氧化酶、編碼該酶的多核苷酸、以及它們的應用的制作方法

本發明涉及氧化酶、編碼該氧化酶的多核苷酸、以及利用它們的α-氨基酸化合物等的制備方法。

背景技術：

α-氨基酸化合物在農林水產領域、食品領域、醫療領域及美容領域等中用于多種用途。例如，甲硫氨酸用作動物用飼料添加劑。在制備該化合物時，使丙烯醛和甲硫醇反應生成3-甲硫基丙醛，再使3-甲硫基丙醛與氫氰酸、氨和二氧化碳反應生成5-（2-甲基-巰基乙基）-乙內酰脲（甲硫氨酸乙內酰脲）。最后，將5-（2-甲基-巰基乙基）-乙內酰脲通過堿水解生成堿金屬甲硫氨酸鹽，隨后通過用酸例如硫酸或碳酸中和使甲硫氨酸游離（例如，參見專利文獻1等）。

現有技術文獻

專利文獻

專利文獻1 : 特開昭55-102557號公報。

技術實現要素：

發明要解決的課題

上述制備方法使用氫氰酸和丙烯醛作為C1或C3構成要素，但這些原料化合物的處理需要充分的管理和與其相適合的設備等。因此，期望開發例如甲硫氨酸等α-氨基酸化合物的新的制備方法。

解決課題的手段

本發明提供下列：

第1項．編碼下述（A1）至（A5）中的任一氨基酸序列的多核苷酸（下文也稱為本發明多核苷酸(A)）：

（A1）序列編號3所示的氨基酸序列、

（A2）i）與序列編號3所示的氨基酸序列具有85％以上的序列同一性的氨基酸序列，并且ii）具有將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列、

（A3）i）在序列編號3所示的氨基酸序列中缺失、置換或添加1個或多個氨基酸的氨基酸序列，并且ii）具有將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列、

（A4）i）由與由序列編號4或13所示的核苷酸序列的互補序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交的多核苷酸編碼的氨基酸序列，并且ii）具有將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列、或

（A5）i）在序列編號3所示的氨基酸序列中，具有選自第109號的纈氨酸置換為異亮氨酸、第191號的甘氨酸置換為天冬氨酸和第246號的谷氨酰胺置換為精氨酸中的1個以上氨基酸置換的改變的(altered)氨基酸序列，并且ii）具有將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列；

第2項．前述第1項記載的多核苷酸，其具有包含使得編碼前述氨基酸序列的核苷酸序列的密碼子使用頻率與大腸桿菌的密碼子使用頻率相符的選擇的密碼子的改變的核苷酸序列；

第3項．在宿主細胞內可發揮功能的啟動子與前述第1或2項記載的多核苷酸以可發揮功能的形式連接而成的多核苷酸；

第4項．含有前述第1至3項中任一項記載的多核苷酸的重組載體（下文也稱為本發明重組載體(A)）；

第5項．將前述第1至3項中任一項記載的多核苷酸或前述第4項記載的重組載體導入宿主細胞而成的轉化體；

第6項．前述第5項記載的轉化體，其中宿主細胞是微生物或大腸桿菌；

第7項．保有前述第1至3項中任一項記載的多核苷酸的轉化體；

第8項．重組載體的制備方法，其包含在可在宿主細胞內復制的載體中摻入前述第1至3項中任一項記載的多核苷酸的步驟；

第9項．轉化體的制備方法，其包含將前述第1至3項中任一項記載的多核苷酸或前述第4項記載的重組載體導入宿主細胞的步驟；

第10項．編碼下述（B1）至（B4）中的任一氨基酸序列的多核苷酸（下文也稱為本發明多核苷酸(B)）：

（B1）序列編號1所示的氨基酸序列、

（B2）i）與序列編號1所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的氨基酸序列，并且ii）具有將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列、

（B3）i）在序列編號1所示的氨基酸序列中缺失、置換或添加1個或多個氨基酸的氨基酸序列，并且ii）具有將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列、或

（B4）i）由與由序列編號2所示的核苷酸序列的互補序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交的多核苷酸編碼的氨基酸序列，并且ii）具有將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列；

第11項．在宿主細胞內可發揮功能的啟動子與前述第10項記載的多核苷酸以可發揮功能的形式連接而成的多核苷酸；

第12項．含有前述第10或11項記載的多核苷酸的重組載體（下文也稱為本發明重組載體(B)）；

第13項．將前述第10或11項記載的多核苷酸或前述第12項記載的重組載體導入宿主細胞而成的轉化體；

第14項．前述第13項記載的轉化體，其中宿主細胞是微生物或大腸桿菌；

第15項．保有前述第10或11項記載的多核苷酸的轉化體；

第16項．重組載體的制備方法，其包含在可在宿主細胞內復制的載體中摻入前述第10或11項記載的多核苷酸的步驟；

第17項．轉化體的制備方法，其包含將前述第10或11項記載的多核苷酸或前述第12項記載的重組載體導入宿主細胞的步驟；

第18項．含有前述第1至3項中任一項記載的多核苷酸和前述第10或11項記載的多核苷酸的重組載體（下文也稱為本發明重組載體(AB)）；

第19項．前述第18項記載的重組載體，進一步包含編碼具有將α-氧代羧酸化合物氨基化轉變成對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質的氨基酸序列的多核苷酸、或該多核苷酸與在宿主細胞內可發揮功能的啟動子以可發揮功能的形式連接而成的多核苷酸（下文也稱為本發明重組載體(ABC)）；

第20項．前述第19項記載的重組載體，其中具有將α-氧代羧酸化合物氨基化轉變成對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質是亮氨酸脫氫酶；

第21項．前述第19或20項記載的重組載體，其中具有將α-氧代羧酸化合物氨基化轉變成對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質的氨基酸序列是下述（C1）至（C3）中的任一氨基酸序列：

（C1）序列編號7所示的氨基酸序列、

（C2）i）與序列編號7所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列，并且ii）具有將α-氧代羧酸化合物氨基化轉變成對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質的氨基酸序列、或

（C3）i）在序列編號7所示的氨基酸序列中缺失、置換或添加1個或多個氨基酸的氨基酸序列，并且ii）具有將α-氧代羧酸化合物氨基化轉變成對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質的氨基酸序列；

第22項．將前述第18至21項中任一項記載的重組載體導入宿主細胞而成的轉化體；

第23項．前述第22項記載的轉化體，其中宿主細胞是微生物或大腸桿菌；

第24項．轉化體，其保有：

i）具有編碼具有將α-氧代羧酸化合物氨基化轉變成對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸，或該多核苷酸與在宿主細胞內可發揮功能的啟動子以可發揮功能的形式連接而成的多核苷酸；

ii）前述第1至3項中任一項記載的多核苷酸；和

iii）前述第10或11項記載的多核苷酸；

第25項．具有下述（A1）至（A5）中的任一氨基酸序列的蛋白質（下文也稱為本發明蛋白質(A)）：

（A1）序列編號3所示的氨基酸序列、

（A2）i）與序列編號3所示的氨基酸序列具有85％以上的序列同一性的氨基酸序列，并且ii）具有將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列、

（A3）i）在序列編號3所示的氨基酸序列中缺失、置換或添加1個或多個氨基酸的氨基酸序列，并且ii）具有將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列、

（A4）i）由與由序列編號4或13所示的核苷酸序列的互補序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交的多核苷酸編碼的氨基酸序列，并且ii）具有將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列、或

（A5）i）在序列編號3所示的氨基酸序列中，具有選自第109號的纈氨酸置換為異亮氨酸、第191號的甘氨酸置換為天冬氨酸和第246號的谷氨酰胺置換為精氨酸中的1個以上氨基酸置換的改變的(altered)氨基酸序列，并且ii）具有將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列；

