一種茶皂素脫色酶及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種茶皂素脫色酶及其制備方法，所述茶皂素脫色酶以黃孢原毛平革菌為生產菌種，接種于液體生產培養基中經發酵、超聲波提取、沉淀、干燥后獲得；所述液體生產培養基各組分組成為：葡萄糖20-50g/l，硫酸錳0.01-0.05g/l，硝酸鈉0.8-1.5g/l，硫酸鎂2-8g/l，茶皂素0.2-0.8g/l，余量為水。本發明利用葡萄糖做為發酵主原料，配制成高效的液體生產培養基，且整個生產過程中無需添加其它價格昂貴的試劑，生產成本較低；得到的茶皂素脫色酶是一種環境友好的大分子蛋白質，脫色條件溫和，脫色后茶皂素損失率低，且只需噴霧干燥就可以回收得到茶皂素粉末。
【專利說明】一種茶皂素脫色酶及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及微生物發酵和酶工程【技術領域】，特別涉及一種茶皂素脫色酶及其制備方法。
【背景技術】
[0002]茶皂素是從山茶科植物中提取得到的五環三萜類糖苷化合物，是一種性能優良的非離子表面活性劑，具有較強的乳化、分散、濕潤、起泡、穩泡等作用，可廣泛應用于輕工、化工、農藥、飼料、紡織、礦產和建筑等領域，用于制造乳化劑、洗滌劑、農藥助劑、飼料添加劑、紡織助劑和阻凝劑等。目前使用較多的為茶皂素粗提物經噴霧干燥得到的粉末，其中含有大量的美拉德色素、多酚和黃酮類色素物質，5%的茶皂素粗提物的水溶液為顏色較深的棕褐色，嚴重影響到了其推廣應用，如:茶皂素對草甘膦等多種農藥具有良好的增效作用，但由于顏色問題影響了產品的外觀，從而導致添加茶皂素的產品無法達到國外產品標準；茶皂素在應用于洗滌用品時對色澤的要求就更為苛刻，尤其是在高檔日化用品中的應用更是受到了限制，目前國內有f 2家茶皂素企業嘗試打入日本和我國臺灣地區日化用品市場，但由于無法做到他們的色澤要求，只能以粗產品形式出售(對方通過自有技術脫色后再利用)，產品價格和利潤均不理想。
[0003]國內對茶皂素的脫色研究主要采用物理和化學方法，如丁姍姍等利用大孔吸附樹脂NKA-1I對茶皂素粗提物進行脫色研究，結果表明NKA-1I樹脂具有較高的吸附和解吸能力，在40°C下NKA-1I樹脂對茶皂素的吸附等溫線符合Frundlich方程；經過動態吸附解吸后，提取物中茶皂素含量由600 mg/g提高到861.3 mg/g，脫色后的茶皂素樣品在可見光區的吸收強度降低(利用大孔吸附樹脂對茶皂素粗提物脫色的研究，丁姍姍等，《食品與機械》2012年第04期)。劉昌盛等采用白土、活性炭、H2O2和EDTA四種脫色劑對茶皂素進行脫色比較實驗，結果表明白土和活性炭脫色效果要比H2O2差，經白土脫色的茶皂素較為渾濁，活性炭脫色后過濾較為困難，且有10%以上的茶皂素損失，H2O2和EDTA混合使用效果和單獨使用H2O2效果相近，而且脫色時僅有0.97%茶皂素損耗；經分析對比，得出最佳脫色條件為:脫色溫度70°C、脫色時間90 min,H2O2加入量為4%、溶液pH值為10(茶皂素脫色工藝研究，《糧食與油脂》2004年第12期)。孫冀平等采用活性炭、活性白土、H2O2, NaClO和NH3.H2O(10%)進行脫色試驗，結果表明，NaClO法脫色時間短，操作條件要求低，但在加熱條件下極易回色，且產品有刺激性氣味；氨水脫色效果極差，對茶皂素的顏色幾乎無任何影響；茶皂素會吸附于活性白土和活性炭，造成損失過大；H202脫色效果最好，正交實驗得出最佳操作條件為:溫度60°C，時間90 min, H2O2 (30%)加入量為5 mL (茶皂素的脫色研究，《中國油月旨》2003年第4期)。
[0004]上述方 法雖然對茶皂素的脫色進行了物理和化學脫色方法的研究，但存在的問題是:或者需要較高的溫度和在強堿條件下會對操作者產生傷害并對環境產生污染，或者由于吸附作用造成茶皂素很大的損失和回收困難，這些問題都阻礙了茶皂素脫色的產業化，而對于綠色環保的生物酶脫色茶皂素的工藝仍未見相關報道。[0005]
