一種表達cd133的重組腺病毒及其用途

一種表達cd133的重組腺病毒及其用途
【專利摘要】本發明公開了一種表達CD133的重組腺病毒及其用途，所述重組腺病毒攜帶人CD133基因，能夠在哺乳動物細胞中表達人CD133蛋白。本發明的重組腺病毒通過攜帶人CD133基因的重組穿梭質粒與病毒骨架質粒同源重組得到。本發明的重組腺病毒在哺乳動物細胞中表達人CD133蛋白的效率高、產量大。制備本發明重組腺病毒的方法簡單、重復性強。
【專利說明】—種表達CD133的重組腺病毒及其用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及蛋白質表達領域，具體涉及一種表達⑶133的重組腺病毒及其用途。 【背景技術】
[0002]近年來隨著腫瘤干細胞理論的不斷進步完善，腫瘤干細胞標志物CD133在腫瘤干細胞的分離奠定中也越來越被關注。CD133作為多種實體腫瘤干細胞表面的特異性標志物，在腫瘤的發生和發展中起重要作用，未來可將其作為一種新分子靶點，用于篩選并特異性殺傷腫瘤干細胞，直至殺死腫瘤細胞。除此之外，隨著CD133+細胞在腫瘤靶向治療中的研究越來越多，信號傳導，免疫逃逸及耐藥性和生物治療的研究也成為近幾年的熱點(Horst D 等人.(2009)The cancer stem cell marker CD133has high prognostic impact but unknown functional relevance for the metastasis of human colon cancer.J Patho1219:427 - 434 ；Jao SW 等人.(2012)Cytoplasmic CD133expression is a reliable prognostic indicator of tumor regression after neoadjuvant concurrent chemoradiotherapy in patients with rectalcancer.Ann Surg Oncol 19:3432 - 3440 ；Horst D 等人.(2009) CD133and nuclear beta-catenin: the marker combination to detect high risk cases of low stage colorectal cancer.Eur J Cancer45:2034 - 2040.)。
[0003]目前，關于CD133的研究仍處于初級階段，將來在篩選抗腫瘤干細胞藥物、研制新疫苗和尋找新的分子基因治療靶點等方面可能有所突破，并可為將來腫瘤的靶向治療提供新的方向，為最終治療惡性腫瘤提供新的途徑。利用某些干細胞標志物與腫瘤細胞標志物相結合的方法確定腫瘤干細胞特異性的標志物，是當前腫瘤干細胞篩選的主要手段(Shmelkov SV 等人.(2008)CD133expression is not restricted to stem cells，and both CD133+and CD133-metastatic colon cancer cells initiate tumors.J Clin Investll8:2111 - 2120 ；Chapman MA 等人.(1998)Preoperative carcinoembryonic antigen is related to tumour stage and long-term survival in colorectal cancer.Br J Cancer78:1346 - 1349 ；Morales-Gutierrez C 等人?(1999) Survival of patients with colorectal carcinoma:possible prognostic value of tissular carbohydrate antigenl9.9determination.Cancerl99986:1675 - 1681.)。
[0004]腺病毒作為蛋白質表達載體具有很長的歷史，并且在臨床中也得到應用。腺病毒具有感染效率高，感染的宿主細胞和組織范圍廣，構建、制備、擴增相對簡便，且腺病毒滴度較高等優點而受到廣泛應用(Ng P等人.A high-efficiency Cre/loxP-based system for constrction of adenoviral. vectors.Hum Gene TherlO:2667-2672 ;Kamen A 等人.Development and optimization of an adenovirus production process.J Gene Med, 2004,6:184-192 ；He TC 等人? Asimplif ied system for generating recombinant adenovirus.