系統、依賴核酸序列的擴增技術(又稱自主序列復制系統)、QB復制酶擴增技術等，尤其適用于環介導恒溫擴增技術(LAMP )。所述指示劑包括鈣黃綠素、羥基萘芬蘭、溴化乙錠、GeneFinder核酸染料、Goldview核酸染料、YBER green I核酸染料、GelRed和GelGreen核酸染料等。以環介導恒溫擴增技術(LAMP)為例，本發明用指示劑進行結果判讀的方法可包括以下步驟I)將熔點為70_85°C的全精煉固態石蠟或半精煉固態石蠟融化后與指示劑混勻，導入模具后再降溫使其凝固，將石蠟制成適用于反應管大小(直徑與反應管管徑相同)的柱狀固態石蠟塊；2)在反應管中將LAMP反應液混合好，將石蠟塊加入到反應液的上方；3)蓋上蓋，將反應管置于60_65°C恒溫容器中進行環介導恒溫擴增反應，在反應過程中固態石臘覆蓋在反應液上表面，使反應液在封閉狀態下進行反應；4)反應結束后，將溫度升高至固態石蠟的熔點以上使固態石蠟融化成液態石蠟，石蠟中的指示劑釋放到反應液中，根據反應液的顏色變化進行結果判讀。在上述用指示劑進行結果判讀的環介導恒溫擴增技術(LAMP)中，所述指示劑優選為鈣黃綠素或羥基萘芬蘭。·
實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，實施例將有助于理解本發明，但是本發明的保護范圍不限于下述的實施例。下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。下述實驗例和實施例適用于所有恒溫核酸擴增技術，主要包括環介導恒溫擴增技術(LAMP)、切口酶核酸恒溫擴增技術、鏈替代擴增技術、滾環擴增技術、依賴解旋酶的恒溫基因擴增技術、轉錄依賴的擴增系統、依賴核酸序列的擴增技術(又稱自主序列復制系統)、QB復制酶擴增技術等，以環介導恒溫擴增技術(LAMP)為例進行說明。實驗例I、檢測石蠟塊及指示劑(鈣黃綠素FD)是否抑制LAMP反應檢測石蠟塊是否抑制LAMP反應，具體實驗方法包括以下步驟I)將熔點為42°C (40_60°C均可)的半精煉固態石蠟(或全精煉固態石蠟)融化后導入模具后再降溫使其凝固，將石蠟制成適用于反應管大小(直徑與反應管管徑相同)的柱 狀固態石蠟塊；2)實驗分為六組陰性對照組(石蠟及鈣黃綠素均不加，陰性指LAMP反應的模板為雙蒸水，為質量控制，保證操作過程和引物沒有被污染)、加FD陽性組(添加鈣黃綠素，陽性指LAMP反應的模板為靶基因片段)、不加FD陽性組(不添加鈣黃綠素，陽性指LAMP反應的模板為靶基因片段)，陰性對照+石蠟組(添加石蠟，陰性指LAMP反應的模板為雙蒸水)、加FD陽性+石蠟組(添加石蠟及鈣黃綠素，陽性指LAMP反應的模板為靶基因片段)、無FD陽性+石蠟組(添加石蠟，陰性指LAMP反應的模板為雙蒸水)；3)將反應液加入反應管中，反應液成分為含NDM-I的飽鮑曼不動桿菌的基因組 DNA2yl，20mM Tris · HCl (pH8. 8), IOmM KCl, IOmM (NH4)2SO4,0. I % Tween20,0. 8M甜菜喊(betaine),8mM MgSO4, I. 4mM dNTP each,8UBst DNA 聚合酶，弓丨物 2μ1 (引物序列為 NDM-FIP CTGGCGGTGGTGACTCACGTTTTGCATGCAGCGCGTCCA (序列表中序列 I);NDM-BIP CGCGACCGGCAGGTTGATCTTTTGGTCGATACCGCCTGGAC (序列表中序列 2) ；NDM-LF GCATCAGGACAAGATGGGC (序列表中序列 3);NDM_LB TCCAGTTGAGGATCTGGG (序列表中序列 4);NDM-F3 GCATAAGTCGCAATCCCCG (序列表中序列 5) ;NDM_B3 GGTTTGATCGTCAGGGATGG (序列表中序列6))，按上述實驗分組添加或不添加石蠟和/或鈣黃綠素，蓋上蓋，將反應管置于LA-320C濁度儀進行環介導恒溫擴增反應；4)反應過程中用LA-320C濁度儀在400nm下進行實時檢測結果判讀(看反應時間和反應曲線有無變化)。