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于解決現有技術中所存在的或者在強堿條件下會對操作者產生 傷害并對環境產生污染，或者由于吸附作用造成茶皂素很大的損失和回收困難的問題，提 供一種茶皂素脫色酶，對環境友好，生產成本低，用于茶皂素脫色時脫色條件溫和，脫色后 茶皂素損失率低，且茶皂素回收簡便。
[0007]本發明還提供了該茶皂素脫色酶的制備方法。
[0008]本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：
一種茶皂素脫色酶，所述茶皂素脫色酶以黃孢原毛平革菌為生產菌種，接種于液體生 產培養基中經發酵、超聲波提取、沉淀、干燥后獲得；所述液體生產培養基各組分組成為： 葡萄糖20-50 g/1，硫酸錳0.01-0. 05 g/1，硝酸鈉0.8-1. 5 g/1，硫酸鎂2-8 g/1，茶皂素 0.2-0. 8 g/1，余量為水。
[0009]黃孢原毛平革菌chrysosporium)(購自中國工業微生物菌種保 藏管理中心，CICC編號40719)。液體生產培養基的組分茶皂素為茶皂素粗提物，市售。
[0010]一種茶皂素脫色酶的制備方法，所述制備方法步驟如下：
(1)菌種培養：采用黃孢原毛平革菌作為生產菌種，依次經斜面種子培養基、液體種子 培養基培養后，獲得液體種子；
斜面種子培養基：去皮馬鈴薯200 g/1，蔗糖20 g/1，磷酸二氫鉀3.0 g/1，硫酸鎂1.5 g/1，瓊脂20 g/1，自然pH (即配完培養基后不用調pH)，經0. lMpa、121°C滅菌20 min ； 液體種子培養基：去皮馬鈴薯200 g/1，蔗糖20 g/1，自然pH，經0. lMpa、121°C滅菌20
min ；
斜面種子制備：將黃孢原毛平革菌劃線接種在斜面種子培養基上，于28°C下恒溫培養 7 d后，放置4°C冰箱內保存，備用；
液體種子制備：將斜面種子用無菌蒸餾水制備成濃度為r 107-108個/ml的孢子懸浮液 后，吸取2 ml接入液體種子培養基中，于28°C下恒溫培養4 d。
[0011](2)發酵生產：將液體種子用無菌蒸餾水稀釋，得到濃度為r 107-108個/ml液體 種子孢子懸浮液，然后將液體種子孢子懸浮液與液體生產培養基按0. 5-3:100的體積比混 合均勻，置于28-30°C搖床中發酵培養96-100 h，過濾，得到含茶皂素脫色酶的菌絲體；
(3)茶皂素脫色酶提取：含茶皂素脫色酶的菌絲體以1:1的重量比加無菌水，在冰浴中 超聲破碎，離心，取上清液加入4-5倍體積的丙酮在-20°C下沉淀蛋白3-4h后進行冷凍離 心，得到的沉淀在室溫下風干，得到茶皂素脫色酶。
[0012]作為優選，所述液體生產培養基各組分組成為：葡萄糖20-50 g/1，硫酸錳 0.01-0. 05 g/1，硝酸鈉 0.8-1. 5 g/1，硫酸鎂 2-8 g/1，茶皂素 0. 2-0. 8 g/1，余量為水。
[0013]作為優選，步驟（3)所述離心條件為：4000 _5000r/min轉速下離心10_15min。
[0014]
本發明的有益效果是：
(1)利用葡萄糖做為發酵主原料，組建成由葡萄糖20-50 g/1，硫酸錳0.01-0. 05 g/1, 硝酸鈉0.8-1. 5 g/1，硫酸鎂2-8 g/1和茶皂素0. 2-0. 8 g/1配制成高效的液體生產培養基，且整個生產過程中無需添加其它價格昂貴的試劑，提取時采用的丙酮可以回收利用，生產成本較低。
[0015](2)黃孢原毛平革菌與優化的液體生產培養基相結合，并輔以合理的提取工藝，得到的茶皂素脫色酶是一種環境友好的大分子蛋白質，脫色活力達到1200-1500 IU/g，脫色條件溫和，脫色后茶皂素損失率低，且只需噴霧干燥就可以回收得到茶皂素粉末。
[0016]
【具體實施方式】
[0017]下面通過具體實施例，對本發明的技術方案作進一步的具體說明。
