專利名稱：As499酶菌提取方法
技術領域：
本發明屬于固氮菌類，是指綠氮酶菌的提取方法。
目前國外應用重組DNA技術開發了12種氨基酸產生菌，參見(分開特許公報186、496、1982年)、(JP59-210、887、1984年)及(JP60-62、994、1985年)等，但沒有應用重組DNA技術提取綠氮酶菌的新菌株方法，因此關于應用重組DNA技術提取綠氮酶菌的方法尚未見報導。
綠氮酶菌是熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)K1006，和野生豆科植物的根瘤菌，應用重組DNA技術進行氨基酸產生菌的定向育種，打破種、屬界限，把不同菌株的優良性集中到一株菌上，選育出高產、優質、易人工生產的超級生產菌。
本發明的目的是提供一種具有固定土壤中的含氮量，運用微生物的自由擴散，協助擴散，主動運輸功能，改良土壤的在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏的綠氮酶菌，保藏編號為0153，以及綠氮酶菌的提取方法。
本發明的主要技術方案是這樣實現的保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的綠氮酶菌，保藏編號為0153。它的科學描述為綠氮酶菌，類似橢圓形細胞。
綠氮酶菌結構與功能綠氮酶菌(0153)化學結構為
構成橢圓形細胞的化合物有兩大類，第一類為無機物，水(占80～90%)，無機鹽(占1～1.5%);第二類為有機物，蛋白質(占7～10%)，核酸加糖類(占1～1.5%)，脂類(占1～2%)。
橢圓形細胞周圍綠點類似載體(酶)起自由擴散，被選擇吸收的物質從高濃度一邊吸到低濃度一邊;載體(酶)還起協助擴散，將自由擴散所不能吸收物質，從高濃度一邊吸收到低濃度一邊，在載體的協助下，細胞消耗一定能量，主動地選擇吸收所需的營養物質。它可以把物質從低濃度一邊吸收到高濃度一邊，也可以把物質從高濃度一邊吸收到低濃度一邊，但是速度要比協助擴散得多。
本發明利用載體(綠色小點即酶)的主動運輸功能，增加“特種”培養基(養料)。在加速載體(綠點一酶)的自身增殖的同時，又給橢圓形細胞主動運輸養料，又加速橢圓形細胞分裂增殖，生成二代酶菌，由增殖后二代酶菌去發酵傳統的有機肥料，去發酵農業“廢棄物”和城市“垃圾”達到綜合利用，減少污染，改良土壤，固定土壤中的含氮量，滿足植物生產期所必需的營養成份。
本發明提取技術的方法是指綠氮酶菌(0153)菌種來源，利用熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)K1006，和分離野生豆科植物的根瘤菌，應用重組DNA技術，優選種子培養基為葡萄糖3%，玉米漿1.5%，稀土催酶尿素0.4%，KH2PO4 0.4%，MgSO4·7H2O 0.1%，PH6.5。進行氨基酸產生菌的定向育種，把不同菌種的優良性集中到一株菌上，選育高產、優質、易人工生產的超級生產菌，它不僅可以打破種、屬的界限，而且對于闡明氨基酸產生菌的遺傳體系，進行了基因定位。
應用重組DNA技術提取綠氮酶菌(0153)材料和方法的實施例。
菌種熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)K1006，和分離野生豆科植物的根瘤菌。
斜面培養基和培養方法斜面培養基(g)溶菌酶(蛋殼提取)10，蛋白胨10，NaCL5，無菌水1000ml，PH6.5，將“1”的菌種移接于斜面上，30℃培養48小時。
種子培養基和培養方法原種子培養基(g)葡萄糖30，玉米漿15，稀土催酶尿素4，KH2PO44，MgSO43，無菌水1000ml。PH6.5，取一杯已活化菌苔，接入種子培養基(250ml的三角玻璃瓶裝量25ml)中，30℃振蕩培養48小時，以10%接種量接入發酵培養基中。
發酵培養及培養方法發酵培養基(g)葡萄糖200，酵母膏6，蔗糖400，玉米漿14，稀土催酶尿素6，MgSO4·7H2O0.5，KH2PO41，CaCO37.4，自來水2000ml，PH6.5，裝入無菌缸內，進行酶促反應，溫度24-26℃，培養144小時，即生育成綠氮酶菌(0153)。
綠氮酶菌(0153)分析方法用國產精密PH試紙測定PH(6.5)，液體種子吸光度測定將種液用蒸餾水稀釋20倍，采用國產721型分光度計測定吸光度A690nm(0.38～0.51)。
用1200倍光學顯微鏡按4小時、8小時、16小時、32小時、48小時、……，分期觀查，種子菌增殖情況。
培育綠氮酶菌(0153)及其培養基最優化成份配比經過L8(27)正交試驗獲得的。
綠氮酶菌(0153)液與有機物草炭混合時所測得的分析結果為有機質9.39%，全氮10.51%，速效氮2.80PPm，全磷0.048P2O5%，速效磷3.26PPm，速效鉀6.00%。
因此應用綠氮酶菌(0153)液生產有機肥料，原料資源廣泛。可實現農業“廢棄物”、城市“垃圾”，及傳統農家肥、草炭等“廢棄物”的綜合利用，減少污染。用綠氮酶菌生產的有機肥，含氮量高(40-50)，植物所必需的微量原素，含量較全，酶促功能，光合作用直接植物綜合利用，具體蓄水功能，抗旱、抗災、肥效長、改善植物品質，增加營養成份含量。
權利要求
1.一種綠氮菌提取方法的特征在于利用保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏的綠氮酶菌菌株(0153)作為這樣的微生物及綠氮酶菌(0153)的提取方法。
2.按權利要求1所述的綠氮酶菌提取方法，其特征在于a、菌種為熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)K1006和自己分離野生豆科植物的根瘤菌;b、斜面培養基和培養方法斜面培養基(g)溶菌酶(蛋殼提取)10，蛋白胨10，NaCL5，無菌水1000ml，PH6.5，將“1”的菌種移接于斜面上，30℃培養48小時;c、種子培養基和培養方法為原種子培養基(g)葡萄糖30，玉米漿15，稀土催酶尿素4，KH2PO44，MgSO33，無菌水1000ml，PH6.5，取一杯已活化菌苔，接入種子培養基(250ml的三角玻璃瓶裝量25ml)中，30℃振蕩培養48小時，以10%接種量接入發酵培養基中;d、發酵培養及培養方法為發酵培養基(g)葡萄糖200，酵母膏6，蔗糖400，玉米漿14，稀土催酶尿素6，MgSO4·7H20.5，KH2PO41，CaCO37.4，自來水2000ml，PH6.5，裝入無菌缸內，進行酶促反應，溫度24-26℃，培養144小時，即生育成綠氮酶菌(0153)。
全文摘要
本發明屬于固氮菌類，綠氮酶菌(0153)的提取方法是采用熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)K1006和分離野生豆科植物的根瘤菌作為菌種，應用重組DNA技術，優選最佳種子培養基為葡萄精3％、玉米漿1.5％、稀土催酶尿素0.4％、KH
文檔編號C12N1/20GK1055388SQ9010185
公開日1991年10月16日 申請日期1990年4月6日 優先權日1990年4月6日
發明者溫玉成, 劉永禮 申請人:溫玉成