結果如圖I所示，可以看出加石蠟組和不加石蠟組發生反應的時間相同，表明石臘不抑制LAMP反應；加指示劑組相對于不加指示劑組反應時間推遲,表明指示劑(I丐黃綠素FD)抑制LAMP反應。實驗例2、用兩套不同的LAMP弓丨物驗證石蠟塊的封閉效果用兩套不同的LAMP引物驗證石蠟塊的封閉效果，具體實驗方法包括以下步驟I)將熔點為42°C (40_60°C均可)的半精煉固態石蠟(或全精煉固態石蠟)融化后導入模具后再降溫使其凝固，將石蠟制成適用于反應管大小(直徑與反應管管徑相同)的柱狀固態石蠟塊；2)實驗分為四組引物I加石蠟組(添加引物I和石蠟)、引物I不加石蠟組(添加引物I和石蠟)、引物2加石蠟組(添加引物2和石蠟)、引物2不加石蠟組(添加引物2和石蠟)；
3)將反應液加入反應管中，反應液成分為含NDM-I的飽鮑曼不動桿菌(適用于引物I)和結核桿菌(適用于引物2)的基因組DNA2y l，20mM Tri s · HCl (pH8. 8)，IOmMKC1，IOmM(NH4)2SO4,0. 1% Tween20，0. 8M 甜菜堿(betaine)，8mM MgSO4,1. 4mM dNTP each,8U Bst DNA聚合酶，引物2μ I (引物I序列為引物序列如下NDM-FIP CTGGCGGTGGTGACTCACGTTTTGCATGCAGCGCGTCCA (序列表中序列 I) ；NDM-BIP CGCGACCGGCAGGTTGATCTTTTGGTCGATACCGCCTGGAC (序列表中序列 2) ；NDM-LF GCATCAGGACAAGATGGGC (序列表中序列 3)；NDM-LB TCCAGTTGAGGATCTGGG (序列表中序列 4) ；NDM-F3 GCATAAGTCGCAATCCCCG (序列表中序列5) ；NDM-B3 GGTTTGATCGTCAGGGATGG (序列表中序列6)。引物2序列為JH_F3 TCGGACCACCAGCACC (序列表中序列 7) ；JH-B3 GCGGGTCCAGATGGCTTG (序列表中序列 8)； JH-FIP ACGTAGGCGAACCCTGCCCTTTTTAACCGGCTGTGGGTAGC (序列表中序列 9);JH_BIP =CGACGCCTACGCTCTTTTTCGCGTCGAGGACCATG (序列表中序列 10);JH_LF AGGTCGACACATAGGTGAGG (序列表中序列11) ； JH-LB CGGGTCGCTTCCACGAT (序列表中序列12))，按上述實驗分組添加或不添加石蠟，蓋上蓋，將反應管置于60-65°C恒溫容器中進行環介導恒溫擴增反應，在離反應區域I米、5米、10米、15米、20米的五個不同方向分別各取4個位點加樣重復兩組引物，比較假陽性率；4)反應過程中用LA-320C濁度儀在400nm下進行結果判讀。結果如圖2所示，可以看出添加蠟塊組并沒有發現假陽性，而未添加蠟塊組有假陽性，表明添加蠟塊后可以有效的防止擴增物的污染，可避免結果出現假陽性。