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95:2509-2514 ;Zeng M 等人? AdEasy system made easier by selecting the viral backbone plasmid preceding homologousrecombinanation.Bio Techniques,2001,13 (2):260-262 ；Ernst M 等人?STAT3and STATlmediate IL-11-dependent and inflammation-associated gastrictumorigenesis in gpl30receptor mutant mice[J].JClin Invest,2008，118 (5):1727-1738.)。
[0005]因此，使用腺病毒作為表達⑶133蛋白的載體具有可能性，并且在干細胞、信號傳導、免疫逃逸及耐藥性和生物治療方面具有很大的潛力，具有廣闊的應用前景。

【發明內容】

[0006]本發明的目的在于提供一種表達⑶133的重組腺病毒及其用途，該重組腺病毒能夠高效表達、大量產生人⑶133蛋白。
[0007]為實現本發明的目的，本發明提供以下技術方案:
[0008]在第一方面，本發明提供一種表達⑶133的重組腺病毒，其攜帶人⑶133基因，優選地，所述人CD133基因的序列如SEQ ID NO:1所示(GenBank登錄號為BC012089.1，方框表示起始密碼子和終止密碼子)。
[0009]|ATG|< GCCCTCGTACTCGGCTCCCTGTTGCTGCTGGGGCTGTGCGGGAACTCCTTTTCAGGAGGGCAG
CCTTCATCCACAGATGCTCCTAAGGCTTGGAATTATGAATTGCCTGCAACAAATTATGAGACCCAAGACTCCCATAA
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CTGCTTGTGGAATAGACAGAATGAATTATGACAGCTACTTGGCTCAGACTGGTAAATCCCCCGCAGGAGTGAATCTTTTATCATTTGCATATGATCTAGAAGCAAAAGCAAACAGTTTGCCCCCAGGAAATTTGAGGAACTCCCTGAAAAGAGA
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TCAAGATACTTCAACGCACAGGGAATGGATTGTTGGAGAGAGTAACTAGGATTCTAGCTTCTCTGGATTTTGCTCAG
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GTATTCACAATCCTGTTATGACAAGCCCATCACAACAT-G- (SEQ ID NO:1)o
[0010]本發明提供的重組腺病毒，其表達人⑶133蛋白，優選地，所述人⑶133蛋白的序列如SEQ ID NO:2所示。
[0011 ] MALVLGSLLLLGLCGNSFSGGQPSSTDAPKAWNYELPATNYETQDSHKAGPIGILFELVHIFLYVVQPR DFPEDTLRKFLQKAYESKIDYDKIVYYEAGIILCCVLGLLFIILMPLVGYFFCMCRCCNKCGGEMHQRQKENGPFLR KCFAISLLVICIIISIGIFYGFVANHQVRTRIKRSRKLADSNFKDLRTLLNETPEQIKYILAQYNTTKDKAFTDLNS INSVLGGGILDRLRPNIIPVLDEIKSMATAIKETKEALENMNSTLKSLHQQSTQLSSSLTSVKTSLRSSLNDPLCLV HPSSETCNSIRLSLSQLNSNPELRQLPPVDAELDNVNNVLRTDLDGLVQQGYQSLNDIPDRVQRQTTTVVAGIKRVL NSIGSDIDNVTQRLPIQDILSAFSVYVNNTESYIHRNLPTLEEYDSYWWLGGLVICSLLTLIVIFYYLGLLCGVCGY DRHATPTTRGCVSNTGGVFLMVGVGLSFLFCWILMIIVVLTFVFGANVEKLICEPYTSKELFRVLDTPYLLNEDWEY YLSGKLFNKSKMKLTFEQVYSDCKKNRGTYGTLHLQNSFNISEHLNINEHTGSISSELESLKVNLNIFLLGAAGRKN LQDFAACGIDRMNYDSYLAQTGKSPAGVNLLSFAYDLEAKANSLPPGNLRNSLKRDAQTIKTIHQQRVLPIEQSLST LYQSVKILQRTGNGLLERVTRILASLDFAQNFITNNTSSVIIEETKKYGRTIIGYFEHYLQWIEFSISEKVASCKPV ATALDTAVDVFLCSYIIDPLNLFWFGIGKATVFLLPALIFAVKLAKYYRRMDSEDVYDDVETIPMKNMENGNNGYHK DHVYGIHNPVMTSPSQH (SEQ ID NO:2)。
