專利名稱：一種變形鏈球菌的雙重pcr快速檢測方法
技術領域：
本發明涉及醫藥生物技術領域，特別涉及一種變形鏈球菌的雙重PCR快速檢測方法。
背景技術：
齲病是人類最普遍的疾病之一，發病率高，WHO將其與癌癥和心血管疾病并列為人類三大重點防治疾病。世界衛生組織最新發布的《全球口腔健康報告》中，估計全球63億人口有50億人患過齲齒，在發達國家中60% 90%的學齡兒童和大部分成人患過齲齒，在我國成人發病率為50 %，兒童則高達70 % 90 %，它已然成為威脅人類口腔健康的全球性問題。齲病是含糖食物(特別是蔗糖)進入口腔后，在牙菌斑內經致齲菌的作用，發酵產酸，這些酸(主要是乳酸)從牙面結構薄弱的地方侵入，溶解破壞牙的無機物而產生的。變形鏈球菌(S. Mutans)是人類主要的致齲微生物，它在口腔中的定植與齲病的發生密切相關(張志愿.《口腔科學》，人民衛生出版社，第七版，2008年，48;岳松齡.《現代齲病學》，科學技術文獻出版社，2009年，53-54.)。因此，鑒定口腔S. Mutans的感染，對齲病的早期診斷及防治都具有重要意義。目前已發現定植于口腔的細菌有700余種，要從眾多的細菌中找到一種既簡單又準確的方法鑒別s. Mutans顯得尤為重要。目前檢測S. Mutans方法主要有微生物學方法、免疫學方法、生物芯片技術和分子生物學方法等。①微生物學檢測方法，均需分離養基S. Mutans, 口腔細菌種類繁多，通常需要用選擇性培養基才能分離培養，目前最常用的輕唾桿菌肽培養基(MSB)也不能有效的將S. Mutans與口腔鏈球菌群中的許多細菌(如遠緣鏈球菌、血鏈球菌、唾液鏈球菌、緩癥鏈球菌、非解乳鏈球菌、多動鏈球菌、變異庫克菌等)分開。②免疫學方法，有多克隆抗 體技術和單克隆抗體技術，由于前者所使用的抗體來自多個克隆，難以分離提純，目前已被單克隆抗體技術所取代。后者準確度雖于PCR相似，但抗體的制備過程十分不易，耗時很長。③生物芯片技術將大量的基因探針、基因片段或抗原(抗體)按特定方式固定的排列在特制的載體(如玻片)上，在特定條件下與待檢樣品進行作用，通過精密的掃描儀器進行記錄、檢測和分析的一種技術，該技術靈敏度高但儀器和探針價格昂貴，而且操作復雜。④分子生物學方法，常用的有DNA雜交技術和PCR。DNA雜交技術是通過不同細菌DNA堿基順序同源性對細菌種屬間的親緣關系作出分類鑒定，尤其對一個新菌，或對表型性狀差別小，難以識別菌株的分類鑒定更有價值。因此根據血清特異性基因序列設計特異性PCR引物鑒別S. Mutans的不同血清型，與傳統方法相比，具有簡單、快速、可靠、特異性好的優點。PCR基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性一退火一延伸三個基本反應步驟構成，DNA模板一引物結合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的DNA。2 3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。研究表明，S. Mutans spaP基因表達的Agl/II可以促進其定植能力，在S. Mutans株的c和f 兩個血清型中可克隆出spaP基因。雖然從其它鏈球菌也發現相似的抗原，但spaP基因仍然最有可能是變形鏈球菌屬的特異性基因(LaPolla RJ，Haron JA, KellyCGetal. Sequence and structural analysis of surface protein antigenl/11 (SpaA)of Streptococcus sobrinus.1nfect Immunl991; 59 :2677-2685),而且用 spaP 特異性結合的探針檢測S. Mutans比用通常的gtfB和ftf基因探針檢測更敏感(Smorawinska M,Kuramitsu HK. DNA probes for detection of cariogenic Streptococcus mutans. OralMicrobiol Immunol1992;7 177-181.)