一種重組表達人溶菌酶的方法

一種重組表達人溶菌酶的方法
【專利摘要】本發明涉及一種高效表達人溶菌酶的方法。本發明人在綜合考慮各種影響表達的因素后，優化人溶菌酶cDNA序列，采用菜豆凝集素(Phaseolus vulgaris agglutinin)的信號肽和人溶菌酶的成熟肽構建成的溶菌酶表達盒，表達人溶菌酶，大幅度地提高了溶菌酶表達的效率。本發明的方法表達的溶菌酶接近天然，酶活性非常高。
【專利說明】一種重組表達人溶菌酶的方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物【技術領域】；更具體地，本發明涉及一種高效表達人溶菌酶的方法。

【背景技術】
[0002] 人溶菌酶包含130個氨基酸，分子量為14. 7kD。溶菌酶（Lysozyme)又稱胞壁質 酶（muramidase)或 N-乙醜胞壁質聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase)，是 一種能水解細菌中黏多糖的堿性酶。其水解位點是N-乙酰胞壁酸（NAM)的1位碳原子和 N-乙酰葡萄糖胺（NAG)的4位碳原子間的β-1.4糖苷鍵。使細胞壁不溶性黏多糖分解成 可溶性糖肽，導致細胞壁破裂內容物逸出而使細菌溶解。G+細菌細胞壁幾乎全部由肽聚糖 組成，而G-細菌只有內壁層為肽聚糖，因此，溶菌酶對于破壞革蘭氏陽性菌G+細菌的細胞 壁較革蘭氏陰性菌G-細菌強。對于革蘭氏陽性菌（G+)，如藤黃微球菌、枯草桿菌或溶壁微 球菌等，溶菌酶的作用相當明顯，但是，如大腸桿菌、變形桿菌、痢疾桿菌、肺炎桿菌等一些 革蘭氏陰性菌（G-)也有一定溶菌作用。溶菌酶還可與帶負電荷的病毒蛋白直接結合，與 DNA、RNA、脫輔基蛋白形成復合物，使病毒失活。因此，該酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
[0003] 溶菌酶廣泛存在于人體多種組織中，淚、唾液、血漿、尿、乳汁等體液富含溶菌酶， 鳥類和家禽的蛋清、微生物中也含此酶，其中以蛋清含量最為豐富。溶菌酶是一種堿性蛋 白質，有較強的抗熱性。有機溶劑的處理也不能使溶菌酶失活，當轉移到水溶液中時，溶 菌酶的活力可全部恢復；冷凍或干燥處理溶菌酶，其活性仍保持穩定；溶菌酶最適宜pH在 5. 3-6. 4之間。溶菌酶的抗菌譜較廣，不僅局限于革蘭氏陽性菌，對部分革蘭氏陰性菌也有 抑制效果，可用于低酸性食品防腐。溶菌酶作為防腐劑，其安全性很高，幾乎沒有毒副作用。 其最有效濃度為0.05%。與植酸、聚合磷酸鹽、甘氨酸等配合使用，可提高其防腐效果。現 已廣泛應用于水產品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及飲料中的防腐；還可以添入乳粉中，以抑 制腸道中腐敗微生物的生存，同時直接或間接地促進腸道中雙歧桿菌的增殖。1992年FAO/ WTO的食品添加劑協會已經認定溶菌酶在食品中應用是安全的。溶菌酶可作為一種具有殺 菌作用的天然抗感染物質，有抗菌、抗病毒、止血、消腫止痛及加快組織恢復功能等作用。臨 床用于慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、口腔潰瘍、水痘、帶狀皰疹和扁平疣等。也可與抗菌藥物合 用治療各種細菌和病毒感染，口服和肌注均有效。氯化溶菌酶醫療效果更廣，有濃痰分散、 出血抑制、組織修復、消炎鎮痛、抗過濾性病毒等作用，因而用氯化溶菌酶的制藥有消炎消 痔、治感冒、皮膚病及眼、鼻、喉等用藥。
[0004] 由于人溶菌酶只能從乳汁、胎盤等體液和組織中少量提取，而且分離純化成本較 高，無法進行大規模生產。因而人溶菌酶的廣泛應用只能通過生物技術手段才得以實現。現 有技術中已經在酵母等菌株中成功表達過人溶菌酶，然而表達的效率以及表達的規模仍然 不夠理想（一般搖瓶表達量在40mg/L以下，發酵罐表達量低于350mg/L)，需要從分子構建 的源頭上對人溶菌酶的重組表達進行深入研究，以達到高表達這一目的。
[0005] Pichia pastoris酵母較多被用于異源蛋白的基因重組表達，應用該系統成功表 達了人血清白蛋白、人胰島素原C肽、腫瘤壞死因子、破傷風毒素 B片段等。為了達到異源 蛋白的高表達，強啟動子發揮很大作用，如這些高表達蛋白均是用AOXl啟動子啟動的。但 是其它因素也可以影響重組蛋白的表達水平。研究人員還經常使用一些其它方法來提高目 的蛋白的表達水平，最常用的方法是提高插入到酵母基因組的目的蛋白表達盒拷貝數，此 法可以提高表達量。但是這個策略有局限，提高拷貝數不一定必然伴隨著目的蛋白表達量 的增高。即使有所增高，也不呈現和表達盒的拷貝數成正相關的狀況。蛋白表達量受很多 因素的制約，有轉錄階段的調控，翻譯階段的制約，以及翻譯后的蛋白修飾等，因此特定的 蛋白，需要找到合適的策略并結合大量的研究試驗工作來優化表達。
[0006] 綜上，本領域還有必要進行進一步的研究，以提高人溶菌酶的表達效率，使得人溶 菌酶真正實現高效地大規模工業化生產。


【發明內容】

[0007] 本發明的目的在于提供一種重組表達人溶菌酶的方法。
[0008] 在本發明的第一方面，提供一種重組表達人溶菌酶的方法，所述方法包括：
[0009] (1)提供一種重組酵母細胞，所述酵母細胞中包含一重組表達盒，該重組表達盒含 有：菜豆凝集素的信號肽編碼序列以及人溶菌酶成熟肽編碼序列；和
[0010] (2)培養（1)的重組酵母細胞，從而表達人溶菌酶。
[0011] 在一個優選例中，所述的菜豆凝集素的信號肽編碼序列的3'端與人溶菌酶成熟肽 編碼序列構建的人溶菌酶表達盒的5'端直接相連，制備成表達溶菌酶的重組表達盒。
[0012] 在另一優選例中，所述的菜豆凝集素信號肽編碼序列如SEQ ID N0:4所示；或