[0012]由于密碼子的簡并性，本發明所述人CD133基因的序列還可以包括任何能編碼 SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
[0013]優選地，構建所述重組腺病毒所用的穿梭質粒為pShuttle-CMV ；
[0014]優選地，構建所述重組腺病毒所用的病毒骨架質粒為pAdeasy-1 ；
[0015]優選地，構建所述重組腺病毒所用的包裝細胞為哺乳動物細胞，優選人胚腎293 細胞。
[0016]在第二方面，本發明提供一種重組腺病毒質粒，其通過攜帶人⑶133基因的重組穿梭質粒與病毒骨架質粒同源重組得到；
[0017]優選地,所·述重組穿梭質粒為pShuttle-CMV攜帶人⑶133基因構成的,本發明中表示為 pShuttIe-CMV-CD133 ；
[0018]優選地，所述病毒骨架質粒為pAdeasy-1 ；
[0019]優選地，所述同源重組發生在大腸桿菌內，優選大腸桿菌BJ5183。
[0020]在第三方面，本發明提供一種如第二方面所述的重組腺病毒質粒的構建方法，所述構建方法包括將線性化的重組穿梭質粒pShuttIe-CMV-⑶133轉化包含病毒骨架質粒 pAdeasy-1的感受態大腸桿菌BJ5183進行同源重組，篩選陽性克隆，并從所述陽性克隆中提取所述重組腺病毒質粒；
[0021]優選地，所述線性化為PmeI酶切線性化；
[0022]優選地，所述篩選陽性克隆為使用含卡那霉素的LB培養基平板篩選；
[0023]任選地,還包括將所述重組腺病毒質粒轉化感受態大腸桿菌DH10B,并大量抽提質粒備用。
[0024]在第四方面，本發明提供一種如第一方面所述的重組腺病毒的制備方法，所述制備方法包括將如第二方面所述的重組腺病毒質粒線性化后轉染哺乳動物細胞、優選人胚腎 293細胞，至出現明顯細胞病變效應后，收集細胞，反復凍融，離心得到包含所述重組腺病毒的上清液；
[0025]優選地,所述線性化采用PacI酶切線性化；
[0026]優選地，-70°C和37°C交替條件下反復凍融2?4次，優選3次；
[0027]任選地，還包括將所述上清液感染哺乳動物細胞、優選人胚腎293細胞以擴增所
述重組腺病毒。
[0028]在第五方面，本發明提供一種表達⑶133蛋白的方法，所述方法包括用如第一方面所述的重組腺病毒感染哺乳動物細胞、優選人胚腎293細胞，使CD133蛋白在所述細胞中表達。
[0029]本發明提供的表達⑶133蛋白的方法，還可以是用如第二方面所述的重組腺病毒質粒線性化后轉染哺乳動物細胞、優選人胚腎293細胞，使CD133蛋白在所述細胞中表達。
[0030]在第六方面，本發明提供一種如第一方面所述的重組腺病毒在⑶133蛋白表達中的用途。
[0031]本發明還提供一種如第二方面所述的重組腺病毒質粒在⑶133蛋白表達中的用途。
[0032]本發明的有益效果為:
[0033]本發明首次用重組腺病毒作為表達載體，在哺乳動物細胞(特別是人胚腎293細胞)中成功表達了人⑶133蛋白，本發明重組腺病毒能夠高效表達、大量產生人⑶133蛋白。 本發明重組腺病毒質粒構建方法簡單、重復性強，能夠快速轉染哺乳動物細胞，經包裝得到本發明的重組腺病毒。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1是質粒pCMV6-AC-GFP的圖譜。
[0035]圖2是質粒pShuttle-CMV的圖譜。
[0036]圖3是質粒pAdeasy-1的圖譜。
[0037]圖4是重組pShuttIe-CMV-CD133的酶切鑒定結果，其中M表示Ikb DNAmarker ；1 表示重組pShuttIe-CMV-⑶133的XhoI酶切結果，得到一條大小約2.5kb的全長⑶133片段和一條pShuttle-CMV片段；2表示陰性對照，即pShuttle-CMV的XhoI酶切結果，得到一條 pShuttle-CMV 片段。
[0038]圖5是重組腺病毒質粒pAd-⑶133的PCR鑒定結果，其中M表示DNAmarker ；1表示陰性對照，即未重組⑶133基因的病毒質粒pAdeasy-1的PCR擴增結果；2表示重組腺病毒質粒pAd-⑶133的PCR擴增結果，使用⑶133特異性引物擴增得到預期大小的900bp左右的片段，提示⑶133基因成功的重組到pAdeasy-1質粒中。
[0039]圖6是重組腺病毒成功包裝后的顯微鏡鏡檢結果(20倍)，從左至右依次為病毒稀釋10_6、10_4和10_2倍，圖中黑色斑點為病毒顆粒，提示重組腺病毒在細胞內的增殖。
[0040]圖7是表達的⑶133蛋白的Western Blot檢測結果，其中M表示蛋白質標準分子量；1表示重組腺病毒vAd-⑶133在人胚腎293細胞中表達⑶133蛋白的情況；2表示陰性對照，即未重組CD133基因的病毒質粒的轉染的細胞的蛋白提取物檢測結果；3表示陽性對照，即高表達CD133的CACO細胞蛋白提取物檢測結果；GAPDH表示甘油醛_3_磷酸脫氫酶作為內參。
