一種用于預測干擾素治療慢性hbv療效的微小核糖核酸及其應用的制作方法

一種用于預測干擾素治療慢性hbv療效的微小核糖核酸及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于生物【技術領域】，涉及一種用于預測干擾素治療慢性HBV療效的微小核糖核酸及其應用。一種血清miRNA組合，該miRNA組合主要由人巨細胞病毒源的hcmv-mir-US4和hcmv-mir-UL148D兩種成熟體miRNA組成。所篩選出的HCMV miRNA組合對干擾素治療慢性乙型病毒性肝炎病人療效預測的特異性和靈敏度顯著高于目前臨床上的經驗預測，提高了預測的準確性。
【專利說明】-種用于預測干擾素治療慢性HBV療效的微小核糖核酸及 其應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物【技術領域】，涉及一種用于預測干擾素治療慢性HBV療效的微小核 糖核酸及其應用。

【背景技術】
[0002] 乙型肝炎是一種呈世界性分布、危害嚴重的傳染病。據世界性衛生組織報道，全球 約20億人曾感染過乙型肝炎病毒（h印atitis B virus，HBV)，其中3. 5億人為慢性感染者， 每年約有100萬人死于HBV感染所致肝衰竭、肝硬化和原發性肝癌（HCC)。我國現有的慢性 HBV感染者約9300萬人，其中有癥狀需要治療的活動性乙型肝炎患者約為2000多萬。加之 HBV的傳染性強，治療乙肝無疑是十分重要的。
[0003] 目前治療慢性乙肝的抗病毒療法主要依靠兩種藥物：α干擾素和核苷類似物類 藥物。干擾素（interferon，IFN)是一種具有廣譜抗病毒、抗腫瘤、抑制細胞增長和免疫調 節作用的細胞因子。然而，和許多其他藥物一樣，α干擾素的療效并不是對于所有病患的 療效都非常理想。由于干擾素在治療過程中常常伴隨著發熱、寒戰、頭痛、肌肉酸痛和乏力 等不良反應，如果有一種有效方便的方法能夠在病人用藥之前就對其療效進行預測，那將 是慢性乙肝病人的一大福音。臨床上主要用短期用藥后乙肝表面抗原（HBsAg)與HBV-DNA 相結合的方法來觀察干擾素對乙肝病人的療效。但HBsAg與HBV-DNA的檢測依然避免不了 短時間的用藥，病人仍然需要一個短期的干擾素試驗過程。并且，該方法的特異性和靈敏度 明顯偏低，對干擾素藥物的療效預測并沒有很大幫助。
[0004] 綜上所述，我國慢性乙肝患者數目眾多，且該病傳染性強，而干擾素作為一種經典 抗病毒藥物，其治療周期長，副作用明顯，且統計顯示干擾素對部分乙肝病人無效。因此，尋 找一種預測干擾素療效的有效方便的生物標志物能夠避免錯過無效人群的最佳治療時期， 從而提高慢性乙肝的治愈率，對指導臨床慢性乙肝的個體化治療有著重要意義。
[0005] 微小核糖核酸（microRNA，miRNA)是近年的一個研究熱點，它是一類長約19-23 個核苷酸的單鏈RNA分子，位于基因組非編碼區，進化上高度保守，可在翻譯水平對基因表 達進行調節，并與動物的許多正常生理活動及許多疾病的發生及發展存在著緊密的聯系。 近來研究表明血清/血漿微小核糖核酸可以用于多種癌癥的前期診斷和治療指導，但還 沒有關于血清/血漿微小核糖核酸用于預測干擾素治療慢性乙型病毒性肝炎病人療效的 報道。


【發明內容】

[0006] 本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種用于預測干擾素治療慢性乙型 病毒性肝炎病人療效的血清中巨細胞病毒源的miRNA。
[0007] 本發明的另一目的是提供一種用于預測干擾素治療慢性乙型病毒性肝炎病人療 效的TaqMan探針。
[0008] 本發明的又一目的是提供所述miRNA和TaqMan探針的應用。
[0009] 本發明的目的可通過如下技術方案實現：