[0013] 所述的人溶菌酶成熟肽編碼序列是經密碼子優化的序列，如SEQ ID N0:5中第 64-456位所示。
[0014] 在另一優選例中，所述的菜豆凝集素信號肽編碼序列與所述的人溶菌酶成熟肽編 碼序列連接而成的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示。
[0015] 在另一優選例中，所述的重組表達盒中，從5'至3'依次包括：啟動子序列，SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列，SEQ ID N0:5中第64-456位所示的人溶菌酶成熟肽編碼序列，翻 譯終止子序列，這些序列操作性相連。
[0016] 在另一優選例中，所述的啟動子是酵母表達啟動子；較佳地，所述的啟動子是 AOXl啟動子或GAP啟動子。
[0017] 在另一優選例中，所述的重組表達盒位于表達載體中，所述的表達載體是 PPHIL-D2表達載體。
[0018] 在另一優選例中，所述的酵母細胞是畢赤酵母細胞。
[0019] 在另一優選例中，所述的畢赤酵母細胞是GS115亞型。
[0020] 在另一優選例中，所述方法還包括步驟：(3)分離（純化）所述的人溶菌酶。
[0021] 在另一優選例中，利用離子交換和/或分子篩進行人溶菌酶的分離純化。
[0022] 在本發明的另一方面，提供一種分離的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所 示；或如SEQ ID NO:5中第64-456位所示，所述的多核苷酸表達人溶菌酶。
[0023] 在本發明的另一方面，提供一種重組表達載體，所述重組表達載體包含一重組表 達盒，該重組表達盒含有：菜豆凝集素的信號肽編碼序列以及人溶菌酶成熟肽編碼序列。
[0024] 在本發明的另一方面，提供一種重組酵母細胞，所述的重組酵母細胞包含一重組 表達盒，該重組表達盒含有：菜豆凝集素的信號肽編碼序列以及人溶菌酶成熟肽編碼序列。
[0025] 在本發明的另一方面，提供所述的重組表達載體或所述的重組酵母細胞的用途， 用于重組表達人溶菌酶。
[0026] 本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見 的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖I :pHIL_D2載體為骨架，PHA信號肽引導的溶菌酶表達載體結構圖。左圖的溶 菌酶序列未經優化，右圖的溶菌酶序列經過優化。
[0028] 圖2 :pPIC_9載體為骨架的溶菌酶表達載體結構圖。左圖的溶菌酶序列未經優化， 右圖的溶菌酶序列經過優化。
[0029] 圖3 :含不同載體的酵母細胞株在搖瓶和發酵罐內表達的差異。
[0030] 圖4 :含pHIL-D2-PHA-HLA(optimized)酵母細胞株在發酵罐中的表達和隨后的純 化結果。圖中"1"為含PHIL-D2-PHA-HLA (optimized)酵母細胞株在發酵罐內用甘油培養基 生長3天后的發酵液上清；"2"為含pHIL-D2-PHA-HLA( 〇ptimiZed)酵母細胞株在發酵罐內 用甘油培養基生長1天，甲醇誘導2天后的發酵液上清；"3"為純化后獲得的溶菌酶。"4" 為蛋白分子量標準，從上到下為97、66、45、30、20、14KD。

【具體實施方式】
[0031] 在生物【技術領域】中，異源蛋白的重組表達是一個重要研究課題。為了提高重組蛋 白的表達率，需大量時間和大量的實驗室工作，經多次試驗、分析、總結與再試驗的努力才 能達到最后的成功。有很多因素可以影響重組蛋白表達率。重組蛋白為分泌表達時，信號 肽就是一個影響因素；同時，重組蛋白本身的DNA序列對于是否能夠實現高效表達也起了 重要作用。本發明人經過深入的研究，首次用菜豆凝聚素信號肽取代通常使用的酵母α因 子信號肽；同時綜合考慮各因素并經反復試驗論證后，優化了人溶菌酶cDNA序列來構建的 表達人溶菌酶的Pichia pastoris表達載體，建立了一種新的重組表達系統，使得成熟的溶 菌酶表達的效率大幅度地提高。
[0032] 信號肽和成熟肽編碼序列的優化
[0033] 如本文所用，所述的"信號肽"是分泌蛋白新生肽鏈N端的一段氨基酸殘基組成的 肽段，其長度一般為20?30個氨基酸殘基。信號肽將分泌蛋白引導進入內質網，同時這個 肽段被切除。
[0034] 信號肽對分泌性重組蛋白的表達有很大影響，一個合適的信號肽可以使目的蛋白 的表達量成倍提高。畢赤酵母本身分泌的內源蛋白質較少，因而通過信號肽序列來引導外 源蛋白質的分泌可方便純化操作。目前常用的信號肽有釀酒酵母α交配因子（a -MF)和畢 赤酵母酸性磷酸酶（PHOl)信號肽，其中前者在應用上更為廣泛。盡管a-MF信號肽是一個 強信號肽，重組蛋白在此信號肽的引導下可以獲得高表達。但是某些外源蛋白用α-MF信 號肽進行分泌表達，會使得重組蛋白質的氨基末端有所延伸（Liu PT et al. Protein Expr Purif，2001，22:381-387)。如人α-l干擾素用a-MF信號肽來分泌表達，可見到部分重組 蛋白的N-端帶有9-11個α-MF信號肽氨基酸殘基，這給純化工藝造成很大的難題。在人 溶菌酶的表達中也碰到類似問題（Nozomi Koganesawa et al, 2001，14:605-710)。
[0035] 本發明人在研究中意外發現，來源于菜豆凝集素的信號肽PHA當應用于Pichia pastoris分泌表達溶菌酶時，具有良好表達效率，與PHA信號肽融合的溶菌酶蛋白質能被 正確加工，未見信號肽中的任何氨基酸殘基與目的蛋白的N-端相連。