[0018]本發明中，若非特指，所采用的原料和設備等均可從市場購得或是本領域常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領域的常規方法。
[0019]對所述材料的購買說明:
葡萄糖:寧波市化學試劑有限公司，工業級；
硝酸鈉:浙江省蘭溪市化工試劑廠，工業級；
硫酸鎂和硫酸錳:浙江省衢州巨化試劑有限公司，工業級；
茶皂素(茶皂素粗提物):杭州益民化工有限公司。
[0020]實施例1:
(I)黃孢原毛平革菌各級培養基的配制:
①斜面種子培養基:去皮馬鈴薯200g/Ι，蔗糖20 8/1，磷酸二氫鉀3.0 g/Ι，硫酸鎂1.5g/Ι，瓊脂 20 g/Ι,自然 pH,經 0.1Mpa、121°C滅菌 20 min ；
②液體種子培養基:去皮馬鈴薯200g/Ι，蔗糖20 g/Ι，自然pH，經0.lMpa、121°C滅菌20 min ；
③液體生產培養基:葡萄糖208/1，硫酸錳0.01 8/1，硝酸鈉0.8 g/Ι，硫酸鎂2 g/1,茶皂素 0.2 g/Ι，自然 pH，經 0.lMpa、121°C滅菌 20 min。
[0021](2)斜面種子制備:將黃孢原毛平革菌劃線接種在步驟(1)①斜面種子培養基上，于28°C下恒溫培養7 d后，放置4°C冰箱內保存，備用；
(3)液體種子制備:將步驟(2)斜面種子用無菌蒸餾水制備成濃度為1'IO7-1O8個/ml的孢子懸浮液后，吸取2 ml接入步驟(1)②液體種子培養基中，于28°C下恒溫培養4 d，用無菌蒸餾水適當稀釋，得到濃度為1' IO7-1O8個/ml液體種子孢子懸浮液，待用；
(4)發酵生產:將步驟(3)液體種子孢子懸浮液與步驟(1)③液體生產培養基按體積比
0.5: 100比例混合均勻后，置28°C搖床中發酵培養96 h，過濾，得到含茶皂素脫色酶的菌絲體。
[0022](5)脫色酶的提取:將步驟(4)中收集得到的菌絲體以1:1 (W/W)加入無菌水，在冰浴中進行超聲波破碎(超聲條件，超聲10s，停10s，共超聲20min，超聲功率300w)，超聲破碎后的懸浮液在4000 r/min離心15min,取上清液加入4倍體積預冷的丙酮在_20°C下沉淀蛋白3 h后進行冷凍離心，得到的沉淀在室溫下風干，得到茶皂素脫色酶，經檢測活力達到 1315-1400 IU/g。
[0023]實施例2:
(I)黃孢原毛平革菌各級培養基的配制:①斜面種子培養基:去皮馬鈴薯200g/Ι，蔗糖20 8/1，磷酸二氫鉀3.0 g/Ι，硫酸鎂1.5g/Ι，瓊脂 20 g/Ι,自然 pH,經 0.lMpa、121°C滅菌 20 min ；
②液體種子培養基:去皮馬鈴薯200g/Ι，蔗糖20 g/Ι，自然pH，經0.lMpa、121°C滅菌20 min ；
③液體生產培養基:葡萄糖358/1，硫酸錳0.03 g/Ι，硝酸鈉1.1 g/Ι，硫酸鎂5 g/1,茶阜素 0.5 g/Ι,，自然 pH,經 0.lMpa、121°C滅菌 20 min。
[0024](2)斜面種子制備:將黃孢原毛平革菌劃線接種在步驟(1)①斜面種子培養基上，于28°C下恒溫培養7 d后，放置4°C冰箱內保存，備用； (3)液體種子制備:將步驟(2)斜面種子用無菌蒸餾水制備成濃度為IO7-1O8個/ml的孢子懸浮液后，吸取2 ml接入步驟(1)②液體種子培養基中，于28°C下恒溫培養4 d，用無菌蒸餾水適當稀釋，得到濃度為1 IO7-1O8個/ml液體種子孢子懸浮液，待用； (4)發酵生產:將步驟(3)液體種子孢子懸浮液與步驟(1)③液體生產培養基按體積比1.7: 100比例混合均勻后，置28°C搖床中發酵培養100 h，過濾，得到含茶皂素脫色酶的菌絲體。
[0025](5)脫色酶的提取:將步驟(4)中收集得到的菌絲體以1:1 (W/W)加入無菌水，在冰浴中進行超聲波破碎(超聲條件，超聲10s，停10s，共超聲20min，超聲功率300w)，超聲破碎后的懸浮液在5000 r/min離心10min,取上清液加入5倍體積預冷的丙酮在_20°C下沉淀蛋白4 h后進行冷凍離心，得到的沉淀在室溫下風干，得到茶皂素脫色酶，經檢測活力達到 1200-1288 IU/g。