。S. Mutans dex基因的產物是葡聚糖酶，葡聚糖酶通過切斷a_l，6_鍵使葡聚糖中a-l，3_鍵與a-1，6-鍵的比例增加，以增加葡聚糖的非水溶性及粘附性，是齲病發生的重要因素之一。S. Mutans的葡聚糖酶dex基因和其他能夠產生葡聚糖酶的口細菌的dex基因差異較大° Igarashi 等(Igarashi T, Yamamoto A, Goto N. Microbiol Immunol, 2001, 45
(5):341-348.)比較了變形鏈球菌群 S. mutans、S. sobrinus、S. downe1、S. salivarius 的dex分子結構發現4種菌的dex均含有I個N-末端信號肽、2個可變區和I個保守區，保守區同源性高，可變區同源性低。S. Mutans的dex基因具有特征性的原核生物核糖體結合位點和啟動子序列，核糖體結合位點與起始密碼子之間的距離要遠大于已知的變形鏈球菌群的其他基因。這些均表明S.Mutans dex基因適合用于設計特異性的PCR引物，用以鑒別變形鏈球菌群的其他菌種(胡曉燕.變形鏈球菌分子生物學鑒定技術新進展[J].國際口腔醫學雜志，2006, 33 (5) : 346-348. )。Igarashi 等(Igarashi T, Asaga E, MuraiC, etal. Lett Appl Microbiol, 2004, 38 (2):125-129.)針對 S. Mutans (S. mutans)、表兄鏈球菌(S. sobrinus)、汗毛鏈球菌(S. downei)的dex基因設計菌種特異性引物,直接對臨床分離株進行PCR檢測，不同菌種特異性引物的混合擴增性片段，成功鑒別S. mutans、
S.sobrinus、S. downei,顯示出根據dex基因設計特異性引物的良好鑒別力。
所以dex和spaP基因都是S. mutans鑒定的良好祀點，選擇dex和spaP基因的特異性片段設計引物，通過PCR來鑒別S. Mutans,可以使檢測更敏感，準確性更高，而且操作簡單。
發明內容
本發明針對現有技術的不足，提供一種S.Mutans的雙重PCR快速檢測方法，可快速、準確檢測口腔標本或培養物中的S.Mutans，為研究齲齒及牙周病的發病機制、臨床監測齲齒及牙周病的病情變化、確定治療方案提供重要依據。本發明還提供根據上述檢測方法設計的試劑盒。一種變形鏈球菌(S. Mutans)的雙重PCR快速檢測方法，其特征在于，采用雙重PCR擴增口腔標本或培養物中的S. Mutans特異性基因片段，所述雙重PCR擴增反應體系中含有如下引物dex F :5，-TGGAACAGTCAAATAGGCAAAC-3，，dex R :5’ -TGGGCTAAAGATGTTGTATTGT-3’，spaP F:5， -AACGACCGCTCTTCAGCAGATA-3，，
spaP R :5’ -AGAAAGAACATCTCTAATTTCT-3’。所述雙重PCR擴增反應體系為總體積為50 iil，各組分及含量如下5iU的10XPCR Buffer，3 濃度為25mM的MgCl2,共4 ill濃度各為2. 5mM的dNTP混合物，各2 的引物，0. 25 濃度為5U/ U I的DNA聚合酶，5 u I模板，24. 75 U I的滅菌蒸餾水。雙重PCR擴增反應的循環參數為94°C預變性5min ;94°C變性15s，50°C退火15s，72°C延伸30s，30個循環；72°C完全延伸5min。所述口腔標本或培養物中的S. Mutans特異性基因片段的獲得通過下述方法采集牙菌斑或挑取牙菌斑培養物，用試劑盒提取DNA作為模板。