[0036] 重組蛋白的DNA序列有時可起到關鍵作用。影響因素包括整個基因 DNA中的GC/ AT比例；堿基AT富集區的大小和分布；翻譯起始區域的二級結構；GC簇（GC cluster)或 者是G簇（G cluster)的分布；酵母偏好密碼子和稀有密碼子的分布等。DNA序列中商GC 比例或高AT比例可以使得目的基因的表達量降低；過多的AT富集區域可以明顯地影響酵 母的重組基因表達，酵母對于聚腺苷信號的專一性沒有高級真核細胞那樣特異，較長的AT 序列就可被酵母識別為聚腺苷信號，使得目的基因的mRNA提前終止轉錄，得到的mRNA比正 常的mRNA短，重組蛋白的C-端序列缺失；GC簇或者是G簇（G cluster)的富集，直接影響 DNA的轉錄；翻譯起始區域的二級結構的強度可影響核糖體翻譯的效率；酵母稀有密碼子 的存在，目的蛋白的翻譯速度被也使得目的蛋白的表達受到影響。
[0037] 因此，在研究過程中，本發明人綜合考慮畢赤酵母偏愛的密碼子、AT:GC的比例設 計、堿基AT富集區的大小和分布、GC簇（GC cluster)或者是G簇（Gcluster)的分布、mRNA 二級結構優化、翻譯起始區域的二級結構等因素的基礎上，對天然人溶菌酶cDNA序列進行 了優化。
[0038] 針對多種序列優化策略，本發明人進行了大量且反復地試驗，最終確定了如SEQ ID N0:5中第64-456位所示的人溶菌酶編碼序列。這一序列并非僅遵循已經報導的畢赤酵 母優選密碼子設計，而是綜合考慮了多種影響因素，以及綜合了重組表達實驗結果。
[0039] 重組表達載體
[0040] 本發明構建了用菜豆凝集素的信號肽PHA引導的、經密碼子優化的人溶菌酶cDNA 序列的表達盒，用于轉染到酵母細胞中進行表達。
[0041] 作為本發明的優選方式，應用的酵母啟動子可以是AOXl啟動子，也可以是GAP啟 動子或其它酵母啟動子。用相應的啟動子連接菜豆凝集素信號肽序列和優化的人溶菌酶 cDNA序列，構成重組表達盒。本發明中，所述的"重組表達盒"是指包含有表達目的蛋白（本 發明中為人溶菌酶）所需的所有必要元件的基因表達系統，通常其包括一下元件：啟動子、 編碼蛋白的基因序列，終止子；此外還可選擇性包括信號肽編碼序列等。這些元件時操作性 相連的。
[0042] 作為本發明的優選方式，本發明所述的人溶菌酶的表達盒中，從5'至3'依次包 括：啟動子序列，SEQ ID N0:4所示的菜豆凝集素信號肽核苷酸編碼序列，密碼子優化后的 人溶菌酶成熟肽編碼序列，翻譯終止子序列，這些序列操作性相連。本發明中，所述的"操作 性相連"，"可操作地連接"或"操作性連接"是指兩個或多個核酸區域或核酸序列的功能性 的空間排列。例如：啟動子區被置于相對于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的 轉錄受到該啟動子區域的引導，從而，啟動子區域被"可操作地連接"到該核酸序列上。
[0043] 重組表達的細胞
[0044] 本發明用于重組表達人溶菌酶的細胞是酵母細胞。多種酵母細胞都可用于本發 明，所述的酵母例如畢赤酵母（Pichia)、漢遜酵母（Hansenula)、假絲酵母（Candida)或球 擬酵母（Torulopsis)等。
[0045] 作為本發明的優選方式，所述的酵母細胞是畢赤酵母細胞。畢赤酵母菌體內無天 然質粒，所以表達載體需與宿主染色體發生同源重組，將外源基因表達框架整合于染色體 中以實現外源基因的表達。所述的外源基因表達框架包括啟動子、外源基因克隆位點、信號 膚、外源基因表達盒、終止序列、篩選標記等。表達質粒能在基因組的特定位點以單拷貝或 多拷貝的形式穩定整合；由于畢赤酵母可以以甲醇為唯一的碳源和能源，絕大多數微生物 并不能以甲醇為碳源，因此在發酵過程中可以減少雜菌的污染，而且大規模工業發酵技術 相對比較成熟。包括培養基、發酵方法等已經經過詳盡研究，使得發酵的重現性和自動化程 度都極為良好。
[0046] 作為本發明的一個優選實施方式，提供了一種人溶菌酶（HLY)在畢赤 氏酵母（Pichia)中的重組表達方法。本發明的方法特征在于重組表達質粒 PPHIL-D2-PHA-HLY(optimized)的構建，本發明特征一表現為在宿主細胞內轉染由酵母強 啟動子驅動的密碼子優化的人溶菌酶成熟肽cDNA序列構建的HLY。本發明特征二表現為 用密碼子優化的人溶菌酶成熟肽cDNA序列構建HLY的N端前面為菜豆凝集素信號肽序 列。具體操作是宿主細胞用GS115pPHIL-D2-PHA-HLY( 〇ptimiZed)載體轉錄，以不含組氨 酸的培養基進行篩選，在此基礎上進一步用測定溶菌酶表達量的方法選擇高表達克隆。經 50次傳代確認穩定高表達后選擇其中表達量最高的一株作為工程細胞株。為了比較菜豆 凝集素信號肽和酵母α因子信號肽對溶菌酶表達的影響，也為了比較天然人溶菌酶成熟 肽cDNA和密碼子優化的人溶菌酶成熟肽cDNA序列對溶菌酶表達的影響，本發明人還構建 了 PPHIL-D2-PHA-HLY和pPIC9-HLY (optimized)兩個溶菌酶表達載體，分別轉錄畢赤酵母 宿主細胞，以不含組氨酸的培養基進行篩選，在此基礎上進一步用測定溶菌酶表達量的方 法選擇高表達克隆，這些高表達克隆也需經50次傳代，確認穩定高表達后選擇其中表達量 最高的一株來進行比較。
[0047] 細胞培養和蛋白分離純化
[0048] 本發明的方法中，對于培養畢赤酵母的方法和培養基沒有特別的限制，可以采用 本領域常規使用的方法和培養基。在培養重組細胞分泌表達出人溶菌酶后，還可包括步驟： 從培養產物（培養基或發酵液）中分離溶菌酶。從培養產物中分離或純化溶菌酶可采用本 領域技術人員熟知的技術。例如可采用硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose離子交換、凝膠過濾 法純化、分子篩、或采用親和層析法純化。
