一種用于磁共振示蹤腫瘤細胞的診斷劑的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種用于磁共振示蹤腫瘤細胞的診斷劑，包含人端粒酶逆轉錄酶啟動子、鐵蛋白報告基因和慢病毒載體、包裝質粒和包裝細胞。端粒酶逆轉錄酶啟動子調控鐵蛋白報告基因在腫瘤細胞內特異性過表達，供磁共振檢測惡性腫瘤。
【專利說明】一種用于磁共振示蹤腫瘤細胞的診斷劑
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種用于磁共振示蹤腫瘤細胞的診斷劑。
[0002]發明背景
[0003]研究表明端粒酶催化亞單位即人端粒酶逆轉錄酶，簡稱為“hTERT”，在絕大多大數人腫瘤細胞和永生化細胞內表達陽性，而在正常體細胞內為陰性，與端粒酶活性具有一致性，是腫瘤細胞的特異性標志物。因此，hTERT的啟動子可以調控基因靶向性表達于端粒酶陽性的腫瘤細胞內，而且其啟動子是目前已知最廣譜的腫瘤細胞特異性啟動子。
[0004]報告基因顯像技術主要是將分子生物學和顯像技術結合，實現靶分子的非侵入性顯像。鐵蛋白基因是磁共振成像(MRI)中最受關注的報告基因之一，不需引入外源性對比劑即可實現顯像。磁共振成像技術臨床應用廣泛，成像分辨率高，可同時獲得解剖和功能信息，鐵蛋白是機體主要的儲鐵蛋白，可將攝取的鐵離子聚集在蛋白殼內，形成具有超順磁性的氧化鐵顆粒，因此，應用鐵蛋白報告基因實現MR顯像的方法成為了焦點之一。
[0005]本發明人研究發現，基因的表達受到啟動子的調控，所以通過檢測基因表達情況能間接反映啟動子的轉錄活性，但是，需通過提取細胞或組織進行免疫染色、蛋白印跡等侵入性手段來檢測啟動子驅動基因表達后帶來的效應。因此，應用非侵入性手段對端粒酶逆轉錄酶啟動子的轉錄活性進行檢測成像具有重要腫瘤學意義。應用hTERT啟動子調控鐵蛋白報告基因過表達的載體感染細胞，然后進行MR成像，使用MR鐵蛋白報告基因成像技術可以非侵入性檢測活體腫瘤細胞。
【發明內容】
[0006]本發 明的目的提供了一種用于磁共振示蹤腫瘤細胞的診斷劑，包含人端粒酶逆轉錄酶啟動子、鐵蛋白報告基因、慢病毒載體、包裝質粒和包裝細胞。
[0007]上述本發明的用于磁共振示蹤腫瘤細胞的診斷劑，人端粒酶逆轉錄酶啟動子和鐵蛋白報告基因插入慢病毒載體，人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)啟動子調控鐵蛋白報告基因在慢病毒載體內表達，并通過載體質粒，傳染給腫瘤細胞過表達，所述鐵蛋白報告基因為帶有flag標簽蛋白序列的鐵蛋白重鏈全基因，所述包裝質粒為p⑶/NL-BH*DDD和pLTR-G，所述包裝細胞為293T。
[0008]在一實施方案中，本發明的用于磁共振示蹤腫瘤細胞的診斷劑，包含人端粒酶逆轉錄酶啟動子、鐵蛋白報告基因、慢病毒載體、包裝質粒和包裝細胞，其中，人端粒酶逆轉錄酶啟動子和鐵蛋白報告基因插入慢病毒載體，人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)啟動子調控鐵蛋白報告基因在慢病毒載體內表達，并通過載體質粒，傳染給腫瘤細胞過表達。
[0009]在上述實施方案中，本發明的用于磁共振示蹤腫瘤細胞的診斷劑，所述鐵蛋白報告基因為帶有flag標簽蛋白序列的鐵蛋白重鏈全基因，所述包裝質粒為pCD/NL-BH*DDD和 pLTR-G，所述包裝細胞為293T。