[0010] -種血清miRNA組合，該miRNA組合主要由人巨細胞病毒源的hcmv-mir_US4和 hcmv-mir_UL148D 兩種成熟體 miRNA 組成，或者由 hcmv-mir_US4 和 hcmv-mir_UL148D 及 hsa-miR-16 三種 hcmv-miR-US4miRNA 組成。所述的 hcmv-mir_US4 序列如 SEQ ID NO. 1 所 不，所述的hcmv-mir-UL148D序列如SEQIDN0·2所不，所述的hsa-miR-16序列如SEQID NO. 3所示。
[0011] 一種用于預測干擾素治療慢性乙型病毒性肝炎病人療效的TaqMan探針組合 物，由hcmv-mir_US4的TaqMan探針和hcmv-mir_UL148D的TaqMan探針組成；或者由 hcmv-mir-US4 的 TaqMan 探針、hcmv-mir-UL148D 的 TaqMan 探針以及 hsa-miR-16 的 TaqMan 探針組成。
[0012] 所述的TaqMan探針組合物，所述的hcmv-mir_US4的TaqMan探針優選為ABI 公司生產的貨號為197236的TaqMan探針，或者SEQ ID NO. 4所示的TaqMan探針； hcmv-mir_UL148D的TaqMan探針優選為ABI公司生產的貨號為197215的TaqMan探針，或 者SEQ ID NO. 5所示的TaqMan探針；hsa-miR-16的TaqMan探針優選為ABI公司生產的貨 號為000391的TaqMan探針，或者SEQ ID NO. 6所示的TaqMan探針。
[0013] 本發明所述的血清miRNA組合在制備預測干擾素治療慢性乙型病毒性肝炎病人 療效的試劑或工具中的應用。
[0014] 本發明所述的TaqMan探針組合物在制備預測干擾素治療慢性乙型病毒性肝炎病 人療效的試劑或工具中的應用。
[0015] 一種用于預測干擾素治療慢性乙型病毒性肝炎病人療效的TaqMan探針，為 hcmv-mir_US4的TaqMan探針，優選ABI公司生產的貨號為197236的hcmv-mir_US4的 TaqMan探針或者SEQ ID NO. 4所示的TaqMan探針。
[0016] 所述的hcmv-mir-US4的TaqMan探針在制備預測干擾素治療慢性乙型病毒性肝炎 病人療效的試劑或工具中的應用。
[0017] 一種用于預測干擾素治療慢性乙型病毒性肝炎病人療效的試劑盒，該試劑盒包含 本發明所述的TaqMan探針組合物或者hcmv-mir-US4的TaqMan探針。
[0018] 所述試劑盒還包括Taq酶、dNTP、氯化鎂和不含Mg2+的PCR緩沖液。
[0019] 本發明所述miRNA或miRNA組合的篩選方法包括以下步驟：
[0020] (1)收集干擾素治療乙肝有效和無效患者的混合血清或血漿，提取總RNA ;
[0021] (2)用定量PCR方法（TaqMan探針）對干擾素治療乙肝有效和無效患者進行逐個 檢測，初篩出在兩組樣品中穩定的表達差異顯著的HCMV miRNA ;
[0022] (3)擴大標本量對干擾素治療乙肝有效和無效患者進行逐個驗證，篩選出穩定的 表達差異顯著的一組miRNA。
[0023] (4)進一步擴大標本量，收集進行過干擾素治療乙肝患者血清或血漿。進行雙盲實 驗，通過檢測步驟（1) (2) (3)篩選得到的miRNA在血清中的表達量，判斷干擾素治療乙肝 的療效并驗證其正確率。
[0024] 具體來說，上述篩選方法包括以下步驟：（1)分別收集干擾素治療有效的乙肝患 者和干擾素治療無效的乙肝患者的混合血清或血漿，并提取總RNA ; (2)將抽提的RNA逆轉 錄為cDNA，采用熒光實時定量PCR(TaqMan探針）對HCMV miRNA在干擾素治療乙肝有效患 者、干擾素治療乙肝無效患者中進行初篩和復篩，挑選出在干擾素治療乙肝有效患者、干擾 素治療乙肝無效患者血清或血漿中穩定、特異表達的一組HCMV miRNA。（3)收集干擾素治 療效果未知的乙肝患者的血清或血漿，并提取總RNA ; (4)將抽提的RNA逆轉錄為cDNA，采 用熒光實時定量PCRCTaqMan探針）對挑選出的一組HCMV miRNA在乙肝患者的血清中的含 量進行檢測，預測各個患者經干擾素治療有無療效，并取得臨床數據驗證正確率。
