專利名稱：一種固定化復合酶及利用該酶處理蒜氨酸廢液的方法
技術領域：
本發明涉及生物化學領域，涉及了一種固定化復合酶及利用該酶提取蒜氨酸廢液中大蒜多糖的方法。
背景技術：
大蒜為百合科蔥屬植物蒜(Allium sativum L.)的地下鱗莖,為多年生草本植物，是歷史悠久的藥食兩用植物。大蒜中的糖類主要為果聚糖類，占干重的75%左右，是大蒜籽的能量貯藏物質，提供大蒜萌發所需的碳源和能源。其中菊糖含量為15 25%，另外，大蒜中還含有少量小分子糖類，如葡萄糖、果糖和蔗糖等。低聚果糖約占大蒜糖類總量的3.9%，其中蔗果三糖是果聚糖的基礎。低聚果糖和果聚糖類總含量高達12.5 23.5%(濕重)。大蒜多糖是從大蒜中提取的有效活性成分，屬于菊糖類的果聚糖。近年來，國內外大量研究證實大蒜多糖具有多種生理活性。大蒜多糖可以控制血脂、可選擇性地增殖腸道雙歧桿菌、降低血糖、增強免疫功能；能增強T淋巴細胞、B淋巴細胞和巨噬細胞的活力，具有護肝、抗氧化和抗病毒作用，在保健食品和醫藥中有著較好的開發前景。
近年來，人們對于大蒜多糖的提取研究做了大量工作。常用的提取方法有熱水浸提法、超聲波提取法、堿提取法、蛋白酶水解提取法等。其中蛋白酶水解法因其具有經濟、快速、高效安全、樣品損失少等優點越來越受到人們的青睞。酶作為一種生物催化劑具有高效、專一的特點，有很高的工業應用價值。但是由于酶使用條件的溫和性和其本身的易變性使酶對環境要求非常的苛刻，且很難回收利用而殘余的酶對產品的性能有一定影響，從而大大限制了酶在工業中的應用。傳統提取大蒜多糖的工藝方法對大蒜多糖的提取率偏低，一般在50%左右且純度較低，而且酶的使用條件也很苛刻，這樣就嚴重限制了大蒜多糖的進一步發展。
發明內容
本發明針對現有大蒜多糖提取遇到的技術瓶頸，提供了一種固定化復合酶及利用該酶提取蒜氨酸廢液中大蒜多糖的方法，該固定化酶是將破壁酶:果膠酶和除蛋白酶:菠蘿蛋白酶固定在環氧基大孔樹脂中獲得的，將酶固定在載體上來改善其對環境的適應能力，從而使酶可以在工業中得到廣泛的應用，使用本發明所提供的固定化復合酶技術從蒜氨酸廢液提取大蒜多糖的工藝能夠有效提取大蒜多糖，提取效率較傳統方法高出了 20%以上，且提取出的大蒜多糖中基本上沒有殘留的酶，純度大大提聞。本發明所采用的固定化符合酶，包括固定在環氧基大孔樹脂中的破壁酶和除蛋白酶，具體是將破壁酶和除蛋白酶固定在環氧基大孔樹脂中獲得的，其中所采用的破壁酶為果膠酶、纖維素酶、及半纖維素酶中的一種；除蛋白質的酶為菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶中的一種，也可以采用酸性蛋白酶。兩種酶的酶活均為10萬u/g，所述破壁酶與除蛋白酶的用量比例按酶活計為1:3 3:1。在該用量比例下，兩者的配合效果最佳，最終獲得的收率最高且純度好。
其具體獲得方法是:I)環氧基大孔樹脂載體的制備:采用懸浮聚合法以甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)為功能單體，二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)為交聯劑，合成環氧基大孔樹脂載體，選取80 110目的樹脂作為固定化酶用樹脂；其中具體的合成方法可參考文獻Immobiliztionofcandida lipolytica lipase on macroporous beaded terpolymers with epoxygroups.Wentao Liu, Hongdong Duan, Xia Meng, Dawei Qin.Journal of Applied polymerscience.2013(127)4251-4255 進行制備。