[0010]本發明的另一目的提供了一種制備用于磁共振示蹤腫瘤細胞的診斷劑的方法，包括以下步驟:[0011]I)根據Genbank (基因庫)代號為NM_010239的鐵蛋白重鏈(Fth)基因序列信息人工合成目的基因并接入flag標簽蛋白序列，在其兩端引入限制性內切酶NheI和BamHI 識別位點，利用DNA連接酶將所述蛋白序列克隆入慢病毒(p⑶H-CMV-MCS-Puro)載體質粒， 得到 pCDH-CMV-Fth-f Iag-Puro 慢病毒載體；
[0012]2)用Spe I和Xba I對步驟I)的慢病毒載體進行雙酶切，酶切產物電泳后回收無 CMV的載體片段；
[0013]3)從含hTERT的質粒中PCR擴增hTERT啟動子片段重組入步驟2)的無巨細胞病毒(CMV)的載體片段構建成目的pCDH-hTERT-Fth-f Iag-Puro慢病毒載體；
[0014]4)對步驟 3)的 pCDH-hTERT-Fth-fIag-Puro 慢病毒包裝，采用 pCD/NL_BH*DDD 和 pLTR-G包裝質粒，293T包裝細胞，構建成Lent1-hTERT-Fth-f Iag-Puro慢病毒表達載體，即得診斷劑。
[0015]術語“腫瘤細胞”在本發明中沒有特別指明的情況下是指惡性腫瘤細胞。
[0016]本發明的再一目的提供了一種檢測腫瘤細胞的方法，將本發明的用于磁共振示蹤腫瘤細胞的診斷劑與腫瘤細胞接觸，將人端粒酶逆轉錄酶啟動子和鐵蛋白報告基因傳染給腫瘤細胞過表達，用MRI掃描示蹤腫瘤細胞。
[0017]本發明的診斷劑的有益效果，現有技術直接用人端粒酶逆轉錄酶啟動子作為特異性標志物在腫瘤細胞中表達，用以檢測腫瘤細胞，但需要通過提取細胞或組織進行免疫染色、蛋白印跡等侵入性手段來檢測，且只能檢測淺表腫瘤細胞。而本發明的診斷劑，由于人端粒酶逆轉錄酶啟動子調控鐵蛋白報告基因在腫瘤細胞特異性過表達，而人端粒酶逆轉錄酶啟動子調控鐵蛋白報告基因在正常細胞或良性腫瘤細胞中無表達，在腫瘤細胞中過表達的鐵蛋白報告基因可以攝取外源性或內源性鐵，聚集成超磁性鐵，因此，可以用MRI成像技術示蹤檢測，因此，無需離體免疫染色測定。本發明的診斷劑對深部惡性腫瘤也可通過MR 鐵蛋白報告基因成像檢測，也可以對惡性和良性腫瘤進行診斷，以區分是良性還是惡性腫瘤。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1免疫熒光染色檢測hTERT啟動子在A549和HPDLF細胞株內情況
[0019]圖2免疫熒光染色檢測Fth-flag基因在A549和HPDLF細胞內表達情況
[0020]圖3普羅士蘭鐵染色檢測細胞攝鐵能力
[0021 ] 圖4磁共振對體外A549和HPDLF細胞進行T2*WI和T2*MAP掃描的信號強弱
[0022]圖5磁共振對體外A549和HPDLF細胞掃描的T2信號
【具體實施方式】
[0023]以下實施例用于進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明的范圍。
[0024]實施例1診斷劑的制備
[0025]根據Genbank (NM_010239)鐵蛋白重鏈(Fth )基因序列信息人工合成目的基因并接入f Iag標簽蛋白序列(Fth-f Iag )，在兩端引入限制性內切酶Nhe I和 BamHI識別位點，利用DNA連接酶將合成序列克隆入慢病毒載體質粒p⑶H-CMV-MCS-Puro，命名為 pCDH-CMV-Fth-f Iag-Puro。用 Spe I 和 Xba I 對 pCDH-CMV-Fth-f Iag-Puro 表達載體進行雙酶切，酶切產物電泳后回收無CMV的載體片段。從含hTERT啟動子的質粒中PCR擴增hTERT 啟動子片段重組入回收的載體片段構建成目的p⑶H-hTERT-Fth-flag-Puix)載體。測序無誤并檢測目的基因能表達后，進行慢病毒包裝。慢病毒包裝采用p⑶/NL-BH*DDD和pLTR-G 包裝質粒，293T包裝細胞，構建成慢病毒表達載體，命名為Lent1-hTERT-Fth-f lag-Puro， 即為本發明的診斷劑。