[0025] 本發明使用的檢測方法可以選自：RT-PCR方法、Solexa測序技術（Solexa sequencing technology)、Real_time PCR法或低密度芯片幾種方法中的一種或幾種。例 如，血清中miRNA分子的檢測方法包括以下步驟：
[0026] (1)使用 miRNeasy Mini Kit (Qiagen)提取血清總 RNA ;
[0027] (2)通過RNA逆轉錄反應得到cDNA ;
[0028] (3)根據HCMV miRNA設計引物進行Real-time PCR反應，比較各組血清中HCMV miRNA的量的變化。
[0029] 本發明的有益效果：
[0030] 首先，血清相對容易獲得，不僅穩定、微創、易于檢測，且定量精確，將大大提高疾 病診斷的敏感性和特異性，該類小分子RNA生物標志物的成功開發是對以蛋白為主的傳統 生物標志物的顛覆，將為干擾素治療慢性乙型病毒性肝炎病人療效預測開創全新局面，為 其他藥物實現個體化差異治療提供借鑒。
[0031] 其次，血清miRNA反映的是機體整體的病理、生理情況，以其作為分子標志物具有 一定的準確性和特異性。血清miRNA檢測試劑盒是一種系統、全面的試劑盒，血清miRNA檢 測試劑盒能夠明確接受干擾素治療的慢性乙型病毒性肝炎患者的個體差異，反映患者是否 適合干擾素治療，避免既往繁雜檢測，節約了成本和時間，為臨床醫生快速準確掌握患者病 情、及時采取更具個性化的防治方案提供支持。所述試劑盒簡化了引物庫，減少制作成本和 生產時間，增加了針對性和實用性，提高了檢測的靈敏度和特異性。
[0032] 第三，所篩選出的HCMV miRNA組合對干擾素治療慢性乙型病毒性肝炎病人療效預 測的特異性和靈敏度顯著高于目前臨床上的經驗預測，提高了預測的準確性。此外，血清 HCMV miRNA檢測能在分子水平上反映乙肝發生發展過程中人類巨細胞病毒的活動狀態，為 慢性乙型病毒性肝炎病人的治療提供了新的治療思路。
[0033] 第四，本發明的試劑盒所包含的引物同樣是基于定量PCR技術篩選出的在干擾 素治療有效的乙肝患者、干擾素治療有效的乙肝患者之間表達差異顯著的一組血清HCMV miRNA引物，這樣可以增加檢測的靈敏度和特異性，提高檢測水平。
[0034] 綜上所述，本發明提供的特異的HCMV miRNA組合作為預測干擾素治療慢性乙型病 毒性肝炎療效的指標，有助于醫師結合臨床癥狀、病史或其他檢查信息對乙肝病患制定適 當的治療方案。檢測血清中的HCMV miRNA簡單易行且療效優越。基于此制備的用于檢測 血清miRNA的試劑盒投入實踐使用，僅僅需要病人的血清或血漿而不需要任何其它組織通 過最精簡的探針庫來檢測血清miRNA水平能拓展干擾素治療慢性乙型病毒性肝炎療效的 預測指標，提高檢測的靈敏度，豐富預測干擾素治療乙肝療效的手段，具有極重要的臨床應 用潛力和價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0035] 圖1顯示初篩病人的13種miRNA的條形統計圖。橫軸代表不同的miRNA，縱軸為 每種miRNA的絕對含量（fmol/L)。*代表t檢驗p〈0. 05,亦即有顯著差異；**代表t檢驗 p〈0. 01，亦即有極顯著差異。
[0036] 圖2顯示初篩有顯著差異的5種miRNA的散點圖。其中a, b, c, d分別為hcmv-mi R-US4, hcmv-miR-UL148D, hcmv-miR-UL112, hcmv_miR-US5 四種 miRNA。縱坐標為絕對含量 (fmol/L)。兩組散點縱向位置分布的差異顯示了 miRNA在不同群體中含量有差異，可以作 為標志物。
[0037] 圖3顯示復篩病人的5種miRNA的條形統計圖。橫軸代表不同的miRNA，縱軸為 每種miRNA的絕對含量（fmol/L)。**代表t檢驗p〈0. 01，亦即有極顯著差異。
[0038] 圖4顯示復篩有顯著差異的2種miRNA的散點圖。其中a)為hcmv-miR_US4, b) 為hcmv-miR-UL148D。縱坐標為絕對含量（fmol/L)。兩組散點縱向位置分布的差異顯示了 在不同群體中miRNA含量有差異，可以作為標志物。