2)固定化復合酶:將選取1.0g的樹脂載體溶脹；將破壁酶及除蛋白酶分別用pH為4.5飛.5緩沖液配置成15mg/ml的酶溶液，之后分別吸取5.0 15.0ml破壁酶及除蛋白的酶溶液并轉移到錐形瓶中，然后再用移液管吸取40.(T80.0ml上述pH為4.5飛.5的緩沖溶液置入錐形瓶中，輕微搖動使體系混合均勻，把溶脹的環氧基大孔樹脂加入到錐形瓶中，用保鮮膜將錐形瓶蓋好，然后放入35°C恒溫振蕩器中，在200rpm轉速條件下，震蕩6h，使其充分固定即得。其中所采用的緩沖溶液是濃度為0.05mol/L的醋酸溶液和濃度為0.05mol/L醋酸鈉溶液，也可以是濃度為0.05mol/L檸檬酸溶液和濃度為0.05mol/L檸檬酸鈉溶液；所選擇的的酶種類如上所述，之所以選擇上述的各種酶，是由于固定后的復合酶的最佳使用溫度及最佳使用pH值在4.5飛.5之間，選擇出的上述的酶，在這一范圍內依然能夠保持高活性，能夠保證在酶活不受影響的情況下進行提取，從而提高最終多糖的提取效率和純度。應用上述的固定化復合酶處理蒜氨酸廢液的方法如下:取蒜氨酸 廢液，用濃度為lmol/L的氫氧化鈉和濃度為lmol/L的鹽酸溶液調節至pH值為4.5飛.5，取5 20mg上述制備的固定化復合酶加入到200_800mL上述pH值為
4.5飛.5蒜氨酸廢液中，置于恒溫震蕩器中酶解，酶解溫度為35飛5°C，轉速在20(T400rpm，pH值為4.5飛.5，時間為6(Tl00min ;酶解后酶解液經過濾、0.5 y m 5 y m的超濾膜分離、濃縮、干燥得到大蒜多糖產品；所述的超濾膜分離時，所用組件為中空纖維膜組件或陶瓷膜組件或平板膜或卷式膜；所采用的過濾為減壓過濾。米用該方法提取大蒜多糖的得率在67%以上,大蒜多糖的純度可達87%以上，遠聞于現有技術水平。其中所述的蒜氨酸廢液是現有蒜氨酸提取過程中產生的廢液，其一般獲得步驟如下:微波處理使大蒜片中的蒜氨酸酶失活，然后調節勻漿機8000r/min將大蒜片制成蒜漿，常溫下循環超聲波提取得到大蒜粗提取液，過濾，濾液流經離子交換樹脂，25w/w%氨水洗脫樹脂吸附的蒜氨酸得到蒜氨酸溶液，殘留液為蒜氨酸廢液，其中所采用的離子交換樹脂為丙烯酸型陽離子交換樹脂。綜上所述，采用本發明所提供的固定化復合酶技術從蒜氨酸廢液中提取大蒜多糖的工藝能夠有效提取大蒜多糖，提取效率較傳統方法高出了 20%以上，且提取出的大蒜多糖中基本上沒有殘留的酶，純度大大提聞。
具體實施例方式下面結合實施例來進一步說明本發明，可以使本領域技術人員更全面的理解本發明，但不以任何方式限制本發明。本發明除特殊說明外，其他所述百分比均為重量百分比。