一種化學成分確定的培養基、其應用及大規模培養哺乳動物細胞的生產工藝的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種化學成分確定的培養基，以公開的DMEM/F12配方為基礎，調整各組成成分濃度，并在此基礎上增減某些成分，適用于多種哺乳動物細胞的大規模生產。本發明還公開了上述培養基在大規模培養哺乳動物細胞（CHO細胞、BHK細胞或雜交瘤細胞）中的應用以及大規模培養哺乳動物細胞的生產工藝。本發明的培養基不含血清和蛋白質，并去除了以往培養基中所使用的動物成分及植物蛋白水解物，所有組分化學成分確定，有利于產物的純化、生產批次的穩定性，從而保證和提高了產品質量；采用本發明的培養基和生產工藝，可提高細胞密度并提高目的產物產量，整體生產成本低。
【專利說明】一種化學成分確定的培養基、其應用及大規模培養晡乳動物細胞的生產工藝
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，特別是涉及一種化學成分確定的培養基、其應用及大規模培養哺乳動物細胞的生產工藝。
【背景技術】
[0002]隨著重組DNA技術的問世，培養基已被廣泛用于多種細胞培養,包括動物、植物和細菌。生物制藥工業中的目標產物(如抗體)可以通過在液體培養基中培養細胞而大量生產。這些細胞為天然的或者工程化的，利用生物反應器在液體培養基中快速成倍增長，并生產目標產物。這些產物可以直接從培養基中收集，也可以從收獲的細胞中提取獲得。
[0003]培養基提供細胞培養過程中所需的營養物質，在早期的細胞培養過程中，培養基配方以血液的化學組成和物理化學性質為基礎(如滲透壓、PH值等)，被簡稱為“生理性的解決方案”。但是，不同類型的細胞在不同的培養環境中對于氧氣/ 二氧化碳分壓、營養物、維生素和微量元素的需求有所不同，因此，培養基的配方取決于特定的細胞要求。一般而言，培養基的主要成分包括氨基酸、有機鹽、無機鹽、維生素、微量金屬、糖類、脂質和核酸等，各組分的濃度根據給定細胞的特定要求而相應調整。
[0004]目前在單克隆抗體生產或基因重組蛋白的生產中，動物細胞的培養多數采用特異的低血清或無血清培養基。無血清培養基可通過在標準的基礎培養基(如 RPMI1640 (Moore et al.(1993) In Vitro Cell Dev.Biol.29A: 265-267) ; Iscove’smodifiedEagle"sMedium(IMDM);Dulbecco’s modified Eagle’s medium(D-MEM)等)中添加營養物或者用某種功能成分取代血清獲得，也可以通過在基礎培養基中補充微量金屬元素和`接近等壓水平的鹽(如主要的陽離子鉀、鈉、鈣、鎂等)來獲得(Barnes, D.，and Sato, G.(1980) Cell22:649-655 ; Cleveland, ff.L., et al(1983)J Immunol Meth56:221-234;Iscove, N.，and Melchers, F.(19 7 8)J Exp MedI 47:923-933;Kawamoto，T.，et a I (I 983) Ana Iytica IBiochemistryl30:445-453;ffolpe, S.D., ^In Vitro Immunization and Growthof Hybridomas in Serum-Free Medium^, inj.P.Mather, ed., Mammalian Ce 11Culture, Plenum Press, New York, 1984)。此外,完全無蛋白成分的培養基也已被開發出來(Fik et al.(1991)BioPharm.March, pp.26-29)。
[0005]經過幾十年的發展，哺乳動物細胞培養基大致經歷了從有血清培養基，動物蛋白水解物培養基，植物蛋白水解物培養基到無血清、化學成分確定培養基(Chemically-defined Media) 4個階段。出于對瘋牛病毒(TSE)及其他各類動物病毒引起的生物安全性的考慮，培養基要盡量避免使用動物源的成分。典型的無血清或化學成分確定培養基含有50-70種成分，包括氨基酸、維生素、微量元素和生長因子等。向培養基中添加動物或植物的蛋白水解物可以有效地提高細胞生長密度、延長細胞活性，從而提高抗體表達量。常見的動物細胞培養的蛋白水解物來源有大豆、酵母和小麥等，但由于其成分的復雜性和批次間的質量變化，添加蛋白水解物可能會造成培養基批次間不穩定從而影響培養過程和產品質量。化學成分確定培養基則全部由化學結構明確的小分子化合物構成。目前，雖然國際上已經普遍使用化學成分確定培養基進行生物制藥，但由于生產成本高，國內還普遍使用血清和蛋白水解物做為提高目標產物產量的手段。