[0026]對比實施例1
[0027]無hTERT啟動子的鐵蛋白重鏈基因慢病毒表達載體的制備
[0028]采用實施例1獲得的p⑶H-CMV-Fth-f Iag-Puro慢病毒載體進行慢病毒包裝， 采用p⑶/NL-BH*DDD和pLTR-G包裝質粒，293T包裝細胞，構成慢病毒表達載體，命名為 Lent1-CMV-Fth-flag-Puroo
[0029]實施例2檢測測試
[0030]1、材料:
[0031]細胞株:人肺腺癌(A549)和人原代培養牙周膜成纖維(HPDLF)細胞由第三軍醫大學附屬新橋醫院中心實驗室保存，也可在商業市場上購買。
[0032]實驗主要試劑:細胞培養主要試劑:高糖DMEM培養基(GIBIC0)、胎牛血清 (GIBIC0)、枸櫞酸鐵(Sigma)。抗體:兔抗人 hTERT —抗(Abeam)、鼠抗 flag —抗(Sigma)、 抗兔Alexa Fluor488和抗鼠Alexa Fluor555突光二抗(碧云天)。
[0033]2、方法
[0034]2.1細胞培養及轉染:
[0035]A549細胞和HPDLF細胞用含10%胎牛血清、IOOU / ml青霉素和IOOmg / ml鏈霉素的高糖DMEM培養基培養，培養條件為37 V，95%空氣，5%C02。分別應用 Lent1-hTERT-Fth-f Iag-Puro 和 Lent1-CMV-Fth-f Iag-Puro 兩種慢病毒感染 A549 和 HPDLF 細胞(M0I 分別為 40 和 100)，得到 hTERT-A549、hTERT-HPDLF 和 CMV-A549、CMV-HPDLF 細胞株，再用嘌呤霉素(3ug/ml，hTERT-HPDLF細胞除外)篩選出穩定的轉染株。
[0036]2.2免疫熒光染色
[0037]分別將hTERT-A549、hTERT-HPDLF 和 CMV-A549、CMV-HPDLF 細胞株接種于共聚焦培養皿內，2天后進行染色。4%多聚甲醛固定lOmin，0.5%Triton X-100孵育5min，10%羊血清封閉20min,兔人hTERT單克隆一抗或鼠抗flag單克隆一抗4°C孵育過夜,抗兔或鼠Alexa Fluor555 二抗室溫避光孵育60min，DAPI復染核3min，抗熒光淬滅封片液封片后共聚焦顯微鏡成像。
[0038]2.2.1檢測只有hTERT啟動子的慢病毒載體傳染A549、HPDLF細胞及其表達。
[0039]采用免疫熒光染色檢測方法，檢測細胞株hTERT表達，檢測結果顯示A549細胞內 hTERT表達呈陽性，如圖1中的A549，圖中亮點即為hTERT表達，HPDLF細胞內hTERT表達為陰性，即圖1中的HPDLF正常細胞沒有出現熒光亮點。
[0040]結果表明，hTERT啟動子在腫瘤細胞中表達，在非腫瘤細胞中無表達。表明hTERT 啟動子在腫瘤細胞內表達的特異性。
[0041]2.2.2檢測帶有細胞hTERT啟動子(Fth)和鐵蛋白基因(flag)的慢病毒載體傳染 A549、HPDLF細胞及其表達，即Fth-flag表達檢測。