實施例1取5ml pH 為 4.5,15mg/ml 的果膠酶(酶活:10 萬 u/g)溶液與 15ml pH 為 4.5,15mg/ml的菠蘿蛋白酶(酶活:10萬u/g)溶液于錐形瓶中，其中所述的果膠酶溶液采用濃度為0.05mol/L的醋酸溶液和濃度為0.05mol/L醋酸鈉溶液配制而成；所述的菠蘿蛋白酶溶液采用0.05mol/L的醋酸溶液和濃度為0.05mol/L醋酸鈉溶液配制而成；然后用移液管分別吸取45ml和35ml pH為4.5的濃度為0.05mol/L的醋酸溶液和濃度為0.05mol/L醋酸鈉溶液置入錐形瓶中，輕微搖動使體系混合均勻，把1.0g溶脹的環氧基大孑匕申對月旨(參考文獻Inmobiliztion of Candida lipolytica lipase on macroporousbeaded terpolymers with epoxy groups.Wentao Liu，Hongdong Duan, Xia Meng, DaweiQin.Journal of Applied polymer science.2013 (127) 4251-4255 制得.)加入到維形瓶中，用保鮮膜將錐形瓶蓋好，然后放入35°C恒溫振蕩器中，在200rpm轉速條件下，震蕩6h，使其充分固定即可獲得固定化復合酶；取大蒜片100g，微波處理使大蒜片中的蒜氨酸酶失活，然后調節勻漿機SOOOr/min將大蒜片制成蒜漿，常溫下循環超聲波提取得到大蒜粗提取液，過濾，濾液流經離子交換樹脂，25w/w%氨水洗脫樹脂吸附的蒜氨酸得到蒜氨酸溶液,殘留液為除蒜氨酸的廢液,其中所采用的離子交換樹脂為丙烯酸型陽離子交換樹脂。取5mg上述固定化復合酶，加入到200mL用濃度為lmol/L的氫氧化鈉和濃度為lmol/L的鹽酸溶液配制的pH值為4.5的上述蒜氨酸廢液中，35°C下,200rpm轉速條件下，恒溫震蕩60min,之后經減壓過濾、0.5 y m 5 y m的超濾膜分離、濃縮、噴霧干燥得到大蒜多糖產品，大蒜多糖的得率在73.67%以上，大蒜多糖純度為92.43%。實施例2取8ml pH 為 5.0,15mg/ml 的果膠酶(酶活:10 萬 u/g)溶液與 12ml pH 為 5.0,15mg/ml的菠蘿蛋白酶(酶活:10萬u/g)溶液于錐形瓶中，其中所述的果膠酶溶液采用濃度為0.05mol/L的醋酸溶液和濃度為0.05mol/L醋酸鈉溶液配制而成；所述的菠蘿蛋白酶溶液采用0.05mol/L的醋酸溶液和濃度為0.05mol/L醋酸鈉溶液配制而成；然后用移液管分別 吸取42ml和38ml pH為5.0的濃度為0.05mol/L的醋酸溶液和濃度為0.05mol/L醋酸鈉溶液置入錐形瓶中，輕微搖動使體系混合均勻，把1.0g溶脹的環氧基大孑L申對月旨(參考文獻Immobiliztion of Candida lipolytica lipase on macroporousbeaded terpolymers with epoxy groups.Wentao Liu，Hongdong Duan, Xia Meng, DaweiQin.Journal of Applied polymer science.2013 (127) 4251-4255 制得 )加入到維形瓶中，用保鮮膜將錐形瓶蓋好，然后放入35°C恒溫振蕩器中，在200rpm轉速條件下，震蕩6h，使其充分固定即可獲得固定化復合酶；