第26項．具有下述（B1）至（B4）中的任一氨基酸序列的蛋白質（下文也稱為本發明蛋白質(B)）：

（B1）序列編號1所示的氨基酸序列、

（B2）i）與序列編號1所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的氨基酸序列，并且ii）具有將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列、

（B3）i）在序列編號1所示的氨基酸序列中缺失、置換或添加1個或多個氨基酸的氨基酸序列，并且ii）具有將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列、或

（B4）i）由與由序列編號2所示的核苷酸序列的互補序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交的多核苷酸編碼的氨基酸序列，并且ii）具有將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列；

第27項．L-α-氨基酸化合物的制備方法（下文也稱為本發明制備方法），其包含：

（1）使α-羥基羧酸化合物與具有下述（A1）至（A5）中任一氨基酸序列的蛋白質和具有下述（B1）至（B4）中的任一氨基酸序列的蛋白質中的任一或兩者作用，得到對應的α-氧代羧酸化合物的步驟：

（A1）序列編號3所示的氨基酸序列、

（A2）i）與序列編號3所示的氨基酸序列具有85％以上的序列同一性的氨基酸序列，并且ii）具有將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列、

（A3）i）在序列編號3所示的氨基酸序列中缺失、置換或添加1個或多個氨基酸的氨基酸序列，并且ii）具有將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列、

（A4）i）由與由序列編號4或13所示的核苷酸序列的互補序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交的多核苷酸編碼的氨基酸序列，并且ii）具有將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列、或

（A5）i）在序列編號3所示的氨基酸序列中，具有選自第109號的纈氨酸置換為異亮氨酸、第191號的甘氨酸置換為天冬氨酸和第246號的谷氨酰胺置換為精氨酸中的1個以上氨基酸置換的改變的(altered)氨基酸序列，并且ii）具有將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列；

（B1）序列編號1所示的氨基酸序列、

（B2）i）與序列編號1所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的氨基酸序列，并且ii）具有將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列、

（B3）i）在序列編號1所示的氨基酸序列中缺失、置換或添加1個或多個氨基酸的氨基酸序列，并且ii）具有將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列、或

（B4）i）由與由序列編號2所示的核苷酸序列的互補序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交的多核苷酸編碼的氨基酸序列，并且ii）具有將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力中的任一或兩者的蛋白質的氨基酸序列；

和

（2）使步驟（1）中得到的α-氧代羧酸化合物與具有將α-氧代羧酸化合物氨基化轉變成對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質作用，得到對應的L-α-氨基酸化合物的步驟；

第28項．前述第27項記載的制備方法，其中α-羥基羧酸化合物是含硫α-羥基羧酸化合物，對應的α-氧代羧酸化合物是含硫α-氧代羧酸化合物，對應的L-α-氨基酸化合物是含硫L-α-氨基酸化合物，步驟（1）中與α-羥基羧酸化合物作用的蛋白質是至少具有將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化轉變成對應的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白質；

第29項．前述第28項記載的制備方法，其中：

含硫α-羥基羧酸化合物是式（1）所示化合物：

上式中，R¹表示氫或可任選取代的碳原子數1-8的烷基；

含硫α-氧代羧酸化合物是式（2）所示化合物：

上式中，R¹表示與上述相同的含義；

含硫L-α-氨基酸化合物是式（3）所示化合物：

上式中，R¹表示與上述相同的含義；

第30項．前述第27項記載的制備方法，其中α-羥基羧酸化合物是α-羥基-異己酸，對應的α-氧代羧酸化合物是α-氧代-異己酸，對應的L-α-氨基酸化合物是L-亮氨酸，步驟（1）中與α-羥基羧酸化合物作用的蛋白質是至少具有將α-羥基-異己酸衍生物氧化轉變成對應的α-氧代-異己酸衍生物的能力的蛋白質；

第31項．前述第27至30項中任一項記載的制備方法，其中具有將α-氧代羧酸化合物氨基化轉變成對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質是亮氨酸脫氫酶；

第32項．前述第27至31項中任一項記載的制備方法，其中具有將α-氧代羧酸化合物氨基化轉變成對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質的氨基酸序列是下述（C1）至（C3）中的任一氨基酸序列：

（C1）序列編號7所示的氨基酸序列、

（C2）i）與序列編號7所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列，并且ii）具有將α-氧代羧酸化合物氨基化轉變成對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質的氨基酸序列、或

（C3）i）在序列編號7所示的氨基酸序列中缺失、置換或添加1個或多個氨基酸的氨基酸序列，并且ii）具有將α-氧代羧酸化合物氨基化轉變成對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質的氨基酸序列；

第33項．前述第27至32項中任一項記載的制備方法，其中以下列形式向反應體系提供步驟（1）中與α-羥基羧酸化合物作用的蛋白質，其包含在將編碼該蛋白質的多核苷酸導入宿主細胞而成的轉化體或其處理物中；

第34項．前述第33項記載的制備方法，其中前述轉化體是前述第5、6、7、13、14、15、22、23或24項中任一項記載的轉化體；

第35項．前述第27至34項中任一項記載的制備方法，其中以下列形式向反應體系提供具有將α-氧代羧酸化合物氨基化轉變成對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質，其包含在將編碼該蛋白質的多核苷酸導入宿主細胞而成的轉化體或其處理物中；

第36項．前述第35項記載的制備方法，其中前述轉化體是前述第22、23或24項中的任一項記載的轉化體；

第37項．前述第27至36項中任一項記載的制備方法，其中步驟（1）在具有將還原型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸或還原型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸轉變成氧化型的能力的蛋白質的存在下進行；

第38項．前述第37項記載的制備方法，其中具有將還原型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸或還原型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸轉變成氧化型的能力的蛋白質是進一步具有將α-氧代羧酸化合物氨基化轉變成對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質；

第39項．前述第37或38項記載的制備方法，其中以下列形式向反應體系提供具有將還原型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸或還原型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸轉變成氧化型的能力的蛋白質，其包含在將編碼該蛋白質的多核苷酸導入宿主細胞而成的轉化體或其處理物中；

第40項．前述第27至39項中任一項記載的制備方法，其中步驟（2）在具有將氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸或氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸轉變成還原型的能力的蛋白質的存在下進行；

第41項．前述第40項記載的制備方法，其中具有將氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸或氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸轉變成還原型的能力的蛋白質是進一步具有將α-羥基羧酸化合物氧化轉變成對應的α-氧代羧酸化合物的能力的蛋白質；

第42項．前述第40或41項記載的制備方法，其中以下列形式向反應體系提供具有將氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸或氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸轉變成還原型的能力的蛋白質，其包含在將編碼該蛋白質的多核苷酸導入宿主細胞而成的轉化體或其處理物中；和

第43項．前述第27至42項中任一項記載的制備方法，其中步驟（1）和步驟（2）在一個反應體系中進行；

等等。

發明的效果

通過本發明，可提供氧化酶，編碼該氧化酶的多核苷酸，及利用它們制備甲硫氨酸、亮氨酸等α-氨基酸化合物的方法等。

具體實施方式

本發明中，作為人為進行氨基酸的改性的手法，例如可以列舉對于編碼包含所要改性的氨基酸的氨基酸序列的多核苷酸，實施位點特異性突變引入，然后通過常規方法使該多核苷酸表達的手法。作為位點特異性突變引入法，例如可以列舉Olfert Landt等(Gene 96 125-128 1990)、Smith等(Genetic Engineering 3 1 Setlow，J.and Hollaender，A Plenum：New York)、Vlasuk等(基因表達的實驗操作，Inouye，M.：Academic Press，New York)、Hos.N.Hunt等(Gene 77 51 1989)等的方法、利用Mutan-Express Km(タカラバイオ社制)、TaKaRa La PCR in vitro Mutagenesis Kit(タカラバイオ社制)、QuickChange II Site-Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE社制)等的市售試劑盒的方法。