實驗例3、不同熔點石蠟對LAMP反應的影響檢測不同熔點石蠟對LAMP反應的影響，具體實驗方法包括以下步驟I)將不同熔點(36°C、44°C、52°C、60°C、64°C)的半精煉固態石蠟融化后分別導入模具后再降溫使其凝固，將石蠟制成適用于反應管大小(直徑與反應管管徑相同)的柱狀固態石蠟塊；2)實驗按石蠟的熔點不同分為五組36°C石蠟組(添加熔點為36°C的石蠟)、44°C石蠟組(添加熔點為44 V的石蠟)>52 0C石蠟組(添加熔點為52V的石蠟)、60 V石蠟組(添加熔點為60°C的石蠟)、64°C石蠟組(添加熔點為64°C的石蠟)；3)將反應液加入反應管中，反應液成分為含NDM-I的飽鮑曼不動桿菌的基因組 DNA2yl，20mM Tris · HCl (pH8. 8), IOmM KCl, IOmM(NH4)2S04,0. I % Tween20,0. 8M甜菜喊(betaine),8mM MgS04,1. 4mM dNTP each,8U Bst DNA 聚合酶，弓丨物 2μ1 (引物序列為 NDM-FIP CTGGCGGTGGTGACTCACGTTTTGCATGCAGCGCGTCCA (序列表中序列 I);NDM-BIP CGCGACCGGCAGGTTGATCTTTTGGTCGATACCGCCTGGAC (序列表中序列 2)；NDM-LF GCATCAGGACAAGATGGGC (序列表中序列 3);NDM_LB TCCAGTTGAGGATCTGGG (序列表中序列 4);NDM-F3 GCATAAGTCGCAATCCCCG (序列表中序列 5) ;NDM_B3 GGTTTGATCGTCAGGGATGG (序列表中序列6)，按上述實驗分組添加不同熔點的石蠟，蓋上蓋，將反應管置于60-65°C恒溫容器中進行環介導恒溫擴增反應；4)反應過程中用LA-320c池度儀在400nm下進行結果判讀(看反應時間和反應曲線有無變化)。結果如圖3所示，可以看出不同熔點的石蠟發生LAMP反應的時間是相同的，表明不同熔點蠟塊對LAMP反應沒有影響，因為蠟塊不溶于LAMP反應液，所以不會對LAMP反應本身造成影響。但是，如果蠟塊的熔點低于室溫，那么便會存在不易保存的問題；如果蠟塊熔點高于63°C，便會存在不防污染的問題，所以蠟塊的熔點要在40°C -60°C范圍之間，針對其他恒溫擴增反應技術，蠟塊的熔點要低于核酸恒溫擴增反應溫度0-25°C。基于實驗例1-3， 本發明用于恒溫擴增反應中防止核酸污染的方法可包括以下步驟I)將熔點低于核酸恒溫擴增反應溫度0_25°C (環介導恒溫擴增反應中采用熔點為40_60°C的石蠟)的全精煉固態石蠟或半精煉固態石蠟融化后導入模具后再降溫使其凝固，將石蠟制成適用于反應管大小(直徑與反應管管徑相同)的柱狀固態石蠟塊；2)在反應管中將恒溫擴增反應液混合好，準備加入石蠟塊(見圖4A)，將石蠟塊加入到反應液的上方(見圖4B)；3)蓋上蓋，將反應管置于恒溫容器中進行環介導恒溫擴增反應(環介導恒溫擴增反應置于60-65°C恒溫容器中進行反應),在反應溫度下固態石臘塊融化成為液態石臘覆蓋在反應液上表面，使反應液在封閉狀態下進行反應；4)反應過程中用濁度儀進行結果判讀(見圖4C)。實驗例4、抑制LAMP反應的指示劑與石蠟混合后對LAMP反應的影響檢測抑制LAMP反應的指示劑(鈣黃綠素FD)與石蠟混合后對LAMP反應的影響，具體實驗方法包括以下步驟I)將將熔點為76°C (70_85°C均可)的半精煉固態石蠟(或全精煉固態石蠟)融化后與指示劑(鈣黃綠素FD)混勻，導入模具后再降溫使其凝固，將石蠟制成適用于反應管大小(直徑與反應管管徑相同)的柱狀固態石蠟塊；2)實驗分為三組空白對照組(不添加石蠟及鈣黃綠素)、無染料石蠟組(添加石蠟，不添加鈣黃綠素)、含染料石蠟組(添加混有鈣黃綠素的石蠟)；3)將反應液加入反應管中，反應液成分為含NDM-I的飽鮑曼不動桿菌的基因組 DNA2yl，20mM Tris · HCl (pH8. 