[0049] 本發明的主要優點在于表達量高：采用本發明構建的重組表達系統進行表達，可 獲得非常高的溶菌酶表達量；表達的蛋白接近天然：采用本發明的方法表達、純化的重組 人溶菌酶在分子量測定、N-端15個氨基酸序列、C-末端2個氨基酸序列、肽圖、CD等實驗 中均與天然的人溶菌酶沒有區別；本發明另外一個優點是操作、培養簡單：采用本發明的 構建的表達系統和方法，在簡單合成培養基中可實現高密度培養，操作簡單、能有大規模發 酵設備進行表達，生產成本低廉。
[0050] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
[0051] 材料及其來源
[0052] Klenow片段多聚酶和所有使用的內切酶均為NEB公司產品。pPIC9、pGAPZa、 Pichia pastoris GS115 株為 Invitrogen 公司產品。Trizol RNA抽提試劑盒購自 Promega 公司，YNB(W/0氨基酸）購自Sigma公司。
[0053] 實施例方法簡述
[0054] 根據酵母偏愛的密碼子和cDNA序列的GC/AT比例；堿基AT富集區的大小和分布； 翻譯起始區域的二級結構；GC簇（GC cluster)或者是G簇（G cluster)的分布等因素綜合 考慮后設計一條DNA序列，此序列的5 '端有一個EcoRI酶切位點，緊接著為菜豆凝集素信號 肽序列，然后為溶菌酶成熟肽序列，最后為終止密碼子EcoRI酶切位點。該DNA插入到PUC18 載體中，定名為 PUC18-PHA-HLY (optimized)。將 PUC18-PHA-HLY (optimized)克隆載體中插 入的PHA-HLY(Optimized)片段用EcoRI酶切下，1. 5%瓊脂糖電泳分離，回收DNA片段。將 約0. 45Kb的PHA-HLY(optimized)基因回收片段與用EcoRI酶切并經堿性磷酸酶處理過的 PHIL-D2載體連接，轉化E. coli DH5a感受態細胞，以含有Ampicillin LB瓊脂板篩選陽性 克隆。采用堿裂解法制備質粒DNA。用 5'-A0Xlprimer(GACTGGT TCCAATTGAC AAGC)(SEQ ID NO:6)和優化后溶菌酶 cDNA 內部的一個 primer (5, -TTA GAC GCC GCA ACC CTG AAC-3'） (SEQ ID NO: 12)作為一對引物，與所得到的重組載體進行PCR反應，PCR反應產物用1.5% 瓊脂糖電泳分離，如PCR產物為500bp左右大小DNA片段的，則表明PHA-HLY(Optimized) 插入的方向正確。插入正確的重組載體分別用5'AOXl primer和3'AOXl primer進行測 序，確認插入的PHA-HLY(optimized)的序列完全正確，此載體用于轉錄Pichia pastoris GS115細胞。
[0055] PHIL-D2-PHA-HLY載體的構建為PHA信號肽序列與天然溶菌酶成熟肽序列（SEQ ID N0:2)的5'端連接后插入到pHIL-D2的EcoRI位點。pPIC9-HLY(optimized)載體的構 建為HLY (optimized)成熟肽序列插入到pPIC9的XhoI和EcoRI位點。
[0056] 實施例1、含有人溶菌酶編碼序列的載體構建
[0057] 天然的人溶菌酶cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1(5'端第1-54位編碼信號肽）， 編碼SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列。
[0058] 為了利用人溶菌酶的表達，對序列進行設計改造，在人溶菌酶CDNA5'端去除 第1-54位信號肽編碼序列，加上帶有部分酵母α信號肽3'端的編碼序列CTC GAG AAG AGA(SEQ ID NO:8)，合成的序列如SEQ ID NO: 2,在DNA的3'端為翻譯終止信號ΤΑΑ，將該 DNA插入到 PUC18 載體（購自 New England Biolabs)中，定名為 PUC18-HLY。
[0059] 實施例2、人溶菌酶cDNA序列優化
[0060] 在綜合考慮畢赤酵母偏愛的密碼子、AT:GC的比例設計、mRNA二級結構優化、堿基 AT富集區的大小和分布、GC簇（GC cluster)或者是G簇（G cluster)的分布等一系列因 素的基礎上，在天然的溶菌酶cDNA序列（SEQ ID NO: 1)基礎上進行優化，同時在3'末端加 上EcoRI酶切位點的序列GAATTC，優化后的溶菌酶成熟肽cDNA序列為SEQ ID NO: 3。
[0061] 實施例3、菜豆凝集素信號肽-優化溶菌酶cDNA序列的構建
[0062] 菜豆凝集素信號肽（PHA)序列核苷酸序列如SEQ ID NO: 4,其氨基酸序列如SEQ ID NO: 15。人工合成PHA-HLY(optimized)DNA序列，在5'末端加上PHA信號肽編碼序列以 及EcoRI酶切位點，獲得PHA-HLY序列，其順序為EcoRI酶切位點序列緊接著為PHA信號肽 序列（SEQ ID N0:4)其后為序列優化后的溶菌酶成熟肽序列，隨后為終止子序列，最后為 EcoRI酶切位點序列。人工合成的全序列為SEQ ID N0:5。該合成序列插入到PUC18載體 中，構建成 PUC18-PHA-HLY (optimized)載體。
[0063] 實施例4、菜豆凝集素信號肽-天然溶菌酶cDNA序列的構建
[0064] 合成引物
[0065] 引物（SEQ ID NO:9) :G TTC CTG GTA CTA CTG ACA CAC GCA MCTCG MG GTC TTT GAA AGG TGT GAG TTG