作為人為進行氨基酸的改性的手法，例如還可以列舉對于編碼包含所要改性的氨基酸的氨基酸序列的多核苷酸，實施隨機突變引入，然后通過常規方法使該多核苷酸表達的手法。在此，作為隨機引入突變的手法，例如可以列舉以下的方法：以編碼上述氨基酸序列的多核苷酸為模板，使用可擴增該多核苷酸的全長這樣的引物對，將用于基質的dATP、dTTP、dGTP、dCTP的各種添加濃度變得與通常不同的反應條件下、或者使促進聚合酶反應的Mg^2＋濃度比通常增加的反應條件下，進行PCR的方法等。作為這種PCR的手法，例如可以列舉在分子生物學方法, (31), 1994, 97-112中記載的方法。

“序列同源性”是指兩個氨基酸序列或堿基序列之間的同源性。對于上述“序列同源性”，在比較對象的序列的全部區域上，將以最適合的狀態進行比對的兩個序列比較，由此來確定。在此，在作為比較對象的氨基酸序列或堿基序列的最合適對比中，可以有插入或缺失(例如空位等)。這種序列同源性例如可以使用UWGCG Package提供的BESTFIT程序(Devereux et al(1984)Nucleic Acids Research 12， p387-395)、PILEUP、BLAST算法(Altschul S.F.(1993)J Mol Evol 36：290-300； Altschul S.F.(1990)J Mol Biol 215：403-10)等的序列分析用工具來計算得出。序列同源性還可以使用市售的序列分析軟件來求出。

本發明中，作為目標的多核苷酸的供給源的微生物可以由天然分離，還可以從菌株保藏機構購買而獲得。

作為這樣的可獲得微生物的菌株保藏機構，例如可以列舉下述的菌株保藏機構。

1. IFO(Institute of Fermentation Osaka：財團法人發酵研究所)保藏單位

現在已被轉移至獨立行政法人 制品評價技術基盤機構 生物遺傳資源部門(NBRC)管理。獲得微生物時，可以向NBRC申請購買，購買申請例如可以訪問NBRC的主頁。

2. ATCC(American Type Culture Collection)

可以通過住商ファーマインターナショナル株式會社 ATCC事業部門而獲得，在購買微生物時，例如可以訪問該部門的主頁。還可以直接從ATCC購買微生物。

3. JCM(理化學研究所微生物系統保存設施 (Japan Collection of Microorganisms, JCM)

現在已被移交至獨立行政法人理化學研究所バイオリソースセンター (RIKEN BRC) 微生物材料開發室管理。獲得微生物時，可以向該機構申請購買，例如可以訪問該機構的主頁的菌種保藏相關的位置。

4. IAM菌種保藏單位

現在，IAM菌種保藏的保存菌株中，對于細菌、酵母、絲狀菌，已移交至獨立行政法人 理化學研究所バイオリソースセンター微生物材料開發室(JCM)管理，對于微藻類，已移交至獨立行政法人 國立環境研究所微生物系統保存設施(NIES)管理。獲得微生物時，可以向這些機構申請購買，例如可以訪問這些機構的主頁的菌種保藏相關的位置。

作為為了克隆作為目標的多核苷酸、而向染色體DNA或DNA文庫雜交探針的方法，例如可以列舉菌落雜交、噬菌斑雜交，可以根據用于制作文庫的載體的種類來選擇方法。

所使用的文庫是使用質粒載體來制作的情況下，可以使用菌落雜交。具體而言，將文庫的DNA導入宿主微生物，由此獲得轉染子，將得到的轉染子稀釋后，將該稀釋物接種至瓊脂培養基上，進行培養直至出現菌落。

所使用的文庫是使用噬菌體載體來制作的情況下，可以使用噬菌斑雜交。具體而言，將宿主微生物和文庫的噬菌體在可感染的條件下混合，進一步與軟瓊脂培養基混合后，將該混合物接種至瓊脂培養基上，進行培養直至出現菌落。

上述任意的雜交的情況中，在進行上述培養的瓊脂培養基上放置膜片，將轉染子或噬菌體吸附·轉印至該膜片。將該膜片進行加堿處理后，進行中和處理，接著進行將DNA固定于該膜片的處理。更具體而言，例如，在噬菌斑雜交的情況下，在上述瓊脂培養基上防止硝基纖維素膜片或尼龍膜片(例如，Hybond-N+(GEヘルスケア社商標))，靜置約1分鐘，將噬菌體粒子吸附·轉印至膜片。接著，將該膜片浸漬于堿性溶液(例如，1.5M氯化鈉、0.5M氫氧化鈉)約3分鐘，使噬菌體粒子溶解，由此使噬菌體DNA從膜片上溶出，然后浸漬于中和溶液(例如，1.5M氯化鈉、0.5M Tris-鹽酸緩沖液pH7.5)約5分鐘。接著，將該膜片用洗滌液(例如，0.3M氯化鈉、30mM檸檬酸、0.2M Tris-鹽酸緩沖液pH7.5)洗滌約5分鐘后，例如在約80℃下加熱約90分鐘，由此將噬菌體DNA固定于膜片。

使用如此制備的膜片，進行探針的雜交。雜交例如可以按照J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著“分子克隆：實驗指南 第2版(1989) ”Cold Spring Harbor Laboratory Press等的記載來進行。

用于探針的DNA可以使利用放射性同位素標記的DNA，也可以是用熒光色素標記的DNA。

作為將用于探針的DNA利用放射性同位素進行標記的方法，例如可以列舉通過利用Random Primer DNA Labeling Kit(タカラバイオ社制)等，將PCR反應液中的dCTP替換為(α-³²P)dCTP，以用于探針的DNA為模板，進行PCR的方法。

用于探針的DNA利用熒光色素進行標記的情況下，例如可以使用ECL Direct Nucleic Acid Labeling and Detection System(GEヘルスケア社制)等。

雜交例如可以如下來進行。

對于含有450至900mM的氯化鈉和45至90mM的檸檬酸鈉、以0.1至1.0重量%的濃度含有十二烷基硫酸鈉(SDS)、以0至200μl/ml的濃度含有改性的非特異性DNA，根據情況，可以分別以0至0.2重量%的濃度含有白蛋白、Ficoll、聚乙烯吡咯烷酮等的預雜交液(優選含有900mM的氯化鈉、90mM的檸檬酸鈉、1.0重量%的SDS和100μl/ml的改性Calf-thymusDNA的預雜交液)，相對于如上制作的膜片每1cm²，以50至200μl的比例準備，將上述膜片浸入該預雜交液，在42至65℃下保溫1至4小時。

接著，對于例如含有450至900mM的氯化鈉和45至90mM的檸檬酸鈉、以0.1至1.0重量%的濃度含有SDS、以0至200μl/ml的濃度含有改性的非特異性DNA，根據情況，可以分別以0至0.2重量%的濃度含有白蛋白、Ficoll、聚乙烯吡咯烷酮等的雜交溶液(優選含有900mM的氯化鈉、90mM的檸檬酸鈉、1.0重量%的SDS和100μg/ml的改性Calf-thymusDNA的雜交溶液)，與用上述方法制備得到的探針(相對于膜片每1cm²為1.0×10⁴至2.0×10⁶cpm的量)混合，將得到的溶液相對于膜片每1cm²以50至200μl的比例而準備，浸入該雜交溶液，在42至65℃下保溫12至20小時。

在該雜交后，取出膜片，使用含有15至300mM的氯化鈉、1.5至30mM的檸檬酸鈉和0.1至1.0重量%的SDS等的42至65℃的洗滌液(優選為含有15mM的氯化鈉、1.5mM的檸檬酸鈉和1.0重量%的SDS的65℃的洗滌液)等進行洗滌。將洗滌后的膜片用2xSSC(300mM氯化鈉、30mM檸檬酸鈉)輕輕涮洗后，干燥。將該膜片供于例如自動射線照相法等，檢測膜片上的探針的位置，由此，在原瓊脂培養基上確定對應于與使用的探針雜交的DNA在膜片上的位置的克隆體，將其提取出來，由此分離具有該DNA的克隆體。