8), IOmM KCl, IOmM (NH4)2SO4,0. I % Tween20,0. 8M甜菜喊(betaine),8mM MgSO4,1. 4mM dNTP each,8U Bst DNA 聚合酶，引物 2μ I (引物序列為 NDM-FIP CTGGCGGTGGTGACTCACGTTTTGCATGCAGCGCGTCCA (序列表中序列 I);NDM-BIP CGCGACCGGCAGGTTGATCTTTTGGTCGATACCGCCTGGAC (序列表中序列 2) ；NDM-LF GCATCAGGACAAGATGGGC (序列表中序列 3) ；NDM-LB TCCAGTTGAGGATCTGGG (序列表中序列4)；NDM-F3 GCATAAGTCGCAATCCCCG (序列表中序列 5);NDM_B3 GGTTTGATCGTCAGGGATGG (序列表中序列6)，按上述實驗分組添加或不添加石蠟和/或鈣黃綠素，蓋上蓋，將反應管置于60-65°C恒溫容器中進行環介導恒溫擴增反應；4)反應結束后，將溫度升高至固態石蠟的熔點以上(76°C以上)使固態石蠟融化成液態石蠟，石蠟中的指示劑釋放到反應液中，根據反應液的顏色變化進行結果判讀，并用LA-320C濁度儀在400nm下對結果進行精確判讀(看反應時間和反應曲線有無變化)。結果如圖5所示，可以看出石蠟及指示劑對LAMP反應均無影響，表明將指示劑混入高熔點的石蠟后可消除指示劑對LAMP反應的抑制作用。基于實驗例4，本發明用于恒溫擴增反應中用指示劑進行結果判讀的方法可包括以下步驟I)將熔點高于核酸恒溫擴增反應溫度5_25°C (環介導恒溫擴增反應中采用熔點為70-85°C的石蠟)的全精煉固態石蠟或半精煉固態石蠟融化后與指示劑混勻，導入模具后再降溫使其凝固，將石蠟制成適用于反應管大小(直徑與反應管管徑相同)的柱狀固態石蠟塊；2)在反應管中將恒溫擴增反應液混合好，準備加入石蠟快(見圖6A)，將石蠟塊加入到反應液的上方(見圖6B)；3)蓋上蓋，將反應管置于恒溫容器中進行環介導恒溫擴增反應(環介導恒溫擴增反應置于60-65°C恒溫容器中進行反應)，在反應過程中固態石蠟覆蓋在反應液上表面，使反應液在封閉狀態下進行反應；4)反應結束后，將溫度升高至固態石蠟的熔點以上使固態石蠟融化成液態石蠟， 石蠟中的指示劑釋放到反應液中，根據反應液的顏色變化進行結果判讀(見圖6C)。
權利要求
1.一種用于核酸恒溫擴增反應中防止核酸污染的方法，是將熔點低于核酸恒溫擴增反應溫度0-25°C、直徑與反應管管徑相同的柱狀全精煉固態石蠟塊或半精煉固態石蠟塊加入到反應管中反應液的上方，然后蓋上蓋，將反應管置于恒溫容器進行核酸恒溫擴增反應，在反應溫度下全精煉固態石蠟塊或半精煉固態石蠟塊融化成為液態石蠟覆蓋在反應液上表面，使反應液在封閉狀態下進行反應，反應結束后冷卻至室溫液態石蠟又恢復為固態，最后用濁度儀對反應液進行結果判讀，在整個反應過程中反應液始終與外界隔離，可達到防止核酸污染和避免結果假陽性的目的。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述防止核酸污染的方法適用于所有恒溫核酸擴增技術，主要包括環介導恒溫擴增技術(LAMP)、切口酶核酸恒溫擴增技術、鏈替代擴增技術、滾環擴增技術、依賴解旋酶的恒溫基因擴增技術、轉錄依賴的擴增系統、依賴核酸序列的擴增技術(又稱自主序列復制系統)、QB復制酶擴增技術等，尤其適用于環介導恒溫擴增技術(LAMP)。