[0039] 圖5顯示以hcmv-miR_US4作為marker時的ROC曲線。曲線下面積越趨近于1表 明該標志物的靈敏性和特異性越高（圖中AUC=L 00)。
[0040] 圖6顯不以hcmv_miR-UL148D作為marker時的ROC曲線。曲線下面積越趨近于 1表明該標志物的靈敏性和特異性越高（圖中AUC=O. 96)。
[0041] 圖 7 顯不以 hcmv_miR-US4 和 hcmv_miR-UL148D 作為 marker 聯用時的 ROC 曲線。 曲線下面積越趨近于1表明該標志物的靈敏性和特異性越高（圖中AUC=L 00)。
[0042] 圖8顯示以hcmv-miR-US4作為marker預測干擾素療效的102例病人的散點圖。

【具體實施方式】
[0043] 以下通過實施例對本發明作進一步的闡述。
[0044] 本發明所用的標本是本發明人于2009年7月到2011年10月間從南京市傳染病醫 院搜集了一定量的血清樣品，通過對樣品資料的整理，本發明人從中選擇了 28例干擾素 治療有效的乙肝患者(平均年齡：28. 89± 1. 79,年齡跨度：4-52,男性：20,女性：8)、28例干 擾素治療無效的乙肝患者(平均年齡：29. 89±1.22,年齡跨度：19-42,男性：18,女性：10)、 102例正在進行干擾素治療，實驗開始前療效未知的乙肝患者(平均年齡：30. 78±0. 92,年 齡跨度：7_56,男性：77,女性：25)作為q-PCR篩選、驗證的實驗樣品。具體的樣品歸類標準 如下：
[0045] 干擾素治療有效的乙肝患者：
[0046] 1.治療前 HBV-DNA 滴度大于 500IU/ml。
[0047] 2.治療后HBV-DNA滴度降低到少于治療前的10%。
[0048] 3.治療后沒有進行HBV-DNA檢測的患者，其HBsAg由陽轉陰。
[0049] 4.治療后沒有進行HBV-DNA檢測的患者，其HBeAg由陽轉陰。
[0050] 5.治療后沒有進行HBV-DNA檢測的患者，其ALT、ASIX40U/L。
[0051] 干擾素治療無效的乙肝患者：
[0052] 1.治療前 HBV-DNA 滴度大于 500IU/ml。
[0053] 2.治療后HBV-DNA滴度高于治療前的10%。
[0054] 3.治療后沒有進行HBV-DNA檢測的患者，其ALT或AST>80U/L。
[0055] 4.治療后沒有進行HBV-DNA檢測的患者，其HBsAg保持陽性。
[0056] 5.治療后沒有進行HBV-DNA檢測的患者，其HBeAg保持陽性。
[0057] 干擾素治療乙肝療效未知患者：
[0058] 1.治療前 HBV-DNA 滴度大于 500IU/ml。
[0059] 2.取樣時正在進行干擾素治療,療效未知。
[0060] 實施例1慢性乙肝患者特異性HCMV miRNA表達譜初篩
[0061] 使用定量PCR方法發現并證明10個干擾素治療有效的乙肝患者和10個干擾素治 療無效的乙肝患者血清/血漿中穩定存在5種差異表達的人類巨細胞病毒的微小核糖核 酸。具體步驟為：
[0062] (1)收集干擾素治療有效和無效的乙肝患者的血清/血漿
[0063] (2)制備cDNA樣品：a)收集干擾素治療有效和無效的乙肝患者的血清/血漿；b) 分別取每個患者IOOml的血清，加入Iml的QIAzol lysis Reagent,混勻；c)相分離：室溫放 置5min，然后每份加入200ul氯仿，劇烈震蕩15s，室溫2-3min，12, 000g，4°C，離心15min ; d)將水相轉移到新的2ml的離心管，再加入I. 5倍體積的無水乙醇，混勻，過RNA吸附柱，并 用RTW緩沖液和PRE緩沖液洗滌除去蛋白質等雜質；e)RNA收集：每份用30ul DEPC水將吸 附柱上的RNA洗脫下來；f)通過RNA逆轉錄反應得到cDNA。逆轉錄的反應體系包括4. 5ul 樣品 RNA 溶液、2μ15ΧΑΜν bufTer、l μ IlOmM each dNTP mixture (Takara 公司）、0·5μ1 RNase Inhibitor (Takara公司）、1μ I AMV (Takara公司）以及1μ I基因特異性反向引 物。反應步驟為16°C孵育15分鐘，42°C反應1小時，85°C孵育5分鐘。