從將如此得到的克隆體培養而得的培養菌體，可以制備作為目標的多核苷酸。

為了使作為目標的多核苷酸在宿主細胞中表達，例如制備使在宿主細胞中可發揮作用的啟動子和上述多核苷酸以可發揮作用的形式連接而成的多核苷酸，將其導入宿主細胞。

在此，“以可發揮作用的形式連接”是指，將作為目標的多核苷酸導入宿主細胞，由此使宿主細胞轉化時，該多核苷酸以在啟動子的控制下進行表達的方式處于與啟動子結合的狀態。

作為在微生物中可發揮作用的啟動子，可以列舉大腸桿菌的乳糖操縱子的啟動子、大腸桿菌的色氨酸操縱子的啟動子或T7噬菌體的啟動子、或者tac啟動子、trc啟動子或T7lac啟動子等的在大腸桿菌內可發揮作用的的合成啟動子等。

將作為目標的多核苷酸、或者在宿主細胞中可發揮作用的啟動子與上述多核苷酸以可發揮作用的形式連接而成的多核苷酸導入載體，可以制作重組載體。作為所使用的載體，例如可以列舉包含在宿主細胞中可復制的遺傳信息，可自發增殖，可以從宿主細胞分離、純化，編碼可檢測的標記物的載體。作為宿主細胞為大腸桿菌的情況下可使用的載體，可以列舉pUC119(タカラバイオ社制)、pTV118N(タカラバイオ社制)、pBluescriptII 東洋紡社制)、pCR2.1-TOPO(Invitrogen社制)、pTrc99A(GEヘルスケア社制)、pKK223-3(GEヘルスケア社制)、pET-22b(ノバジェン社制)、pET-15b(ノバジェン社制)等。作為載體，若使用包含選擇標志基因 (例如、卡那霉素抗性基因、新霉素抗性基因等的抗生物質抗性賦予基因等)的載體，則導入了該載體的轉染子可以以該選擇標志基因的表達型等為指標進行選擇。

對于本發明中使用的轉染子，通過將作為目標的多核苷酸、在宿主細胞中可發揮作用的啟動子和上述多核苷酸以可發揮作用的形式連接而成的多核苷酸、或者含有這些多核苷酸的重組載體導入宿主細胞，由此可以制造。

作為宿主細胞，例如可以列屬于舉埃希氏菌屬(Escherichia屬)、芽孢桿菌屬(Bacillus屬)、棒桿菌屬(Corynebacterium屬)、葡萄球菌屬(Staphylococcus屬)、鏈霉菌屬(Streptomyces屬)、酵母屬(Saccharomyces屬)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces屬)、畢赤酵母屬(Pichia屬)、紅球菌屬(Rhodococcus屬)和曲霉屬(Aspergillus屬)的微生物等。

作為將多核苷酸或重組載體向宿主細胞導入的方法，可以根據所使用的宿主細胞適用通常使用的導入方法，例如可以列舉在“分子克隆：實驗指南 第2版”(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press、“分子生物學實驗室指南”(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等中記載的氯化鈣法、“電穿孔中的方法:基因脈沖源/大腸桿菌脈沖源系統” Bio-Rad Laboratories, (1993)等中記載的電穿孔法等。

導入了作為目標的多核苷酸或重組載體等的轉染子例如可以以上述載體所包含的選擇標志基因的表達型作為指標來進行選拔。

得到的轉染子保有作為目標的多核苷酸的情況例如按照“分子克隆：實驗指南 第2版”(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press等中記載的通常的方法，通過限制酶部位的確認、堿基序列的解析、Southern雜交、Western雜交等，可以確認。

作為本發明中所使用的用于培養轉染子的培養基，例如可以使用適當含有在微生物等的宿主細胞的培養中通常使用的碳源、氮源、有機鹽、無機鹽等的各種培養基。

作為碳源，例如可以列舉葡萄糖、糊精、蔗糖等的糖類、甘油等的糖醇、富馬酸、檸檬酸、丙酮酸等的有機酸、動物油、植物油和糖蜜。這些碳源在培養基中的添加量相對于培養液通常為0.1至30%(w/v)左右。

作為氮源，例如可以列舉肉浸膏、胨、酵母提取物、麥芽提取物、大豆粉、玉米漿(Corn Steep Liquor)、棉籽粉、干燥酵母、酪蛋白氨基酸等的天然有機氮源、氨基酸類、硝酸鈉等的無機酸的鈉鹽、氯化銨、硫酸銨、磷酸銨等的無機酸的銨鹽、富馬酸銨、檸檬酸銨等的有機酸的銨鹽和尿素。它們之中，有機酸的銨鹽、天然有機氮源、氨基酸類等在多數情況下也可以用作碳源。這些氮源在培養基中的添加量相對于培養液通常為0.1至30%(w/v)左右。

作為有機鹽、無機鹽，例如可以列舉鉀、鈉、鎂、鐵、錳、鈷、鋅等的氯化物、硫酸鹽、乙酸鹽、碳酸鹽和磷酸鹽。具體而言，例如可以列舉氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳、氯化鈷、硫酸鋅、硫酸銅、乙酸鈉、碳酸鈣、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀。這些有機鹽和/或無機鹽在培養基中的添加量相對于培養液通常為0.0001至5%(w/v)左右。

導入tac啟動子、trc啟動子、T7lac啟動子和lac啟動子等的由異乳糖誘導類型的啟動子和編碼作為目標的蛋白質的多核苷酸以可發揮作用的形式連接而成的多核苷酸而成的轉染子的情況下，作為用于誘導作為目標的蛋白質的生產的誘導劑，例如還可以在培養基中少量添加異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl thio-β-D-galactoside(IPTG))。在lacUV5啟動子的支配下加入了T7 RNA聚合酶基因的噬菌體DE3的溶原性細菌(λDE3 lysogen)中，導入T7噬菌體啟動子和編碼作為目標的蛋白質的多核苷酸以可發揮作用的形式連接而成的多核苷酸，在培養由此而成的轉染子的的情況下，作為用于誘導作為目標的蛋白質的生產的誘導劑，也可以在培養基中少量添加IPTG。

轉染子的培養可以按照微生物等的宿主細胞培養中通常使用的方法來進行，例如可以列舉試驗管振蕩式培養、往復式振蕩培養、小型密封式通風攪拌(Jar Fermenter)培養、培養罐培養等的液體培養和固體培養。

培養溫度可以在該轉染子可生長的范圍內適當變更，但通常約15℃至約40℃。培養基的pH優選為約6至約8的范圍。培養時間根據培養條件而異，但通常優選約1日至約5日。

作為從保有編碼作為目標的蛋白質的多核苷酸且生產該作為目標的蛋白質的轉染子、例如編碼作為目標的蛋白質的多核苷酸導入宿主細胞而成的轉染子的培養物純化作為目標的蛋白質的方法，可以適用在蛋白質的純化中使用的通常的方法，例如，可以列舉以下的方法。

通過離心分離等從轉染子的培養物收集細胞后，對其進行超聲波處理、臥式砂磨機(DYNO-mill)處理、法式濾壓壺處理等的物理性破碎方法，或者使用表面活性劑或溶菌酶(リゾチーム)等的溶菌酶的化學性破碎方法等，由此進行破碎。通過離心分離、膜片過濾器過濾等從得到的破碎液除去雜質，由此制備無細胞提取液，適當使用陽離子交換色譜法、陰離子交換色譜法、疏水色譜法、凝膠過濾色譜法、金屬螯合物色譜法、親和色譜法等的分離純化方法，將其分級，由此可以純化作為目標的蛋白質。