一種檢測變形鏈球菌(S. Mutans)的試劑盒，含有如下引物dex F :5，-TGGAACAGTCAAATAGGCAAAC-3，，dex R :5’ -TGGGCTAAAGATGTTGTATTGT-3’，spaP F:5’ -AACGACCGCTCTTCAGCAGATA-3’，spaP R:5， -AGAAAGAACATCTCTAATTTCT-3，。所述的試劑盒，含有如下組分及其含量5 ill 的 10XPCR Buffer, 3 U I 濃度為 25mM 的 MgCl2,共 4 濃度各為 2. 5mM 的dNTP混合物，各2 u I的引物，0. 25 U I濃度為5U/ U I的DNA聚合酶，24. 75 U I的滅菌蒸餾水。本發明的雙重PCR擴增口腔標本或培養物中的S. Mutans特異性基因片段，具體包括如下步驟I) DNA模板制備，具體步驟如下采集牙菌斑或挑取牙菌斑培養物，用試劑盒或其他方法提取DNA作為模板。2)雙重PCR擴增伴S. Mutans特異性基因片段，具體步驟如下反應體系總體積為50 U I
權利要求
1.一種變形鏈球菌(S. Mutans)的雙重PCR快速檢測方法，其特征在于，采用雙重PCR擴增口腔標本或培養物中的S. Mutans特異性基因片段，所述雙重PCR擴增反應體系中含有如下引物dex F :5，-TGGAACAGTCAAATAGGCAAAC-3，，dex R:5’ -TGGGCTAAAGATGTTGTATTGT-3’，spaP F :5’ -AACGACCGCTCTTCAGCAGATA-3’，spaP R:5’ -AGAAAGAACATCTCTAATTTCT-3’。
2.根據權利要求1所述的方法，所述雙重PCR擴增反應體系為 總體積為50 iil，各組分及含量如下5iil的10XPCR Buffer，3 ill濃度為25mM的MgCl2,共4 ill濃度各為2. 5mM的dNTP混合物，各2 的引物，0. 25 濃度為5U/ U I的DNA聚合酶，5 u I模板，24. 75 U I的滅菌蒸餾水。
3.根據權利要求2所述的方法，雙重PCR擴增反應的循環參數為94°C預變性5min；94°C變性15s，50。。退火15s，72。。延伸30s, 30個循環；72°C完全延伸5min。
4.根據權利要求1所述的方法，所述口腔標本或培養物中的S.Mutans特異性基因片段的獲得通過下述方法采集牙菌斑或挑取牙菌斑培養物，用試劑盒提取DNA作為模板。
5.一種檢測變形鏈球菌(S. Mutans)的試劑盒，含有如下引物 dex F :5，-TGGAACAGTCAAATAGGCAAAC-3，，dex R:5’ -TGGGCTAAAGATGTTGTATTGT-3’，spaP F :5’ -AACGACCGCTCTTCAGCAGATA-3’，spaP R:5’ -AGAAAGAACATCTCTAATTTCT-3’。
全文摘要
本發明公開了一種變形鏈球菌的雙重PCR快速檢測方法，屬于分子生物學技術領域。利用PCR方法擴增變形鏈球菌的特異基因片段，通過核酸電泳觀察擴增結果。本發明通過針對變形鏈球菌spaP和dex兩個基因的特異片段設計引物spaP F和spaP R、dex F和dex R，使得雙重PCR快速檢測中反應條件穩定，敏感性及特異性都強，能準確判斷變形鏈球菌的感染。
文檔編號C12Q1/68GK103060442SQ201210558739
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月21日 優先權日2012年11月21日
發明者劉開云, 鄒全明, 郭剛, 張衛軍, 孫紅武, 付啟歡, 付強, 程子洋, 樊紹文, 盧陸 申請人:重慶原倫生物科技有限公司, 中國人民解放軍第三軍醫大學