[0066] 引物（SEQ ID NO: 10) :GAA TTC ATG GCA AGT AGC AAC CTG TTGAGT CTA GCA CTG TTC CTG GTA CTA CTG ACA CAC G
[0067] 引物（SEQ ID NO:11) :TTA GAC GCC GCA ACC CTG AAC
[0068] 以PUC18-HLY作為模板，用引物SEQ ID NO:9和引物SEQ ID NO: I)組成的引 物進行PCR擴增；以獲得PCR產物提純后作為模板，與引物SEQ ID NO: 10和引物SEQ ID NO: 11組成的引物對進行PCR反應，獲得的PCR產物插入到PUC18的EcoRI位點中，構建成 PUC18-PHA-HLY載體。此載體進行插入片段PHA-HLY全長DNA測序，測序結果證明所有序列 完全正確，PCR反應沒有引入任何突變。
[0069] 實施例5、Pichia pastoris表達載體的構建
[0070] (I) pHIL-D2_PHA-HLY (optimized)表達載體構建
[0071] PHIL-D2載體（購自Invitrogen)用EcoRI酶切，獲得的線性DNA片段用堿性磷 酸酶處理脫去5' -端磷酸基團；PUC18-PHA-HLY(optimized)載體用EcoRI酶切，1. 5%瓊脂 糖電泳獲得〇. 5kb片段；將0. 5kb片段與EcoRI酶切、經堿性磷酸酶處理脫去5' -端磷酸 基團的PHIL-D2線性化DNA相連，轉染E. coli DH5a細胞，用含Ampicillin的LB板篩選， 挑取生長的克隆，直接與5'-A0Xlprimer(SEQIDN0 :6)和優化后溶菌酶CDNA內部的一 個 primer (5,-TTA GAC GCC GCA ACC CTG AAC-3'）（SEQ ID NO: 12)引物對進行 PCR 反應。 如PCR反應產物為700bp左右時，則證明PHA-HLY(optimized)已插入到pHIL-D2載體中， 而且PHA-HLY(Optimized)的插入方向正確。挑選正確的克隆，擴增獲得10微克以上質粒 DNA備用。該表達載體的圖譜如圖1右圖。
[0072] (2) pHIL-D2-PHA-HLY酵母表達載體構建
[0073] 將PUC18-PHA-HLY質粒用E. coRI酶切，用1. 5%瓊脂糖電泳，分離0. 5kb片 段，將此片段與經堿性磷酸酶處理脫去5' -端磷酸基團的pHIL-D2線性化DNA相連， 轉染E. coli DH5 a細胞，用含Ampicillin的LB板篩選，挑取生長的克隆，直接與 5'-A0Xlprimer(GACTGGT TCCAATTGAC AAGC)(SEQ ID N0:6)和溶菌酶 cDNA 內部的一個 primer (5, -TTA CAC TCC ACA ACC TTG AAC-3'）（SEQ ID NO: 11)構成的引物對進行 PCR 反應，如PCR反應產物為700bp左右時，則證明PHA-HLY已插入到pHIL-D2載體中，而且 PHA-HLY的插入方向正確。挑選正確的克隆用于酵母轉錄。該表達載體的圖譜如圖1左圖。
[0074] (3) pPIC9_HLY (optimized)載體構建
[0075] PPIC9用XhoI和EcoRI酶切，酶切產物用1%瓊脂糖電泳分離，回收DNA片段；合 成引物 5' -CTC GAG AAG AGA AAG GTC TTT GAA AGA TGC-3'（SEQ ID NO: 13);將此引物和 3'A0X1 引物（SEQ ID N0:7)組成引物對，以pHIL-D2-PHA-HLY(optimized)為模板，進行PCR 反應，獲得的DNA直接和XhoI和EcoRI酶切后的線性pPIC9 DNA連接，轉染E. coli DH5 a 感受態細胞，用含有Ampicillin的LB板篩選。挑選陽性克隆，用5' AOXl引物和3' AOXl 引物為引物對，以陽性克隆為模板，進行PCR反應，產物為2kb的克隆為插入正確的克隆，此 克隆進行插入DNA的全長序列測定，DNA序列測定證明無 PCR反應引入的突變，含完全正確 的閱讀框。此克隆作為酵母轉錄用。該表達載體的圖譜如圖2右圖。
[0076] (4) pPIC9-HLY 載體構建
[0077] pPIC9用XhoI和EcoRI酶切，酶切產物用1%瓊脂糖電泳分離，回收DNA片段；將 引物 5'-CTC GAG AAG AGA AAG GTC TTT GAA AGG TGT-3'（SEQ ID NO: 14)和 3'AOXl 引物 (SEQ ID N0:7)組成引物對，以pHIL-D2-PHA-HLY為模板，進行PCR反應，獲得的DNA直接和 XhoI和EcoRI酶切后的線性DNA連接，轉染E. coli DH5a感受態細胞，用含有Ampicillin 的LB板篩選。挑選陽性克隆，用5' AOXl引物和3' AOXl引物為引物對，以陽性克隆為模 板，進行PCR反應，產物為2kb的克隆為插入正確的克隆，此克隆進行插入DNA的全長序列 測定，DNA序列測定證明無 PCR反應引入的突變，含完全正確的閱讀框。此克隆作為酵母轉 錄用。該表達載體的圖譜如圖2左圖。
[0078] 實施例6、HLY在巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris)中的表達
[0079] (l)pHIL-D2-PHA-HLY (optimized)載體轉染巴斯德畢赤酵母