作為色譜法中使用的載體，例如可以列舉導入了羧甲基(CM)、二乙基氨基乙基(DEAE)、苯基或丁基的纖維素、糊精或瓊脂糖等的不溶性高分子載體。還可以使用市售的已填充了載體的柱子，作為所述市售的已填充了載體的柱子，例如可以列舉Q-Sepharose FF、Phenyl-Sepharose HP(商品名、都是GEヘルスケア社制)、TSK-gel G3000SW(商品名、東ソー社制)等。

作為目標的蛋白質是在其氨基末端或羧基末端區域上添加有數個殘基的組氨酸的蛋白質的情況下，可以使用金屬螯合物親和柱，對該蛋白質進行純化。作為目標的蛋白質是以與谷胱甘肽S-轉移酶融合的蛋白質的形式產生的情況下，可以使用谷胱甘肽S-轉移酶單克隆抗體柱，對其進行純化。

作為本發明中使用的“轉染子的處理物”，例如可以列舉凍干轉染子、有機溶劑處理轉染子、干燥轉染子、轉染子磨碎物、轉染子自體消化物、轉染子的超聲波處理物、轉染子抽提物、轉染子的堿處理物。作為轉染子抽提物，可以列舉無細胞抽提液、從轉染子制備的粗純化蛋白質或純化蛋白質、以及它們的固定化物。作為得到固定化物的方法，例如可以列舉載體結合法(使作為目標的蛋白質等吸附于硅膠、陶瓷等的無機載體、纖維素、或者離子交換樹脂等的方法)和統括法(在聚丙烯酰胺、含硫多糖凝膠(例如角叉菜膠凝膠)、藻酸凝膠或者瓊脂凝膠等的高分子的網孔結構中封閉作為目標的蛋白質等的方法)。

若考慮到使用轉染子的工業生產，從制造設備的限制少的觀點考慮，與使用活轉染子相比，使用將該轉染子滅活而得的處理物更加優選。作為轉染子的滅活處理方法，例如可以列舉物理殺菌法(加熱、干燥、冷凍、光線、超聲波、過濾、通電)、使用化學藥品的的殺菌法(堿、酸、鹵素、氧化劑、硫、硼、砷、金屬、醇、苯酚、胺、硫化物、醚、醛、酮、氰和抗生物質)。一般地，這些殺菌法中，理想的是選擇盡可能地使作為目標的蛋白質的酶活性失活、且在反應體系中殘留、造成污染等的影響小的處理方法。

本發明的多核苷酸(A)編碼下述(A1)至(A5)的任一者的氨基酸序列：

(A1) 序列編號3所示的氨基酸序列、

(A2) i) 相對于序列編號3所示的氨基酸序列具有85%以上的序列同源性的氨基酸序列，且ii) 具有將2-羥基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化、變為對應的2-氧代基-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化、變為對應的α-氧代基-異己酸衍生物的能力的任一者或兩者的蛋白質的氨基酸序列、

(A3) i) 在序列編號3所示的氨基酸序列中缺失、置換或添加1個或多個氨基酸而得的氨基酸序列，且ii) 具有將2-羥基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化、變為對應的2-氧代基-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化、變為對應的α-氧代基-異己酸衍生物的能力的任一者或兩者的蛋白質的氨基酸序列、

(A4) i) 包括序列編號4或13所示的堿基序列的互補序列的多核苷酸和在嚴苛的條件下進行雜交的多核苷酸所編碼的氨基酸序列，且ii) 具有將2-羥基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化、變為對應的2-氧代基-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化、變為對應的α-氧代基-異己酸衍生物的能力的任一者或兩者的蛋白質的氨基酸序列、或者

(A5) i) 在序列編號3所示的氨基酸序列中，具有選自109位的纈氨酸置換為異亮氨酸、191位的甘氨酸置換為天冬氨酸以及246位的谷氨酰胺置換為精氨酸中的1種以上的氨基酸置換的改變(altered)的氨基酸序列，且ii) 具有將2-羥基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化、變為對應的2-氧代基-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化、變為對應的α-氧代基-異己酸衍生物的能力的任一者或兩者的蛋白質的氨基酸序列。

本發明的蛋白質(A)具有上述(A1)至(A5)的任一項的氨基酸序列。

本發明的多核苷酸(A)所編碼的氨基酸序列或本發明的蛋白質(A)的氨基酸序列中，與序列編號3所示的氨基酸序列之間所發現不同在于，一部分的氨基酸的缺失、置換或添加等(以下，有時也統稱為氨基酸的改變)。上述“添加”中，不僅有對序列末端的氨基酸的添加，而且還包括對序列中的氨基酸的插入。作為所述氨基酸的改變，例如可以列舉(a) 具有序列編號3所示的氨基酸序列的蛋白質在細胞內受到的加工而導致的缺失；(b)由于得到上述蛋白質的生物的種間差異、個體差異等，天然產生的基因變異而導致產生的氨基酸的缺失、置換或添加；或者(c)人為導入的基因變異等而產生的氨基酸的缺失、置換或添加。

對于所改變的氨基酸的數目，只要是在以下范圍內的數目即可：具有發生改變的上述氨基酸序列的蛋白質可以發揮與改變前的蛋白質相同的能力、即將2-羥基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化、變為對應的2-氧代基-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化、變為對應的α-氧代基-異己酸衍生物的能力的任一者或兩者。

作為本發明的多核苷酸(A)所編碼的氨基酸序列的(A3)或本發明的蛋白質(A)的氨基酸序列的(A3)中的“多個氨基酸”，例如可以列舉2、3、4、5、6、7、10、15、20、25、30、35、40、45或48個氨基酸。

作為氨基酸的置換，例如可以列舉保守性置換為在疏水性、電荷、pK、立體結構上的特征等類似的氨基酸。作為這種置換，具體的而言，例如可以列舉(1)甘氨酸、丙氨酸；(2)纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；(3)天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、(4)絲氨酸、蘇氨酸；(5)賴氨酸、精氨酸；(6)苯丙氨酸、酪氨酸等的在組內的置換。

作為氨基酸的添加，例如可以列舉對于蛋白質的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端添加包含連續6個左右殘基的組氨酸的7個左右殘基至25個左右殘基的氨基酸。更具體而言，可以列舉對于蛋白質的氨基酸序列的氨基末端添加序列編號44所示的氨基酸序列、對于蛋白質的氨基酸序列的羧基末端添加序列編號45所示的氨基酸序列。

本發明的多核苷酸(A)所編碼的氨基酸序列的(A2)或本發明的蛋白質(A)的氨基酸序列的(A2)中，作為“85%以上的序列同源性”，例如可以列舉85、90、95、98或99%以上的序列同源性。

本發明的多核苷酸(A) 所編碼的氨基酸序列或本發明的蛋白質(A)的氨基酸序列中，“包括序列編號4或13所示的堿基序列的互補序列的多核苷酸和在嚴苛的條件下進行雜交的多核苷酸”是指，例如在“克隆和序列”(渡辺格監修、杉浦昌弘編集、1989年、農村文化社發行)等中記載的Southern雜交法中，(1)在高離子濃度下[例如可以列舉6XSSC(900mM的氯化鈉、90mM的檸檬酸鈉)]，在65℃下進行雜交，由此與包括序列編號4或13所示的堿基序列的互補序列的多核苷酸通過堿基配對形成雜種，(2)在低離子濃度下[例如可以列舉0.1 X SSC(15mM的氯化鈉、1.5mM的檸檬酸鈉)]，在65℃下保溫30分鐘后也可以維持該雜種的多核苷酸。

作為上述的多核苷酸，具體的而言，可以列舉具有序列編號4或13所示的堿基序列的多核苷酸；在序列編號4或13所示的堿基序列中，具有其一部分堿基發生缺失、置換或添加的堿基序列的多核苷酸；或者具有與序列編號4或13所示的堿基序列具有90%、95%、98%或99%以上的序列同源性的堿基序列的多核苷酸。