[0042]采用免疫熒光染色檢測法，結果顯示hTERT_A549細胞Fth-flag表達呈強陽性，hTERT-HPDLF細胞無Fth-flag表達，分別見圖2中的hTERT_A549和hTERT-HPDLF，前者有亮點，表示有，后者沒有出現高點，表示沒有Fth-flag表達；對照組CMV-A549和CMV-HPDLF 細胞均表達Fth-flag，見圖2的CMV-A549和CMV-HPDLF顯示有亮點，表明有Fth-flag表達.未轉染的A549和HPDLF細胞均無Fth-flag表達，見圖2中的A549和HPDLF，沒有出現亮點，表示沒有Fth-flag表達。這些結果說明hTERT啟動子只在hTERT表達陽性即端粒酶陽性的腫瘤細胞內驅動所調控Fth-flag基因表達，在端粒酶陰性的正常細胞內不發揮驅動作用；對照CMV啟動子在2種細胞內均驅動Fth-flag基因表達，無特異性。
[0043]2.3普羅士蘭鐵染色
[0044]分別將hTERT-A549、hTERT-HPDLF 和 CMV-A549、CMV-HPDLF 細胞用含枸櫞酸鐵銨 (FAC, ImM)培養基培養48h，PBS充分漂洗，4%多聚甲醛固定lOmin，普羅士蘭鐵染色試劑(2% 亞鐵氰化鉀和10%HC1等體積混合，現配現用)室溫作用30min，中性紅染核30秒，蒸餾水沖洗，封片。
[0045]采用普羅士蘭染色法檢測hTERT啟動子和Fth-flag基因在A549、HPDLF細胞內的表達。
[0046]經普羅士蘭鐵染色后檢測，發現hTERT_A549細胞內聚集了大量藍染顆粒，見圖3 中的hTERT-A549圖，大小較均勻，分布以胞漿為主，而hTERT-HPDLF細胞內有稀少藍染顆粒，；見圖3中的hTERT-HPDLF圖，對照CMV-A549和CMV-HPDLF細胞內均可見明顯藍染顆粒,分別見圖3中的CMV-A549圖和CMV-HPDLF圖，未轉染A549和HPDLF細胞內可見稀少藍染顆粒，分別見圖3中的A549和HPDLF圖。結合免疫熒光染色檢測Fth-f lag表達結果， 可知細胞攝鐵能力與Fth表達水平具有一致性，說明細胞高表達鐵蛋白后攝鐵能力顯著增力口。實驗結果表明鐵蛋白在腫瘤和正常細胞中均有表達，沒有表現出對腫瘤細胞的特異性， 而同時聯接有hTERT啟動子和鐵蛋白基因的慢病毒載體即本發明的診斷劑傳染給正常細胞后未有鐵蛋白基因表達，但傳染給腫瘤細胞后有鐵蛋白基因表達，表現出對腫瘤細胞有特異性過表達。也證明hTERT啟動子調控鐵蛋白基因的過表達，可利用這一對腫瘤的特異性表達，檢測活體惡性腫瘤細胞。
[0047]2.4MRI示蹤檢測
[0048]分別將hTERT -A549、hTERT-HPDLF 和 CMV-A549、CMV-HPDLF 細胞用含 FAC( 500 u M) 的培養基培養48h后，用PBS充分清洗細胞以除去游離鐵離子。胰酶消化后離心收集細胞 (約2xl07個)，4%多聚甲醛固定lOmin。在2ml離心管內預鋪墊500 yll%瓊脂糖，待其冷卻后，將細胞用Iml PBS重懸后加入離心管內，待細胞自然下沉至瓊脂糖面上。進行3.0T磁共振掃描(GE)，掃描參數:梯度自旋回波(GRE) T2*WI:TR=400ms, TE=12.0ms,成像視野(FOV) 為 24mmX24mm，層厚 1mm，層間距 0.1mm;T2*MAP:TR=IOOOms,TE= (2.6,6.1,9.5，13.0，16.5， 20.0，23.5，26.9)所得圖像由軟件自動生成T2*值偽彩圖。每種細胞選取5個感興趣區 (ROI，面積 30mm2)測量 T2* 值，測值所選參數:TR=IOOOms, TE=12.0ms。
[0049]2.4.1統計學方法