取大蒜片100g，微波處理使大蒜片中的蒜氨酸酶失活，然后調節勻漿機SOOOr/min將大蒜片制成蒜漿，常溫下循環超聲波提取得到大蒜粗提取液，過濾，濾液流經離子交換樹脂，25w/w%氨水洗脫樹脂吸附的蒜氨酸得到蒜氨酸溶液,殘留液為除蒜氨酸的廢液,其中所采用的離子交換樹脂為丙烯酸型陽離子交換樹脂。取9mg上述固定化復合酶，加入到360mL用濃度為lmol/L的氫氧化鈉和濃度為lmol/L的鹽酸溶液配制的pH值為5.0的上述蒜氨酸廢液中，40°C下，250rpm轉速條件下，恒溫震蕩70min，之后經減壓過濾、0.5 y m 5 y m的超濾膜分離、濃縮、噴霧干燥得到大蒜多糖產品，大蒜多糖的得率在78.89%以上，大蒜多糖純度為94.63%.。實施例3取10ml pH 為 5.5,15mg/ml 的果膠酶(酶活:10 萬 u/g)溶液與 10ml pH 為 5.5,15mg/ml的菠蘿蛋白酶(酶活:10萬u/g)溶液于錐形瓶中，其中所述的果膠酶溶液采用濃度為0.05mol/L的醋酸溶液和濃度為0.05mol/L醋酸鈉溶液配制而成；·所述的菠蘿蛋白酶溶液采用0.05mol/L的醋酸溶液和濃度為0.05mol/L醋酸鈉溶液配制而成；然后用移液管分別吸取45ml和35ml pH為5.5的濃度為0.05mol/L的醋酸溶液和濃度為0.05mol/L醋酸鈉溶液置入錐形瓶中，輕微搖動使體系混合均勻，把1.0g溶脹的環氧基大孑L申對月旨(參考文獻Immobiliztion of Candida lipolytica lipase on macroporousbeaded terpolymers with epoxy groups.Wentao Liu，Hongdong Duan, Xia Meng, DaweiQin.Journal of Applied polymer science.2013 (127) 4251-4255 制得 )加入到維形瓶中，用保鮮膜將錐形瓶蓋好，然后放入35°C恒溫振蕩器中，在200rpm轉速條件下，震蕩6h，使其充分固定即可獲得固定化復合酶；取大蒜片100g，微波處理使大蒜片中的蒜氨酸酶失活，然后調節勻漿機SOOOr/min將大蒜片制成蒜漿，常溫下循環超聲波提取得到大蒜粗提取液，過濾，濾液流經離子交換樹脂，25w/w%氨水洗脫樹脂吸附的蒜氨酸得到蒜氨酸溶液,殘留液為除蒜氨酸的廢液,其中所采用的離子交換樹脂為丙烯酸型陽離子交換樹脂。取13mg上述固定化復合酶，加入到520mL用濃度為lmol/L的氫氧化鈉和濃度為lmol/L的鹽酸溶液配制的pH值為5.5的上述蒜氨酸廢液中，45°C下,300rpm轉速條件下，恒溫震蕩80min,之后經減壓過濾、0.5 y m 5 y m的超濾膜分離、濃縮、噴霧干燥得到大蒜多糖產品，大蒜多糖的得率在76.64%以上，大蒜多糖純度為93.11%。實施例4取14ml pH 為 6.0,15mg/ml 的果膠酶(酶活:10 萬 u/g)溶液與 6ml pH 為 6.0,15mg/ml的菠蘿蛋白酶(酶活:10萬u/g)溶液于錐形瓶中，其中所述的果膠酶溶液采用濃度為0.05mol/L的醋酸溶液和濃度為0.05mol/L醋酸鈉溶液配制而成；所述的菠蘿蛋白酶溶液采用0.05mol/L的醋酸溶液和濃度為0.05mol/L醋酸鈉溶液配制而成；然后用移液管分別吸取36ml和36ml pH為6.0的濃度為0.05mol/L的醋酸溶液和濃度為0.05mol/L醋酸鈉溶液置入錐形瓶中，輕微搖動使體系混合均勻，把1.0g溶脹的環氧基大孑匕申對月旨(參考文獻Inmobiliztion of Candida lipolytica lipase on