[0026]實施例3:
本實施例中步驟(1)- (3)同實施例1，不同之處在于:③液體生產培養基:葡萄糖50g/Ι，硫酸猛0.05 g/Ι，硝酸鈉1.5 g/Ι,硫酸鎂8 g/Ι,茶阜素0.8 g/Ι,自然pH,經0.1Mpa、121°C滅菌 20 min。
[0027]( 4)發酵生產:將步驟(3 )液體種子孢子懸浮液與步驟(1)③液體生產培養基按體積比3.0: 100比例混合均勻后，置30°C搖床中發酵培養96 h，過濾，得到含茶皂素脫色酶的菌絲體。
[0028](5)脫色酶的提取:將步驟(4)中收集得到的菌絲體以1:1 (W/W)加入無菌水，在冰浴中進行超聲波破碎(超聲條件，超聲10s，停10s，共超聲20min，超聲功率300w)，超聲破碎后的懸浮液在5000 r/min離心10min,取上清液加入5倍體積預冷的丙酮在_20°C下沉淀蛋白4 h后進行冷凍離心，得到的沉淀在室溫下風干，得到茶皂素脫色酶，經檢測茶皂素脫色酶活力達到1456-1500 IU/g ；
茶皂素脫色酶活力檢測方法
茶皂素脫色酶活力測定:取3支試管各加入0.5 ml適當稀釋的待測酶液，與用pH5.0的0.lmol/1乙酸-乙酸鈉緩沖液配制的0D475為3.5的茶皂素溶液和5%葡萄糖溶液在30°C水浴預熱5 min;在第1、2試管中各加入4.0 ml茶皂素液和0.5 ml的5%葡萄糖溶液，30°C精確反應10 min，反應完后將3支試管在沸水浴中反應2 min，迅速冷卻至室溫，將4.0ml茶阜素液和0.5 ml的5%葡萄糖溶液加入到第3支試管中搖勻,在475 nm波長下測定3支試管試液的吸光度，以吸光度降低百分比來計算脫色酶活力。酶活性定義:在本測定條件下，以每分鐘吸光度降低一個百分點為一個活力單位(U)。[0029]
以上所述的實施例只是本發明的一種較佳的方案，并非對本發明作任何形式上的限制，在不超出權 利要求所記載的技術方案的前提下還有其它的變體及改型。
【權利要求】
1.一種茶皂素脫色酶，其特征在于:所述茶皂素脫色酶以黃孢原毛平革菌為生產菌種，接種于液體生產培養基中經發酵、超聲波提取、沉淀、干燥后獲得；所述液體生產培養基各組分組成為:葡萄糖20-50 g/Ι，硫酸錳0.01-0.05 g/Ι，硝酸鈉0.8-1.5 g/Ι，硫酸鎂2-8g/Ι，茶阜素0.2-0.8 g/Ι,余量為水。
2.一種茶皂素脫色酶的制備方法，其特征在于:所述制備方法步驟如下: (O菌種培養:采用黃孢原毛平革菌作為生產菌種，依次經斜面種子培養基、液體種子培養基培養后，獲得液體種子； (2)發酵生產:將液體種子用無菌蒸餾水稀釋，得到濃度為 IO7-1O8個/ml液體種子孢子懸浮液，然后將液體種子孢子懸浮液與液體生產培養基按0.5-3:100的體積比混合均勻，置于28-30°C搖床中發酵培養96-100 h，過濾，得到含茶皂素脫色酶的菌絲體； (3)茶皂素脫色酶提取:含茶皂素脫色酶的菌絲體以1:1的重量比加無菌水，在冰浴中超聲破碎，離心，取上清液加入4-5倍體積的丙酮在_20°C下沉淀蛋白3-4h后進行冷凍離心，得到的沉淀在室溫下風干，得到茶皂素脫色酶。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于:所述液體生產培養基各組分組成為:葡萄糖20-50 g/Ι，硫酸錳0.01-0.05 g/Ι，硝酸鈉0.8-1.5 g/Ι，硫酸鎂2-8 g/Ι，茶皂素0.2-0.8 g/Ι，余量為水。
4.根據權利要求2或3所述的制備方法，其特征在于:步驟(3)所述離心條件為:4000-5000r/min 轉速下離心 10_15min。
【文檔編號】C12N9/00GK103865893SQ201210538135
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年12月13日 優先權日:2012年12月13日
【發明者】王莉 申請人:杭州益民化工有限公司