【具體實施方式】
[0041]下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述。本領域技術人員將會理解，下面的實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件，或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。
[0042]本發明所用材料如下:
[0043]主要質粒、菌株和細胞:腺病毒穿梭質粒pShuttle-CMV、骨架質粒pAdeasy-1、大腸桿菌BJ5183、人胚腎293細胞和CACO細胞購自美國stratagene公司；全長CD133cDNA質粒購自美國OriGene公司JM109感受態細菌由美國南佛羅里達大學醫學院饋贈。
[0044]主要酶和試劑:DNA Marker、限制性內切酶Xhol、Pac1、PmeI購自NewEngland Biolabs公司；質粒提取試劑盒購自Promega公司；QIAquick DNA凝膠回收試劑盒購自QIAGEN公司；T4DNA連接酶、TaqDNA聚合酶購自Takara公司；DNA轉染試劑 lipofectamine2000、Opt1-MEM 購自 Invitrogen 公司;TRIzol、DMEM 培養液、RPM1-1640, 胎牛血清購自GIBCO公司；胰蛋白酶、脂多糖購自Sigma公司；快速腺病毒感染性滴度檢測試劑盒購自本元正陽基因技術有限公司；免疫印跡試劑盒(Bio-Rad, Richmond, CA，USA)； CD 133 抗體及其二抗(Mi ItenyiBiotec, Auburn, CA, USA)。
[0045]實施例1重組pShuttIe-CMV-CD133的構建和鑒定
[0046]將帶有XhoI酶切 位點的⑶133全長質粒pCMV6-AC-GFP (其圖譜如圖1)的DH5 a 大腸桿菌于含氨芐青霉素的培養基平板劃線涂板，37°C培養過夜，挑取單克隆，LB培養基搖菌過夜，用質粒提取試劑盒抽提質粒。
[0047]將質粒和pShutt Ie-CMV(其圖譜如圖2)經XhoI進行酶切，然后過膠回收CD 133片段和pShuttle-CMV，經T4DNA連接酶，16°C過夜連接，直接取反應終產物10 y L轉化JM109 感受態細菌，用含卡那霉素的LB培養基平板篩選陽性克隆，挑出5個克隆在含卡那霉素的 LB培養基中培養，用質粒提取試劑盒抽提質粒后，用XhoI內切酶進行酶切鑒定(圖4)，正確克隆命名為 pShuttIe-CMV-CD133。
[0048]實施例2重組腺病毒質粒的構建和鑒定
[0049]取pShuttle-CMV-O)133 質粒 10 U L,經 PmeI 酶切線性化后，轉化包含 pAdeasy-1 (其圖譜如圖3)的感受態BJ5183菌進行同源重組。
[0050]用含50mg/L卡那霉素的LB培養基平板篩選陽性克隆，用含卡那霉素的LB液體培養基于37°C、200r/min條件下,搖菌過夜,用質粒提取試劑盒抽提質粒。[0051]根據設計的引物(OriGene，美國)進行PCR擴增，正向引物F: 5’ -AGATCCAGTGCTTCCTGC-3’ (SEQ ID NO:3);反向引物 R:5’ -CTGTTCATGTTCTCCAACG-3’ (SEQ ID NO:4)。PCR 擴增的程序:94°C 3min ;然后 94°C lmin、55°C lmin、72°C 3min，33 個循環；72°C延長lOmin。凝膠電泳檢測擴增片段(圖5)，鑒定證明重組腺病毒質粒構建正確， 重組腺病毒質粒命名為pAd-⑶133。轉化感受態DH10B，大量抽提質粒備用。
[0052]實施例3重組腺病毒的包裝與擴增
[0053]將人胚腎293細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養液中常規培養。將pAd_⑶133 經Pac I酶切，凝膠回收線性化的pAd-⑶133。轉染前24小時接種人胚腎293細胞，轉染時細胞融合至70%?80%，在脂質體介導下轉染人胚腎293細胞，第4天在出現明顯的細胞病變效應(CPE)后，收集細胞，-70°C與37°C交替條件下，反復凍融3次，2000r/min離心lOmin，取部分病毒上清感染人胚腎293細胞以擴增重組腺病毒，并將重組腺病毒命名為vAd-⑶133。一般地，將病毒上清反復感染人胚腎293細胞擴增重組腺病毒，隨傳代次數增加，重組腺病毒感染性穩定且增強，致細胞病變作用的時間縮短，通常傳至第4.0-5.0代時，在接種病毒后24-48h，此時收獲病毒。
[0054]實施例4重組腺病毒滴度的測定