macroporousbeaded terpolymers with epoxy groups.Wentao Liu, Hongdong Duan, Xia Meng,DaweiQin.Journal of Applied polymer science.2013 (127) 4251-4255 制得 )加入到維形瓶中，用保鮮膜將錐形瓶蓋好，然后放入35°C恒溫振蕩器中，在200rpm轉速條件下，震蕩6h，使其充分固定即可獲得固定化復合酶；取大蒜片100g，微波處理使大蒜片中的蒜氨酸酶失活，然后調節勻漿機SOOOr/min將大蒜片制成蒜漿，常溫下循環超聲波提取得到大蒜粗提取液，過濾，濾液流經離子交換樹脂，25w/w%氨水洗脫樹脂吸附的蒜氨酸得到蒜氨酸溶液,殘留液為除蒜氨酸的廢液,其中所采用的離子交換樹脂為丙烯酸型陽離子交換樹脂。取17mg上述固定化復合酶，加入到680mL用濃度為lmol/L的氫氧化鈉和濃度為lmol/L的鹽酸溶液配制的pH值為6.0的上述蒜氨酸廢液中，50°C下，350rpm轉速條件下，恒溫震蕩90min,之后經減壓過濾、0.5 y m 5 y m的超濾膜分離、濃縮、噴霧干燥得到大蒜多糖產品，大蒜多糖的得率在70.03%以上，大蒜多糖純度為90.12%。實施例5 取15ml pH 為 6.5,15mg/ml 的果膠酶(酶活:10 萬 u/g)溶液與 5ml pH 為 6.5,15mg/ml的菠蘿蛋白酶(酶活:10萬u/g)溶液于錐形瓶中，其中所述的果膠酶溶液采用0.05mol/L檸檬酸溶液和濃度為0.05mol/L檸檬酸鈉溶液配制而成；所述的菠蘿蛋白酶溶液采用0.05mol/L檸檬酸溶液和濃度為0.05mol/L檸檬酸鈉溶液配制而成；然后用移液管分別吸取35ml和45ml pH為6.5的濃度為0.05mol/L檸檬酸溶液和濃度為0.05mol/L檸檬酸鈉溶液制備的溶液置入錐形瓶中，輕微搖動使體系混合均勻，把L Og溶脹的環氧基大孔樹脂(參考文獻Immobiliztion of Candida lipolytica lipase onmacroporous beaded terpolymers with epoxy groups.Wentao Liu, Hongdong Duan,XiaMeng, Dawei Qin.Journal of Applied polymer science.2013 (127) 4251-4255 制得 )加入到錐形瓶中，用保鮮膜將錐形瓶蓋好，然后放入35°C恒溫振蕩器中，在200rpm轉速條件下，震蕩6h，使其充分固定即可獲得固定化復合酶；取大蒜片100g，微波處理使大蒜片中的蒜氨酸酶失活，然后調節勻漿機SOOOr/min將大蒜片制成蒜漿，常溫下循環超聲波提取得到大蒜粗提取液，過濾，濾液流經離子交換樹脂，25w/w%氨水洗脫樹脂吸附的蒜氨酸得到蒜氨酸溶液,殘留液為除蒜氨酸的廢液,其中所采用的離子交換樹脂為丙烯酸型陽離子交換樹脂。取20mg上述固定化復合酶，加入到800mL用濃度為lmol/L的氫氧化鈉和濃度為lmol/L的鹽酸溶液配制的pH值為6.5的上述蒜氨酸廢液中，55°C下,400rpm轉速條件下，恒溫震蕩IOOmin,之后經減壓過濾、0.5 y m 5 y m的超濾膜分離、濃縮、噴霧干燥得到大蒜多糖產品，大蒜多糖的得率在68.98%以上，大蒜多糖純度為89.25%。