[0006]多種細胞株可用來生產單克隆抗體或基因重組蛋白。通常宿主細胞的選擇依賴于產物的特性。例如，高糖化的重組蛋白通常采用真核宿主細胞生產。常用的真核細胞株有中國倉鼠卵巢細胞(CH0)，幼鼠腎細胞(BHK)，轉化的人胚胎腎細胞(HEK-293)和鼠雜交瘤細胞(如NSO和SP2/0)。而細菌細胞如大腸桿菌和芽孢桿菌多用來生產非糖基化的多肽。
[0007]不同類型的細胞通常需要不同的營養元素和生長因子，因此許多個性化的培養基已被開發來滿足不同細胞的需要。目前已開發的多種真核細胞培養基已被闡述(Ham andMcKeehan Meth.Enz., 58:44(1979)) ；Bottenstein et al.，Meth.Εηζ.，58:94(1979))。同時商業化規模發酵已成功用于制備人重組多肽藥物(如抗體)。
[0008]目前，最為廣泛使用的細胞系為CHO細胞。CHO細胞來源于中國倉鼠卵巢上皮細胞和纖維細胞。CHO細胞系始于中國倉鼠卵巢CHO-Kl (Kao’F.-T.And Puck, T.Τ., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA60:1275-1281 (1968))以及雜交瘤細胞等。美國專利第5316938號公開了一種適用于CHO細胞懸浮培養的不含從動物源中分離的蛋白質、脂類和碳水化合物的培養基；美國專利5122469公開了一種適用于CHO細胞懸浮培養的無血清、不含蛋白的培養基；美國專利第4767704號公開了一種適用于雜交瘤細胞培養的無蛋白培養基。
[0009]國際上目前已有大量的商業化的化學成分確定培養基應用于各種哺乳動物細胞培養中，例如GIBCO公司用于CHO細胞培養的CD CHO培養基、CD OptiCHO培養基和CDFortiCHO培養基；SIGMA公司的⑶CHO Fusion培養基等等。這些化學成分確定培養基都有各自的優點，比如能較好的支持細胞生長，同時又具有局限性:(I)所有培養基都是一種針對某一特定細胞株或細胞系的特異性培養基，比如CD CHO培養基主要用于CHO Kl細胞，⑶OptiCHO主要用于DG4 4細胞；(2)化學成分確定培養基價格昂貴，生產成本高，不適用于大規模生產。
[0010]而在目前的國內市場上，還沒有一種可以支持高密度細胞培養的化學成分確定培養基。國內生物制藥業使用的培養基大部分為進口培養基，市場被GIBCO、SIGMA、HYCL0NE所壟斷。同時由于此種培養基的價格昂貴，每升從700元到1500元不等，所以眾多中小型生物制藥企業還在使用低血清、無血清和添加蛋白水解物來提高細胞密度和目標產物產量。
【發明內容】
[0011]本發明的一個目的是提供一種高效低成本、適用于多種哺乳動物細胞大規模培養的化學成分確定的培養基。
[0012]為實現上述目的，本發明采用如下技術方案:
[0013]—種化學成分確定的培養基，包括以下終含量的各組成成分:
[0014]
【權利要求】
1.一種化學成分確定的培養基,其特征在于,包括以下終含量的各組成成分:
2.根據權利要求1所述的化學成分確定的培養基的應用，其特征在于，用于培養哺乳動物細胞，所述哺乳動物細胞為CHO細胞、BHK細胞或雜交瘤細胞。
3.根據權利要求2所述的化學成分確定的培養基的應用，其特征在于，所述CHO細胞為 CH0-K1、CH0-K1SV、CH0-DG44、CH0 SXHO DXBlI，所述雜交瘤細胞為 NSO 細胞或 SP2/0 細胞。
4.根據權利要求2所述化學成分確定的培養基的應用，其特征在于，用于通過大規模培養哺乳動物細胞來生產生物類藥物，所述生物類藥物包括抗體、融合蛋白、重組蛋白、酶或疫苗。
5.一種大規模培養哺乳動物細胞的生產工藝，其特征在于，采用權利要求1所述的化學成分確定的培養基作為生產基礎培養基，進行哺乳動物細胞的傳代培養、高密度流加培養或連續灌注培養。
6.根據權利要求5所述的大規模培養哺乳動物細胞的生產工藝，其特征在于，在哺乳動物細胞培養過程中不添加谷氨酰胺。
7.根據權利要求5所述的大規模培養哺乳動物細胞的生產工藝，其特征在于，在所述高密度流加培養或連續灌注培養過程中，通過添加高濃度流加補料培養基使整個培養發酵過程的葡萄糖濃度維持在IOmM以上。
8.根據權利要求7所述的大規模培養哺乳動物細胞的生產工藝，其特征在于，在所述哺乳動物的活細胞密度達到峰值以前將滲透壓控制在4000sm以下，在培養晚期滲透壓控制在5000sm以下。
【文檔編號】C12P21/08GK103773732SQ201310226998
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2013年6月8日 優先權日:2013年6月8日
【發明者】李鋒, 葉培 申請人:李鋒, 葉培