本發明的多核苷酸(A)所編碼的氨基酸序列的(A5)或者本發明的蛋白質(A)的氨基酸序列的(A5)的具體例列舉如下：

(A5-1) i)在序列編號3所示的氨基酸序列中，109位的纈氨酸置換為異亮氨酸的改變的(altered)氨基酸序列，且ii)具有將2-羥基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化、變為對應的2-氧代基-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化、變為對應的α-氧代基-異己酸衍生物的能力的任一者或兩者的蛋白質的氨基酸序列(以下，有時也稱為改變氨基酸序列V109I)；

(A5-2) i)在序列編號3所示的氨基酸序列中，191位的甘氨酸置換為天冬氨酸的改變的(altered)氨基酸序列，且ii)具有將2-羥基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化、變為對應的2-氧代基-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化、變為對應的α-氧代基-異己酸衍生物的能力的任一者或兩者的蛋白質的氨基酸序列(以下，有時也稱為改變氨基酸序列G191D)；

(A5-3) i) 在序列編號3所示的氨基酸序列中，246位的谷氨酰胺置換為精氨酸的改變的(altered)氨基酸序列，且ii)具有將2-羥基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化、變為對應的2-氧代基-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化、變為對應的α-氧代基-異己酸衍生物的能力的任一者或兩者的蛋白質的氨基酸序列(以下，有時也稱為改變氨基酸序列Q246R)；

(A5-4) i) 在序列編號3所示的氨基酸序列中，109位的纈氨酸置換為異亮氨酸以及191位的甘氨酸置換為天冬氨酸的改變的(altered)氨基酸序列，且ii)具有將2-羥基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化、變為對應的2-氧代基-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化、變為對應的α-氧代基-異己酸衍生物的能力的任一者或兩者的蛋白質的氨基酸序列(以下，有時也稱為改變氨基酸序列V109I/G191D)；

(A5-5) i) 在序列編號3所示的氨基酸序列中，109位的纈氨酸置換為異亮氨酸以及246位的谷氨酰胺置換為精氨酸的改變的(altered)氨基酸序列，且ii)具有將2-羥基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化、變為對應的2-氧代基-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化、變為對應的α-氧代基-異己酸衍生物的能力的任一者或兩者的蛋白質的氨基酸序列(以下，有時也稱為改變氨基酸序列V109I/Q246R)；

(A5-6) i) 在序列編號3所示的氨基酸序列中，191位的甘氨酸置換為天冬氨酸以及246位的谷氨酰胺置換為精氨酸的改變的(altered)氨基酸序列，且ii)具有將2-羥基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化、變為對應的2-氧代基-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化、變為對應的α-氧代基-異己酸衍生物的能力的任一者或兩者的蛋白質的氨基酸序列(以下，有時也稱為改變氨基酸序列G191D/Q246R)；和

(A5-7) i) 在序列編號3所示的氨基酸序列中，109位的纈氨酸置換為異亮氨酸、191位的甘氨酸置換為天冬氨酸以及246位的谷氨酰胺置換為精氨酸改變的(altered)氨基酸序列，且ii)具有將2-羥基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化、變為對應的2-氧代基-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化、變為對應的α-氧代基-異己酸衍生物的能力的任一者或兩者的蛋白質的氨基酸序列(以下，有時也稱為改變氨基酸序列V109I/G191D/Q246R)。

作為改變氨基酸序列V109I/G191D/Q246R的具體例，可以列舉序列編號5所示的氨基酸序列。作為編碼序列編號5所示的氨基酸序列的堿基序列，可以列舉序列編號6所示的堿基序列。

本發明的多核苷酸(A)可以是從自然界存在的DNA中克隆得到的多核苷酸，也可以是在該克隆得到的多核苷酸的堿基序列中，人為導入其一部分堿基發生缺失、置換或添加而成的多核苷酸，也可以是化學合成而得的多核苷酸。

本發明的多核苷酸(A)例如可以從具有將α-羥基羧酸氧化為對應的α-氧代基羧酸的能力的微生物、具體的而言反硝化無色桿菌(Achromobacter denitrificans)ATCC55564株等的屬于無色桿菌屬的微生物而得到。

例如，從反硝化無色桿菌(Achromobacter denitrificans)等屬于無色桿菌屬的微生物等按照通常的基因工程方法(例如，“新細胞工程實驗手則”(東京大學醫科學研究所制癌研究部編、秀潤社、1993年)中記載的方法)制備DNA文庫，以制備的DNA文庫作為模板，且使用適當的引物，進行PCR，由此擴增編碼序列編號3所示的氨基酸序列的多核苷酸、編碼序列編號3所示的氨基酸序列中1個或多個氨基酸發生缺失、置換或添加而得的氨基酸序列的多核苷酸、或者具有序列編號4所示的堿基序列的多核苷酸等，可以制備本發明的多核苷酸(A)。

上述PCR中使用的引物的5’末端側或3’末端側或者兩個末端可以添加限制酶識別序列等。

例如，以上述DNA文庫為模板，且在引物中使用具有序列編號11所示的堿基序列的寡核苷酸和具有序列編號12所示的堿基序列的寡核苷酸，進行PCR，由此擴增包括序列編號4所示的堿基序列的多核苷酸。

作為上述PCR的條件，例如可以列舉以下條件：將混合了4種dNTP各20μM、2種寡核苷酸引物各15pmol、Taqpolymerase 1.3U以及作為模板的DNA文庫的反應液在94℃下保溫2分鐘后，進行10次在94℃下10秒鐘、在65℃下30秒鐘、在72℃下90秒鐘的保溫循環，接著，進行20次在94℃下10秒鐘、65℃下30秒鐘、72℃下1分鐘和5秒鐘的保溫循環，進一步在72℃下保持7分鐘。

具有選自以上述DNA文庫作為模板、編碼序列編號3所示的氨基酸序列的堿基序列的部分堿基序列的寡核苷酸(例如、包含編碼序列編號3所示的氨基酸序列的堿基序列的5’末端的約14個以上堿基的堿基序列的寡核苷酸)和包含用于DNA文庫構建的載體的與DNA插入部位附近的堿基序列互補的堿基序列的約14個以上堿基的寡核苷酸作為引物來使用，進行PCR，由此也可以擴增具有編碼序列編號3所示的氨基酸序列的堿基序列的多核苷酸、具有編碼序列編號3所示的氨基酸序列中1個或多個氨基酸發生缺失、置換或添加而得的氨基酸序列的堿基序列的多核苷酸等，可以制備本發明的多核苷酸(A)。

對于本發明的多核苷酸(A)，例如在來自微生物或噬菌體的載體中插入的DNA文庫中，包含具有選自編碼序列編號3所示的氨基酸序列的堿基序列的部分堿基序列的約15個以上堿基的堿基序列的DNA作為探針，在上述條件下進行雜交，檢測該探針特異性結合的DNA，由此也可以獲得。

對于本發明的多核苷酸(A)，基于其堿基序列，例如按照亞磷酸三酯法(Hunkapiller, M.et al., Nature, 310, 105, 1984)等通常的方法，化學合成具有作為目標的堿基序列的核酸，由此也可以制備。

作為編碼上述(A1)至(A5)的任一者的氨基酸序列的密碼子，以符合大腸桿菌中的密碼子使用頻率的方式選擇密碼子，由此設計堿基序列，化學合成包含設計的堿基序列的多核苷酸，由此也可以制備本發明的多核苷酸(A)。

具體而言，例如以與所要表達的微生物細胞(例如、大腸桿菌)中的密碼子使用頻率相接近的密碼子使用頻率的方式，選擇序列編號3所示的氨基酸序列所包含的各氨基酸對應的密碼子，設計編碼作為目標的氨基酸序列的堿基序列。大腸桿菌等中的密碼子使用頻率的信息例如可以利用本領域技術人員公知的DNA數據庫(GenBank、EMBL、DDBJ等)而獲得。