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于以環介導恒溫擴增技術(LAMP)為例，本發明防止核酸污染的方法包括以下步驟 1)將熔點為40-60°C的全精煉固態石蠟或半精煉固態石蠟融化后導入模具后再降溫使其凝固，將石蠟制成適用于反應管大小(直徑與反應管管徑相同)的柱狀固態石蠟塊； 2)在反應管中將LAMP反應液混合好，將石蠟塊加入到反應液的上方； 3)蓋上蓋，將反應管置于60-65°C恒溫容器中進行環介導恒溫擴增反應，在反應溫度下固態石臘塊融化成為液態石臘覆蓋在反應液上表面，使反應液在封閉狀態下進行反應； 4)反應結束后，冷卻至室溫，待液態石蠟恢復為固態后用濁度儀進行結果判讀。
4.一種用于核酸恒溫擴增反應中用指示劑進行結果判讀并可避免指示劑抑制反應的方法，是將熔點高于核酸恒溫擴增反應溫度5-25°C的全精煉固態石蠟或半精煉固態石蠟融化后與指示劑混勻，降溫后制成直徑與反應管管徑相同的柱狀固態石蠟塊，然后將石蠟塊加入到反應管中反應液的上方，蓋上蓋，將反應管置于恒溫容器進行核酸恒溫擴增反應，在反應過程中固態石臘覆蓋在反應液上表面，使反應液在封閉狀態下進行反應，反應結束后將溫度升高至固態石蠟的熔點以上使固態石蠟融化成液態石蠟，石蠟中的指示劑釋放到反應液中，根據反應液的顏色變化進行結果判讀。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述方法適用于所有恒溫核酸擴增技術，主要包括環介導恒溫擴增技術(LAMP)、切口酶核酸恒溫擴增技術、鏈替代擴增技術、滾環擴增技術、依賴解旋酶的恒溫基因擴增技術、轉錄依賴的擴增系統、依賴核酸序列的擴增技術(又稱自主序列復制系統)、QB復制酶擴增技術等，尤其適用于環介導恒溫擴增技術(LAMP )。
6.根據權利要求4或5所述的方法，其特征在于所述指示劑包括鈣黃綠素、羥基萘芬蘭、溴化乙淀、GeneFinder核酸染料、Goldview核酸染料、YBER green I核酸染料、GelRed和GelGreen核酸染料。
7.根據權利要求4或5或6所述的方法，其特征在于以環介導恒溫擴增技術(LAMP)為例，所述用指示劑進行結果判讀的方法包括以下步驟 I)將熔點為70-85°C的全精煉固態石蠟或半精煉固態石蠟融化后與指示劑混勻，導入模具后再降溫使其凝固，將石蠟制成適用于反應管大小(直徑與反應管管徑相同)的柱狀固態石蠟塊；2)在反應管中將LAMP反應液混合好，將石蠟塊加入到反應液的上方； 3)蓋上蓋，將反應管置于60-65°C恒溫容器中進行環介導恒溫擴增反應，在反應過程中固態石臘覆蓋在反應液上表面，使反應液在封閉狀態下進行反應； 4)反應結束后，將溫度升高至固態石蠟的熔點以上使固態石蠟融化成液態石蠟，石蠟中的指示劑釋放到反應液中，根據反應液的顏色變化進行結果判讀。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述指示劑為鈣黃綠素或羥基萘芬蘭。
全文摘要
本發明提供了一種用于核酸恒溫擴增反應中防止核酸污染和指示反應結果的方法。以LAMP反應為例，用熔點為40-60℃的全精煉石蠟或半精煉石蠟，利用其在LAMP反應溫度(60-65℃)時為液態，反應結束后冷卻至室溫又恢復為固態的原理來防止污染。可通過濁度來判斷結果，或通過指示劑來指示恒溫擴增反應結果。本發明采用容易配制的特殊熔點蠟塊，價格低廉，固態封閉效果好，可永久封閉，從而避免了擴增物受到污染，有效防止核酸恒溫擴增反應結果的假陽性，適用于所有核酸恒溫擴增反應。
文檔編號C12Q1/68GK102936623SQ201210371448
公開日2013年2月20日 申請日期2012年9月28日 優先權日2012年9月28日
發明者袁靜, 劉威, 黃留玉 申請人:中國人民解放軍疾病預防控制所