權利要求
1.一種固定化復合酶，其特征在于:包括固定在環氧基大孔樹脂中的破壁酶和除蛋白酶，其中所述的破壁酶為果膠酶或纖維素酶或半纖維素酶；除蛋白質的酶為菠蘿蛋白酶或木瓜蛋白酶。
2.根據權利要求1所述的固定化復合酶，其特征在于:所述破壁酶與除蛋白酶的用量比例按酶活計為1:3 3:1。
3.制備權利要求1所述固定化復合酶的方法，其特征在于:具體步驟如下: 將選取1.0g的樹脂載體溶脹；將破壁酶及除蛋白酶分別用pH為4.5飛.5緩沖液配置成15mg/ml的酶溶液，之后分別吸取5.(Tl5.0ml破壁酶及除蛋白酶溶液并轉移到錐形瓶中，然后再用移液管吸取40.(T80.0ml上述pH為4.5飛.5的緩沖溶液置入錐形瓶中，輕微搖動使體系混合均勻，把溶脹的環氧基大孔樹脂加入到錐形瓶中，用保鮮膜將錐形瓶蓋好，然后放入35°C恒溫振蕩器中，在200rpm轉速條件下，震蕩6h，使其充分固定即得。
其中所采用的緩沖溶液是濃度為0.05mol/L的醋酸溶液和濃度為0.05mol/L醋酸鈉溶液，或濃度為0.05mol/L檸檬酸溶液和濃度為0.05mol/L檸檬酸鈉溶液； 所述的樹脂為環氧基大孔樹脂。
4.應用權利要求1所述固定化復合酶提取蒜氨酸廢液中大蒜多糖的方法，其特征在于:具體步驟如下: 取蒜氨酸廢液，用濃度為lmol/L的氫氧化鈉和濃度為lmol/L的鹽酸溶液調節至pH值為4.5^6.5，取5 20mg上述制備的固定化復合酶加入到20(T800mL上述pH值為4.5^6.5蒜氨酸廢液中，置于恒溫震蕩器中酶解，酶解溫度為35 55°C，轉速在20(T400rpm，pH值為4.5^6.5,時間為6(Tl00min ;酶解后酶解液經過濾、0.5 u m-5 u m的超濾膜分離、濃縮、干燥得到大蒜多糖廣品。
5.根據權利要求4所述的提取蒜氨酸廢液中大蒜多糖的方法，其特征在于: 所述的蒜氨酸廢液采用如下方法獲得: 微波處理使大蒜片中的蒜氨酸酶失活，然后調節勻漿機8000r/min將大蒜片制成蒜漿，常溫下循環超聲波提取得到大蒜粗提取液，過濾，濾液流經離子交換樹脂，25w/w%氨水洗脫樹脂吸附的蒜氨酸得到蒜氨酸溶液，殘留液為蒜氨酸廢液； 其中所采用的離子交換樹脂為丙烯酸型陽離子交換樹脂。
6.根據權利要求4所述的提取蒜氨酸廢液中大蒜多糖的方法，其特征在于: 所述的超濾膜分離時，所用組件為中空纖維膜組件或陶瓷膜組件或平板膜或卷式膜；所采用的過濾為減壓過濾。
全文摘要
本發明涉及生物化學領域，涉及了一種固定化復合酶及利用該酶提取蒜氨酸廢液中大蒜多糖的方法，該方法主要將破壁酶果膠酶(酶活10萬u/g)和除蛋白酶菠蘿蛋白酶(酶活10萬u/g)固定在環氧基大孔樹脂中，破壁酶能夠水解纖維素使細胞壁破裂，蛋白多糖被釋放出來，而除蛋白酶能夠酶解與多糖結合的蛋白質。采用該固定化復合酶提取蒜氨酸廢液中的大蒜多糖，經過濾、0.5μm~5μm超濾膜分離、濃縮、噴霧干燥，制備大蒜多糖產品，采用該方法可以提高多糖的得率，降低多糖中蛋白質的含量，提高了多糖的純度。
文檔編號C12N11/08GK103074321SQ201310041398
公開日2013年5月1日 申請日期2013年2月1日 優先權日2013年2月1日
發明者秦大偉, 薛乃峰, 于功明, 趙保翠, 劉福錦, 孟霞, 劉先華, 崔波, 齊慧敏 申請人:山東省巨野晨農天然產物有限公司, 山東輕工業學院