以下，示出具體的順序。

求出作為目標的氨基酸序列所包含的各氨基酸的個數。以最接近表達多核苷酸的微生物細胞的密碼子的平均出現頻率的方式，對于上述求出的個數的氨基酸，按比例分配使用的密碼子。為了盡可能使同一密碼子不連續，編定各密碼子的使用順序。從N末端側的氨基酸開始依次對于各氨基酸確定的順序，選擇密碼子，暫時確定該氨基酸殘基的密碼子。重復這些順序，暫時確定直至C末端的全部氨基酸的密碼子，最后配置終止密碼子。對于包括暫時確定的密碼子的堿基序列，確認不存在在微生物細胞中阻礙基因轉錄的堿基序列、識別此后的操作中使用的限制酶的堿基序列。存在這種堿基序列的情況下，將該堿基序列涉及的密碼子交換為在其他部分使用的密碼子。在這種堿基序列設計時，為了后續的操作，優選預先在5’末端側和3’末端側添加識別適當的限制酶的堿基序列。

具有這樣設計的堿基序列的多核苷酸的合成中，可以使用利用PCR的長鏈DNA合成法(細胞工程學分冊、植物細胞工程學系列7“植物的PCR實驗手則”、95-100頁、島本巧?佐々木卓治監修秀潤社、1997年7月1日發行)(以下，有時也將本法稱為組裝PCR法(Assembly PCR法))。該方法中，僅使用長的合成寡核苷酸引物來合成DNA。引物對以引物的各3’末端具有約10bp至約12bp的互補鏈或重疊的方式來合成，以彼此的引物為模板，進行DNA合成。作為引物的全長，例如可以列舉約60mer至約100mer等。優選的是，例如可以列舉約80mer至約100mer等。

通過PCR反應依次將這些寡核苷酸引物結合，由此得到具有目標堿基序列的DNA。將所得的DNA按照常規方法導入克隆載體，進行克隆。將得到的克隆體的堿基序列用DNA測序法進行，確認得到具有目標堿基序列的多核苷酸。由此，例如可以人工合成具有序列編號13所示的堿基序列的多核苷酸，可以得到本發明的多核苷酸(A)。

本發明的多核苷酸(B)編碼下述(B1)至(B4)任一者的氨基酸序列：

(B1) 序列編號1所示的氨基酸序列，

(B2) i)相對于序列編號1所示的氨基酸序列具有95%以上的序列同源性的氨基酸序列，且ii)具有將2-羥基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化、變為對應的2-氧代基-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化、變為對應的α-氧代基-異己酸衍生物的能力的任一者或兩者的蛋白質的氨基酸序列，

(B3) i)在序列編號1所示的氨基酸序列中1個或多個氨基酸發生缺失、置換或添加而得的氨基酸序列，且ii)具有將2-羥基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化、變為對應的2-氧代基-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化、變為對應的α-氧代基-異己酸衍生物的能力的任一者或兩者的蛋白質的氨基酸序列，或

(B4) i) 包括序列編號2所示的堿基序列的互補序列的多核苷酸和在嚴苛的條件下進行雜交的多核苷酸所編碼的氨基酸序列，且ii)具有將2-羥基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化、變為對應的2-氧代基-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化、變為對應的α-氧代基-異己酸衍生物的能力的任一者或兩者的蛋白質的氨基酸序列。

本發明的蛋白質(B)具有上述(B1)至(B4)任一者的氨基酸序列。

本發明的多核苷酸(B)編碼的氨基酸序列或本發明的蛋白質(B)的氨基酸序列中，與序列編號1所示的氨基酸序列之間所發現不同在于，一部分的氨基酸的缺失、置換或添加等(以下，有時也統稱為氨基酸的改變)。上述“添加”中，不僅有對序列末端的氨基酸的添加，而且還包括對序列中的氨基酸的插入。作為所述氨基酸的改變，例如可以列舉(a) 具有序列編號1所示的氨基酸序列的蛋白質在細胞內受到的加工而導致的缺失；(b)由于得到上述蛋白質的生物的種間差異、個體差異等，天然產生的基因變異而導致產生的氨基酸的缺失、置換或添加；或者(c)人為導入的基因變異等而產生的氨基酸的缺失、置換或添加。

對于所改變的氨基酸的數目，只要是在以下范圍內的數目即可：具有發生改變的上述氨基酸序列的蛋白質可以發揮與改變前的蛋白質相同的能力、即將2-羥基-4-(甲硫基)丁酸衍生物氧化、變為對應的2-氧代基-4-(甲硫基)丁酸衍生物的能力和將α-羥基-異己酸衍生物氧化、變為對應的α-氧代基-異己酸衍生物的能力的任一者或兩者。

作為本發明的多核苷酸(B)所編碼的氨基酸序列的(B3)或本發明的蛋白質(B)的氨基酸序列的(B3)中的“多個氨基酸”，例如可以列舉2、3、4、5、6、7、8、10、12、15或17個氨基酸。

作為氨基酸的置換，例如可以列舉保守性置換為在疏水性、電荷、pK、立體結構上的特征等類似的氨基酸。作為這種置換，具體的而言，例如可以列舉(1)甘氨酸、丙氨酸；(2)纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；(3)天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、(4)絲氨酸、蘇氨酸；(5)賴氨酸、精氨酸；(6)苯丙氨酸、酪氨酸等的在組內的置換。

作為氨基酸的添加，例如可以列舉對于蛋白質的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端添加包含連續6個左右殘基的組氨酸的7個左右殘基至25個左右殘基的氨基酸。更具體而言，可以列舉對于蛋白質的氨基酸序列的氨基末端添加序列編號44所示的氨基酸序列、對于蛋白質的氨基酸序列的羧基末端添加序列編號45所示的氨基酸序列。

本發明的多核苷酸(B)所編碼的氨基酸序列的(B2)或本發明的蛋白質(B)的氨基酸序列的(B2)中，作為“95%以上的序列同源性”，例如可以列舉95、98或99%以上的序列同源性。

本發明的多核苷酸(B)所編碼的氨基酸序列或本發明的蛋白質(B)的氨基酸序列中，“包括序列編號2所示的堿基序列的互補序列的多核苷酸和在嚴苛的條件下進行雜交的多核苷酸”是指，例如在“克隆和序列”(渡辺格監修、杉浦昌弘編集、1989年、農村文化社發行)等中記載的Southern雜交法中，(1)在高離子濃度下[例如可以列舉6XSSC(900mM的氯化鈉、90mM的檸檬酸鈉)]，在65℃下進行雜交，由此與包括序列編號2所示的堿基序列的互補序列的多核苷酸通過堿基配對形成雜種，(2)在低離子濃度下[例如可以列舉0.1 X SSC(15mM的氯化鈉、1.5mM的檸檬酸鈉)]，在65℃下保溫30分鐘后也可以維持該雜種的多核苷酸。

作為上述的多核苷酸，具體的而言，可以列舉具有序列編號2所示的堿基序列的多核苷酸；在序列編號2所示的堿基序列中，具有其一部分堿基發生缺失、置換或添加的堿基序列的多核苷酸；或者具有與序列編號2所示的堿基序列具有95%、98%或99%以上的序列同源性的堿基序列的多核苷酸。

本發明的多核苷酸(B)可以是從自然界存在的DNA中克隆得到的多核苷酸，也可以是在該克隆得到的多核苷酸的堿基序列中，人為導入其一部分堿基發生缺失、置換或添加而成的多核苷酸，也可以是化學合成而得的多核苷酸。

本發明的多核苷酸(B)例如可以從具有將α-羥基羧酸氧化為對應的α-氧代基羧酸的能力的微生物、具體的而言反硝化無色桿菌(Achromobacter denitrificans)ATCC55564株等的屬于無色桿菌屬的微生物而得到。