[0064] (3)real time PCR:取 1μ I cDNA，加入 0·3μ I Taq 酶（Takara 公司），0·33μ 1 Taqman 探針（ΑΒΙ 公司），1.2 μ 125mM MgCl2,0.4yl2.5mM dNTP mixture (Takara 公司）， 2 4 110父卩0?1311打61'，14.77以1!120,2(^1體系進行9-?0?。儀器使用的是六81?1^81117300 熒光定量PCR儀，PCR的反應條件是：95°C、5分鐘進行I個循環一95°C、15秒，60°C、I分鐘 進行40個循環。兩組樣品血清microRNA的表達量使用人工合成的已知濃度的miR-16標 準品的CT值繪制的標準曲線進行定量分析，并算出比值。初篩出在兩組樣品中有顯著差異 的5種HCMV microRNA。五種HCMV microRNA對應的核苷酸序列及ABI公司的Taqman探針 貨號見表1。
[0065] 表 1
[0066]

【權利要求】
1. 一種血清miRNA組合，其特征在于該miRNA組合主要由人巨細胞病毒源 的 hcmv-mir_US4 和 hcmv-mir_UL148D 兩種 miRNA 組成，或者由 hcmv-mir_US4 和 hcmv-mir_UL148D 及 hsa-miR-16 三種 miRNA 組成。
2. 權利要求1所述的血清miRNA組合在制備預測干擾素治療慢性乙型病毒性肝炎病人 療效的試劑或工具中的應用。
3. -種用于預測干擾素治療慢性乙型病毒性肝炎病人療效的TaqMan探針組合物，其 特征在于由hcmv-mir_US4的TaqMan探針和hcmv-mir_UL148D的TaqMan探針組成；或者由 hcmv-mir-US4 的 TaqMan 探針、hcmv-mir-UL148D 的 TaqMan 探針以及 hsa-miR-16 的 TaqMan 探針組成。
4. 根據權利要求3所述的TaqMan探針組合物，其特征在于所述的hcmv-mir-US4的 TaqMan探針為ABI公司生產的貨號為197236的TaqMan探針，或者SEQ ID NO. 4所示的 TaqMan探針；hcmv-mir_UL148D的TaqMan探針為ABI公司生產的貨號為197215的TaqMan 探針，或者SEQ ID NO. 5所示的TaqMan探針；hsa-miR-16的TaqMan探針為ABI公司生產 的貨號為000391的TaqMan探針，或者SEQ ID NO. 6所示的TaqMan探針。
5. 權利要求3或4所述的TaqMan探針組合物在制備預測干擾素治療慢性乙型病毒性 肝炎病人療效的試劑或工具中的應用。
6. -種用于預測干擾素治療慢性乙型病毒性肝炎病人療效的TaqMan探針，其特征在 于為hcmv-mir_US4的TaqMan探針，優選ABI公司生產的貨號為197236的hcmv-mir_US4 的TaqMan探針或者SEQ ID NO. 4所示的TaqMan探針。
7. 權利要求6所述的TaqMan探針在制備預測干擾素治療慢性乙型病毒性肝炎病人療 效的試劑或工具中的應用。
8. -種用于預測干擾素治療慢性乙型病毒性肝炎病人療效的試劑盒，其特征在于該試 劑盒包含權利要求3或4所述的TaqMan探針組合物或者權利要求6所述的TaqMan探針。
9. 根據權利要求8所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括Taq酶、dNTP、氯化鎂 和不含Mg2+的PCR緩沖液。
【文檔編號】C12N15/11GK104419749SQ201310371324
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年8月22日 優先權日:2013年8月22日
【發明者】曾科, 潘怡, 王楠, 李麗民, 張辰宇 申請人:江蘇命碼生物科技有限公司