[0055]將人胚腎293細胞接種于96孔板中，每孔IX IO4個細胞，濃縮后的病毒貯存液按不同比例稀釋加至培養板中，培養68h后，冰預冷甲醇固定細胞，先后加入抗腺病毒單抗、 酶標二抗和顯色底物(本元正陽基因技術有限公司)，20-40倍顯微鏡下計數出現褐色或黑色的細胞斑點孔數(圖6)，按試劑盒說明計算病毒滴度為9.0X10npfu/mL。
[0056]實施例5Western Blot檢測表達的⑶133蛋白
[0057]在5X IO5人胚腎293細胞/孔的24孔板中每孔加入500 ii L DMEM5%培養液，然后再每孔加入200 u L初次病毒擴增保存液感染48小時。確證所有細胞均出現CPE，如果CPE 不完全則再延長感染24小時，取出400 ii L轉入1.5mL試管中，其余-80°C凍存。800rpm離心5分鐘，棄上清后用20 ii L PBS緩沖液重懸細胞，用P20移液槍充分混勻重懸細胞。加入 20 u L2 X Laemmli緩沖液，煮沸5分鐘，SDS-PAGE上樣，電泳；然后電轉移至PVDF膜上，經 5%脫脂奶粉25°C封閉6h;加入鼠抗⑶133單克隆抗體(I: 1000稀釋)，4°C孵育過夜；力口入HRP標記的山羊抗鼠IgG (I: 3000稀釋) ，室溫孵育Ih;用增強型ECL化學發光試劑顯色，結果如圖7所示，顯示⑶133蛋白較高的表達效率。
[0058] 申請人:聲明，本發明通過上述實施例來說明本發明的詳細特征以及詳細方法，但本發明并不局限于上述詳細特征以及詳細方法，即不意味著本發明必須依賴上述詳細特征以及詳細方法才能實施。所屬【技術領域】的技術人員應該明了，對本發明的任何改進，對本發明選用組分的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發明的保護范圍和公開范圍之內。
【權利要求】
1.一種表達⑶133的重組腺病毒，其特征在于，其攜帶人⑶133基因，優選地，所述人 CD 133基因的序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根據權利要求1所述的重組腺病毒，其特征在于，其表達人⑶133蛋白，優選地，所述人CD 133蛋白的序列如SEQ ID NO: 2所示。
3.根據權利要求1或2所述的重組腺病毒，其特征在于，構建所述重組腺病毒所用的穿梭質粒為 pShuttIe-CMV ；優選地，構建所述重組腺病毒所用的病毒骨架質粒為pAdeasy-1 ；優選地，構建所述重組腺病毒所用的包裝細胞為哺乳動物細胞，優選人胚腎293細胞。
4.一種重組腺病毒質粒，其特征在于，其通過攜帶人CD133基因的重組穿梭質粒與病毒骨架質粒同源重組得到；優選地，所述重組穿梭質粒為pShuttle-CMV攜帶人⑶133基因構成的；優選地，所述病毒骨架質粒為pAdeasy-1 ；優選地，所述同源重組發生在大腸桿菌內，優選大腸桿菌BJ5183。
5.如權利要求4所述的重組腺病毒質粒的構建方法，其特征在于，所述構建方法包括將線性化的重組穿梭質粒pShuttIe-CMV-⑶133轉化包含病毒骨架質粒pAdeasy-1的感受態大腸桿菌BJ5183進行同源重組，篩選陽性克隆，并從所述陽性克隆中提取所述重組腺病毒質粒；優選地，所述線性化為PmeI酶切線性化；優選地，所述篩選陽性克隆為使用含卡那霉素的LB培養基平板篩選；任選地,還包括將所述重組腺病毒質粒轉化感受態大腸桿菌DH10B,并大量抽提質粒備 用。
6.如權利要求1至3中任一項所述的重組腺病毒的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括將如權利要求4所述的重組腺病毒質粒線性化后轉染哺乳動物細胞、優選人胚腎 293細胞，至出現明顯細胞病變效應后，收集細胞，反復凍融，離心得到包含所述重組腺病毒的上清液；優選地，所述線性化采用PacI酶切線性化；優選地，-70°C和37°C交替條件下反復凍融2?4次，優選3次；任選地，還包括將所述上清液感染哺乳動物細胞、優選人胚腎293細胞以擴增所述重組腺病毒。
7.—種表達⑶133蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括用如權利要求1至3中任一項所述的重組腺病毒感染哺乳動物細胞、優選人胚腎293細胞，使CD133蛋白在所述細胞中表達。
8.—種表達CD133蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括用如權利要求4所述的重組腺病毒質粒線性化后轉染哺乳動物細胞、優選人胚腎293細胞，使CD133蛋白在所述細胞中表達。
9.如權利要求1至3中任一項所述的重組腺病毒在⑶133蛋白表達中的用途。
10.如權利要求4所述的重組腺病毒質粒在⑶133蛋白表達中的用途。
【文檔編號】C12N15/861GK103436556SQ201310353962
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月14日 優先權日:2013年8月14日
【發明者】沈政 申請人:沈政