[0080] 取一個含 pHIL-D2-PHA_HLY(optimized)載體的大腸桿菌克隆，在含 Ampicillin 的LB培養基中生長過夜。第二天，離心收集菌體，采用堿裂解法制備質粒DNA。取抽提純化 的pHIL-D2-PHA-HLY(optimized)載體DNA20微克，用Sail酶切使之線性化。線性化后的 DNA用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、沉淀DNA在室溫中干燥去除乙醇后溶于20微升純水中。
[0081] 畢赤酵母GSl 15細胞株（購自Invitrogen)在5毫升YPD中于30 °C、200rpm生 長過夜，取其中〇. 5毫升加到500毫升新鮮YH)培養基中生長過夜，直至培養液的0D_ 在1.3-1. 5之間，離心去上清。細胞重懸于500毫升無菌冰純水，混合物離心去上清。沉 淀加250毫升無菌冰純水重懸后再離心去上清，沉淀重懸于20毫升冰的IM山梨糖醇 (sorbitol)，混合物離心去上清，最后細胞重懸于1毫升冰的IM山梨糖醇置冰浴備用。取 10微升線性化DNA(K)微克）和80微升重懸GSl 15細胞置于0. 2cm電擊杯中，混勻后將電 擊杯在冰浴中放置5分鐘后電擊將DNA轉染入GSl 15細胞內。電擊后立即加1暈升冰的 lMsorbitol，然后轉移到1.5毫升無菌管，30°C靜止培養1-2小時，分別取100微升、200微 升酵母細胞液均勻涂布到RDB (無組氨酸）平板，置30°C培養直至克隆生長。選擇200個克 隆分別接種到5毫升YH)培養基，30°C，200rpm生長2天，離心棄去上清，加5毫升YPM培養 基（甲醇濃度為〇. 5%) 30°C，200rpm誘導，每隔24小時補加培養體積為0. 5%的甲醇，補加2 次，第二次補加24小時后，離心取10微升培養上清用SDS-PAGE檢測溶菌酶的表達。選擇 表達量最高的克隆為PHIL-D2-PHA-HLY(optimized)陽性克隆。
[0082] (2) pHIL-D2-PHA-HLY 載體轉染巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris)
[0083] 取一個含pHIL-D2-PHA-HLY載體的大腸桿菌克隆，在含Ampicillin的LB培 養基中生長過夜。第二天，離心收集菌體，采用堿裂解法制備質粒DNA。取抽提純化的 PHIL-D2-PHA-HLY載體DNA20微克，用Sail酶切使之線性化。線性化后的DNA用酚/氯仿 抽提，乙醇沉淀、沉淀DNA在室溫中干燥去除乙醇后溶于20微升純水中。
[0084] 畢赤酵母GSl 15細胞株（購自Invitrogen)在5毫升YPD中于30 °C、200rpm生 長過夜，取其中〇. 5毫升加到500毫升新鮮YH)培養基中生長過夜，直至培養液的0D600 在1. 3-1. 5之間，離心去上清。細胞重懸于500毫升無菌冰純水，混合物離心去上清。沉 淀加250毫升無菌冰純水重懸后再離心去上清，沉淀重懸于20毫升冰的IM山梨糖醇 (sorbitol)，混合物離心去上清，最后細胞重懸于1毫升冰的IM山梨糖醇置冰浴備用。取 10微升線性化DNA(K)微克）和80微升重懸GSl 15細胞置于0. 2cm電擊杯中，混勻后將電 擊杯在冰浴中放置5分鐘后電擊將DNA轉染入GSl 15細胞內。電擊后立即加1暈升冰的 lMsorbitol，然后轉移到1. 5毫升無菌管，30°C靜止培養1-2小時，分別取100微升、200微 升酵母細胞液均勻涂布到RDB (無組氨酸）平板，置30°C培養直至克隆生長。選擇200個克 隆分別接種到5毫升YH)培養基，30°C，200rpm生長2天，離心棄去上清，加5毫升YPM培養 基（甲醇濃度為〇. 5%) 30°C，200rpm誘導，每隔24小時補加培養體積為0. 5%的甲醇，補加2 次，第二次補加24小時后，離心取10微升培養上清用SDS-PAGE檢測溶菌酶的表達。選擇 表達量最高的克隆為PHIL-D2-PHA-HLY(optimized)陽性克隆。
[0085] (3)pPIC9_HLY (optimized)載體轉染 GSl 15 細胞
[0086] 取一個含pPIC9_HLY(optimized)載體的大腸桿菌克隆，在含Ampicillin的LB 培養基中生長過夜。第二天，離心收集菌體，采用堿裂解法制備質粒DNA。取抽提純化的 pPIC9-HLY(〇ptimiZed)載體DNA20微克，用Sail酶切使之線性化。線性化后的DNA用酚 /氯仿抽提，乙醇沉淀、沉淀在空氣中干燥除去乙醇后溶于20微升純水中，-20°C保存備用。 GSl 15克隆在5毫升YPD中生長過夜，取其中0. 5毫升加到500毫升新鮮YH)培養基中生 長過夜，直至培養液的0D600在1. 3-1. 5之間，離心去上清。細胞重懸于500毫升無菌冰純 水，混合物離心去上清。沉淀加250毫升無菌冰純水重懸后再離心去上清，沉淀重懸于20 毫升冰IM sorbitol，混合物離心去上清，最后細胞重懸于1毫升冰IMsorbitol，置冰浴備 用。取10微升線性化DNA(K)微克）和80微升重懸GSl 15細胞置于0. 2cm電擊杯中，混勻 后將電擊杯在冰浴中放置5分鐘后電擊將DNA轉染入GSl 15細胞內。電擊后立即加1暈升 冰IM sorbitol，然后轉移到15毫升無菌管，30°C靜止培養1-2小時，200微升酵母細胞液 均勻涂布到RDB (無組氨酸）平板，置30°C培養直至克隆生長。選擇200個克隆分別接種到 5毫升YH)培養基，30°C，200rpm生長2天，離心棄去上清，加5毫升YPM培養基（甲醇濃度 為0. 5%) 30°C，200rpm誘導，每隔24小時補加培養體積為0. 5%的甲醇，補加2次，第二次補 加24小時后，離心取10微升培養上清用SDS-PAGE檢測溶菌酶的表達。選擇表達量最高的 克隆為PPIC9-HLY(optimized)陽性克隆。
[0087] 實施例7、高表達克隆的比較