[0050]應用SPSS17.0軟件對收集的數據進行統計學處理，結果用均值土標準差示，同種細胞不同處理組之間T2*值差異應用單因素ANOVA檢驗分析，當P〈0.05時認為有統計學意義。
[0051]2.4.2MRI 檢測結果[0052]采用磁共振對體外細胞進行T2*WI和T2*MAP掃描，結果示:hTERT_A549細胞 T2*WI信號強度較A549細胞顯著降低，T2*值差異顯著(hTERT-A549:12.10±0.92ms, A549:21.44±1.51ms, p<0.05)，hTERT-HPDLF 細胞 T2*WI 和 T2* 值較HPDLF 細胞無明顯差異 (hTERT-HPDLF:24.01±1.13ms,HPDLF: 23.38±1.72ms,p>0.05);CMV組細胞T2*WI 和 T2*值均較未轉染細胞明顯降低(CMV-A549:9.21±0.85ms, CMV-HPDLF:11.66±0.69ms, p<0.05) (圖4、圖5)。綜合以上結果，證實hTERT啟動子能控制鐵蛋白報告基因在端粒酶陽性腫瘤細胞內過表達，使細胞攝鐵能力顯著增加，并引起細胞T2*WI信號降低，T2*值降低，說明通過MRI報告基因成像技術可檢測hTERT啟動子轉錄活性。同時也證明本發 明的診斷劑在惡性腫瘤細胞內特異過表達的特性，借此特性通過MRI鐵蛋白報告基因成像技術可檢測惡性腫瘤細胞。
【權利要求】
1.一種用于磁共振示蹤腫瘤細胞的診斷劑，其特征在于，包含人端粒酶逆轉錄酶 (hTERT)啟動子、鐵蛋白報告基因、慢病毒載體、包裝質粒和包裝細胞。
2.如權利要求1所述的診斷劑，其特征在于，人端粒酶逆轉錄酶啟動子調控鐵蛋白報告基因在慢病毒載體內表達。
3.如權利要求2所述的診斷劑，其特征在于，人端粒酶逆轉錄酶啟動子和鐵蛋白報告基因插入慢病毒載體傳染給腫瘤細胞過表達。
4.如權利要求1或3任一所述的診斷劑，其特征在于，所述鐵蛋白報告基因為帶有 flag標簽蛋白序列的鐵蛋白重鏈全基因。
5.如權利要求1或3所述的診斷劑，所述腫瘤細胞為惡性腫瘤細胞。
6.如權利要求1所述的診斷劑，所述包裝質粒為p⑶/NL-BH*DDD和pLTR-G，所述包裝細胞為293T。
7.一種制備用于磁共振示蹤腫瘤細胞的診斷劑的方法，包括以下步驟:1)根據Genbank代號為NM_010239的鐵蛋白重鏈基因序列信息人工合成目的基因并接 A flag標簽蛋白序列，在其兩端引入限制性內切酶NheI和BamHI識別位點，利用DNA連接酶將所述蛋白序列克隆入慢病毒載體；2)用SpeI和Xba I對步驟I)的慢病毒載體進行雙酶切，酶切產物電泳后回收無CMV 的載體片段；3)從含hTERT的質粒中PCR擴增hTERT啟動子片段重組入步驟2)的無CMV的載體片段構建成目的慢病毒載體；4)對步驟3)的慢病毒包裝，采用pCD/NL-BH*DDD和pLTR-G包裝質粒，293T包裝細胞， 得到Lent1-hTERT-Fth-fIag-Puro慢病毒表達載體，即得診斷劑。
8.—種檢測惡性腫瘤細胞的方法，權利要求1的診斷劑與惡性腫瘤細胞接觸，將人端粒酶逆轉錄酶啟動子和鐵蛋白報告基因傳染給腫瘤細胞過表達 ，用MRI掃描示蹤腫瘤細胞。
【文檔編號】C12N15/65GK103436558SQ201310353945
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月14日 優先權日:2013年8月14日
【發明者】張冬, 楊燕, 文利 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學第二附屬醫院