[0088] (I) DNA水平上的確認
[0089] 為了進一步確認重組克隆的基因組內插入了目的蛋白表達盒，提取上述實施例6 中（1)獲得的工程細胞候選株（選擇5株）的基因組DNA，同時也提取了上述實施例6中 (2)和⑶獲得的各1株最高表達細胞株的基因組DNA，以及GSl 15的基因組DNA。這8株 細胞的基因組DNA作為模板，分別用5' AOXl primer/3' AOXl primer引物對進行PCR。
[0090] PCR結果顯示，除GS115細胞株外，其它7株用5'A0X1 primer/3'A0Xl primer引 物對均能獲得插入的目的基因信號，而且信號強度相同。
[0091] (2)蛋白表達水平上的確認
[0092] 為 了驗證 PHA-HLY (op t imi z e d)要比 PHA-HLY、a -s i gna 1 peptide-HLY(optimized)轉染時的目的蛋白的表達量高。設計了幾組實驗。
[0093] 第一組：
[0094] 上述9個克隆（包括GS115、實施例3中（1)獲得的5株工程細胞候選株、 PPIC9-HLY陽性克隆、pPIC9-HLY(optimized)陽性克隆和pHIL-D2-PHA-HLY克隆對照株各 1株）在30°C，200rpm條件下，5毫升YH)培養基中生長2天，離心取沉淀，加含0· 5%(v/v) 甲醇的YP培養基，使各株的細胞密度相同，體積均為5毫升，仍置于30°C，200rpm條件下培 養，每隔24小時補加0. 5%(v/v)甲醇，共補加2次，第3天末，取上清檢測溶菌酶的含量。
[0095] 實驗結果，GS115沒有目的蛋白的表達，pPIC9-HLY陽性克隆株的表達量為43毫 克/升，pPIC9-HLY(optimized)克隆株的表達量為62毫克/升、pHIL-D2-PHA-HLY克隆株 表達量為87毫克/升、5株工程細胞候選株的表達量在120-170毫克/升之間，平均表達量 150 毫克 / 升，明顯高于 pPIC9-HLY、pPIC9-HLY(optimized)、pHIL-D2-PHA-HLY 等對照克隆 株，如圖3上圖。
[0096]第二組：
[0097] 從獲得的5株工程細胞候選株挑選出一株表達量高的克隆株、pPIC9-HLY、 PPIC9-HLY (optimized)、pHIL-D2-PHA-HLY克隆株分別進行5升發酵罐培養。發酵條件按 照 Invitrogen 的 Pichia Fermentation Process Guidelines 所述，甘油生長期 27 小時， 待甘油消耗殆盡，啟動甲醇誘導，共誘導72小時。
[0098] 誘導結束后檢測各克隆的表達量，pPIC9-HLY、pPIC9-HLY (optimized)、 PHIL-D2-PHA-HLY克隆株的溶菌酶表達量分別為315毫克/升、523毫克/升、 587毫克/升，pHIL-D2-PHA-HLY(optimized)克隆株的表達量為892毫克/升， PHIL-D2-PHA-HLY(optimized)克隆株的表達量明顯高于對照克隆，如圖3下圖。
[0099] 實施例8、工程細胞株表達的溶菌酶確認
[0100] 為了在蛋白分子結構水平上確認與天然的人溶菌酶一致。 pHIL-D2-PHA-HLY(optimized)細胞株之一（克隆1)在200毫升YH)培養基中生長2天，然 后添加200毫升含2%甲醇的YP培養基繼續生長3天，培養條件為30°C，200rpm。培養結束 后離心，收集培養上清。上清液用醋酸調pH至6. 0,過pH6. 0, 20mM醋酸鈉緩沖液平衡過的 SP-Sepharose FF離子交換柱，目的蛋白用pH8.0,含500mM氯化鈉，20mM磷酸鈉緩沖液洗 脫。洗脫蛋白過用pH7. 0,含50mM氯化鈉，20mM磷酸鈉緩沖液平衡的Sephadex G-25凝膠 柱，進行緩沖液交換。交換了緩沖液后的SP-S印harose FF洗脫蛋白過pH7.0,含50mM氯化 鈉，20mM磷酸鈉緩沖液平衡過的DEAE-Sepharose FF層析柱，溶菌酶不結合離子交換樹脂， 直接在PH7. 0,含50mM氯化鈉，20mM磷酸鈉平衡緩沖液洗滌時隨緩沖液流穿。用菜豆凝集 素信號肽引導的溶菌酶純化后SDS-PAGE顯示其純度大于99%。
[0101] 純化的重組溶菌酶用TRYPSIN消化后用C18柱進行肽圖分析，結果與人溶菌酶的 TRYPSIN酶切肽圖完全一致。N-端15個氨基酸序列測定結果為LysVal Phe Glu Arg Cys Glu Leu Ala Arg Thr Leu Lys Arg Leu，與 SEQ ID NO: 16 的第 1-15 位氨基酸序列完全一 致；C-末端兩氨基酸的序列測定結果為Gly Val，與人溶菌酶的C-末端兩個氨基酸相同。 純化的重組溶菌酶還進行了園二色譜檢測，檢測的結果與人溶菌酶一致。而用α信號肽引 導表達的溶菌酶經上述方法純化后有高分子量的雜條帶，WESTERN BLOT方法檢測時高分子 量條帶能被抗人溶菌酶抗體所識別。
[0102] 上述實驗確認，本發明的用菜豆凝集素信號肽引導人溶菌酶成熟肽在Pichia pastoris分泌表達的方法可以高效正確地表達人溶菌酶。
[0103] 實施例9、基因工程表達的人溶菌酶活性研究
[0104] 接種溶壁微球菌于 LB 液體培養劑中（l%Trypton, 0· 5%Yeast extract, l%NaCl)， 28°C 200rpm培養過夜，第二天收集培養液，離心沉淀細菌，菌體用pH6. 2,0. IM磷酸鈉緩 沖液重懸洗滌后離心，獲得的菌體用上述方法重復2次，加入同一緩沖液配制成OD45tl為 0·7(±0·05)細菌懸液，置 4°C備用。pHIL-D2-PHA-HLY(optimized)細胞株之一（克隆 1) 產生的人溶菌酶濃度為2mg/ml的樣品，用pH6. 2,0. IM磷酸鈉緩沖液稀釋成1、0. 5、0. 25、 0. 125和0. 0625mg/ml濃度，取試驗菌懸浮液1. 5毫升加0. 1毫升人溶菌酶懸液置比色皿 搖勻后與25°C 450nm波長處每隔30秒讀取OD數值。按照溶菌酶活性定義，在25°C，pH6. 2 條件下，OD45tl每分鐘下降0. 001為1個酶單位活性（IU)，酶單位活性計算公式為：
[0105] 每毫克溶菌酶活性單位=【0D45Q(0分）-OD45tl (60秒時）】X 1000/樣品毫克數。
[0106] 經計算pHIL-D2-PHA-HLY (optimized)細胞株之一（克隆1)產生的人溶菌酶活性 為 15900IU/mg 蛋白。
[0107] 實施例10、工程細胞株的發酵罐發酵工藝研究
[0108] 將pHIL-D2-PHA-HLY(optimized)細胞株之一（克隆1)接種到YPD平板生長2天， 挑取單克隆接種到裝有400毫升Yro培養基的搖瓶中，30°C 250-300rpm條件下生長16-24 小時直到OD6c?在2-6之間。
[0109] 20L發酵罐內加含4%(v/v)甘油的基礎鹽培養液8升，加熱高壓滅菌。設置發酵 溫度301：4!1控制5.2、轉速200-1500印111、通氣條件為0.1-1.0心111空氣，用28%(￥八）氫氧 化銨調節基礎培養鹽培養液pH到5. 2,每升培養液加4. 35ml PTMl痕量鹽。待發酵罐內基 礎鹽培養液的溫度降至30°C后，將400毫升來自搖瓶中培養的OD6c?在2-6之間的種子液加 入發酵罐。啟動發酵罐溫度、pH、通氣和攪拌等裝置使酵母細胞生長，繼續細胞生長直到甘 油消耗完畢。一旦所有的甘油都消耗完畢，啟動甘油流加步驟來增加細胞的量，甘油補料中 甘油的濃度為50% (v/v)，每升甘油補料內需含有12毫升PTMl痕量鹽溶液，設置補料速度 為18. 15ml/hr/liter (起始體積），甘油流加持續4小時。甘油流加結束后開始流加甲醇， 流加的甲醇補料含1〇〇%(ν/ν)甲醇，每升甲醇添加12毫升PTMl痕量鹽。設置流加速度為 3ml/hr每升起始發酵體積。4小時后甲醇流加速度增加至6ml/hr每升發酵體積，以此速度 補加2小時后甲醇補加速度調整至9ml/hr每升起始發酵體積，此補料速度一直維持到發酵 結束，整個甲醇流加時間為48小時。
[0110] 發酵結束后,放罐收集發酵液,發酵液通過陶瓷過濾膜過濾方法分離發酵上清,含 重組溶菌酶的發酵上清用離子交換，分子篩等方法進行進一步處理。每升發酵上清經上述 方法純化后可獲得純度大于95%溶菌酶400毫克以上。發酵各階段取樣的電泳結果如圖4。 [0111] 在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可 以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范 圍。
【權利要求】
1. 一種重組表達人溶菌酶的方法，其特征在于，所述方法包括： (1) 提供一種重組酵母細胞，所述酵母細胞中包含一重組表達盒，該重組表達盒含有： 菜豆凝集素的信號肽編碼序列以及人溶菌酶成熟肽編碼序列；和 (2) 培養（1)的重組酵母細胞，從而表達人溶菌酶。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的菜豆凝集素信號肽編碼序列如SEQ ID N0:4所示；或 所述的人溶菌酶成熟肽編碼序列是經密碼子優化的序列，如SEQ ID NO:5中第64-456 位所示。
3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重組表達盒中，從5'至3'依次包括： 啟動子序列，SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列，SEQ ID N0:5中第64-456位所示的人溶菌酶 成熟肽編碼序列，翻譯終止子序列，這些序列操作性相連。
4. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重組表達盒位于表達載體中，所述的 表達載體是PPHIL-D2表達載體。
5. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酵母細胞是畢赤酵母細胞。
6. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括步驟： (3) 分離（純化）所述的人溶菌酶。
7. -種分離的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示；或如SEQ ID N0:5中第 64-456位所示，所述的多核苷酸表達人溶菌酶。
8. -種重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體包含一重組表達盒，該重組表達 盒含有：菜豆凝集素的信號肽編碼序列以及人溶菌酶成熟肽編碼序列。
9. 一種重組酵母細胞，其特征在于，所述的重組酵母細胞包含一重組表達盒，該重組表 達盒含有：菜豆凝集素的信號肽編碼序列以及人溶菌酶成熟肽編碼序列。
10. 權利要求8所述的重組表達載體或權利要求9所述的重組酵母細胞的用途，用于重 組表達人溶菌酶。
【文檔編號】C12N1/19GK104278017SQ201310291477
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年7月11日 優先權日:2013年7月11日
【發明者】孫九如 申請人:上海萬特醫藥科技有限公司