例如，從反硝化無色桿菌(Achromobacter denitrificans)等屬于無色桿菌屬的微生物等按照通常的基因工程方法(例如，“新細胞工程實驗手則”(東京大學醫科學研究所制癌研究部編、秀潤社、1993年)中記載的方法)制備DNA文庫，以制備的DNA文庫作為模板，且使用適當的引物，進行PCR，由此擴增編碼序列編號1所示的氨基酸序列的多核苷酸、編碼序列編號1所示的氨基酸序列中1個或多個氨基酸發生缺失、置換或添加而得的氨基酸序列的多核苷酸、或者具有序列編號2所示的堿基序列的多核苷酸等，可以制備本發明的多核苷酸(A)。

上述PCR中使用的引物的5’末端側或3’末端側或者兩個末端可以添加限制酶識別序列等。

例如，以上述DNA文庫為模板，且在引物中使用具有序列編號9所示的堿基序列的寡核苷酸和具有序列編號10所示的堿基序列的寡核苷酸，進行PCR，由此擴增包括序列編號2所示的堿基序列的多核苷酸。

作為上述PCR的條件，例如可以列舉以下條件：將混合了4種dNTP各20μM、2種寡核苷酸引物各15pmol、Taqpolymerase 1.3U以及作為模板的DNA文庫的反應液在94℃下保溫2分鐘后，進行10次在94℃下10秒鐘、在65℃下30秒鐘、在72℃下90秒鐘的保溫循環，接著，進行20次在94℃下10秒鐘、65℃下30秒鐘、72℃下1分鐘和5秒鐘的保溫循環，進一步在72℃下保持7分鐘。

具有選自以上述DNA文庫作為模板、編碼序列編號1所示的氨基酸序列的堿基序列的部分堿基序列的寡核苷酸(例如、包含編碼序列編號1所示的氨基酸序列的堿基序列的5’末端的約14個以上堿基的堿基序列的寡核苷酸)和包含用于DNA文庫構建的載體的與DNA插入部位附近的堿基序列互補的堿基序列的約14個以上堿基的寡核苷酸作為引物來使用，進行PCR，由此也可以擴增具有編碼序列編號1所示的氨基酸序列的堿基序列的多核苷酸、具有編碼序列編號1所示的氨基酸序列中1個或多個氨基酸發生缺失、置換或添加而得的氨基酸序列的堿基序列的多核苷酸等，可以制備本發明的多核苷酸(B)。

對于本發明的多核苷酸(B)，例如在來自微生物或噬菌體的載體中插入的DNA文庫中，包含具有選自編碼序列編號1所示的氨基酸序列的堿基序列的部分堿基序列的約15個以上堿基的堿基序列的DNA作為探針，在上述條件下進行雜交，檢測該探針特異性結合的DNA，由此也可以獲得。

對于本發明的多核苷酸(B)，基于其堿基序列，例如按照亞磷酸三酯法(Hunkapiller, M.et al., Nature, 310, 105, 1984)等通常的方法，化學合成具有作為目標的堿基序列的核酸，由此也可以制備。

作為編碼上述(B1)至(B4)的任一者的氨基酸序列的密碼子，以符合大腸桿菌中的密碼子使用頻率的方式選擇密碼子，由此設計堿基序列，化學合成包含設計的堿基序列的多核苷酸，由此也可以制備本發明的多核苷酸(B)。

具體而言，例如以與所要表達的微生物細胞(例如、大腸桿菌)中的密碼子使用頻率相接近的密碼子使用頻率的方式，選擇序列編號1所示的氨基酸序列所包含的各氨基酸對應的密碼子，設計編碼作為目標的氨基酸序列的堿基序列。

如上所述制備的多核苷酸可以按照“分子克隆：實驗指南 第2版”(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press、“分子生物學實驗室指南”(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等中記載的方法克隆至載體。

如上制備的多核苷酸的堿基序列可以根據F.Sanger, S.Nicklen, A.R.Coulson著、美國國家科學院院刊(1977) 74: 5463-5467頁等記載的雙脫氧終止法等進行分析。在堿基序列分析用的試劑制備中，例如可以使用パーキンエルマー社的ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit等的市售的試劑。

對于如上制備的多核苷酸編碼具有將α-羥基羧酸(例如、2-羥基-4-(甲硫基)丁酸或α-羥基-異己酸)氧化、變為對應的α-氧代基羧酸(例如、2-氧代基-4-(甲硫基)丁酸或α-氧代基-異己酸)的能力的蛋白質的氨基酸序列的確認，例如可以如下進行。

將如上得到的多核苷酸以連接至在宿主細胞中可發揮作用的啟動子的下游的方式插入到載體中，將得到的重組載體導入宿主細胞，取得轉染子。使得到的轉染子的培養物作用于α-羥基羧酸(例如、2-羥基-4-(甲硫基)丁酸或α-羥基-異己酸)。通過分析反應產物中的對應的α-氧代基羧酸(例如、2-氧代基-4-(甲硫基)丁酸或α-氧代基-異己酸)的量，可以確認得到的多核苷酸編碼具有目標能力的蛋白質的氨基酸序列。

為了使本發明的多核苷酸(A)或本發明的多核苷酸(B)在宿主細胞中表達，例如制備在宿主細胞中可發揮作用的啟動子和本發明的多核苷酸(A)或本發明的多核苷酸(B)以可發揮作用的形式連接而成的多核苷酸，將其導入宿主細胞。

作為在微生物中可發揮用做的啟動子，可以列舉上述的在大腸桿菌內可發揮作用的合成啟動子等。在反硝化無色桿菌中，可以利用控制本發明的多核苷酸(A)或本發明的多核苷酸(B)的表達的啟動子。

將本發明的多核苷酸(A)、或者在宿主細胞中能夠發揮功能的啟動子與本發明的多核苷酸(A)以能夠發揮功能的形式連接而成的多核苷酸整合在載體中，由此可以制作本發明重組載體(A)。

將本發明的多核苷酸(B)、或者在宿主細胞中能夠發揮功能的啟動子與本發明的多核苷酸(B)以能夠發揮功能的形式連接而成的多核苷酸整合在載體中，由此可以制作本發明重組載體(B)。

將

i)本發明的多核苷酸(A)、或者在宿主細胞中能夠發揮功能的啟動子與本發明的多核苷酸(A)以能夠發揮功能的形式連接而成的多核苷酸；和

ii)本發明的多核苷酸(B)、或者在宿主細胞中能夠發揮功能的啟動子與本發明的多核苷酸(B)以能夠發揮功能的形式連接而成的多核苷酸；

整合在載體中，由此可以制作本發明重組載體(AB)。

本發明重組載體(AB)還可以包含對下述蛋白質(以下，有時記為本蛋白質(C))的氨基酸序列進行編碼的多核苷酸，所述蛋白質具有將α-氧代羧酸化合物氨基化從而轉化為對應的L-α-氨基酸化合物的能力，或者，所述重組載體(AB)還可以包含該多核苷酸與在宿主細胞內能夠發揮功能的啟動子以能夠發揮功能的形式連接而成的多核苷酸。

例如，將

a)本發明的多核苷酸(A)、或者在宿主細胞中能夠發揮功能的啟動子與本發明的多核苷酸(A)以能夠發揮功能的形式連接而成的多核苷酸；和

b)本發明的多核苷酸(B)、或者在宿主細胞中能夠發揮功能的啟動子與本發明的多核苷酸(B)以能夠發揮功能的形式連接而成的多核苷酸；

以及

c)對本蛋白質(C)的氨基酸序列進行編碼的多核苷酸、或者該多核苷酸與在宿主細胞內能夠發揮功能的啟動子以能夠發揮功能的形式連接而成的多核苷酸；

整合在載體中，由此可以制作本發明重組載體(ABC)。

作為具有將α-氧代羧酸化合物氨基化從而轉化為對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質，可以舉出例如氨基酸脫氫酶、氨基轉移酶。作為氨基酸脫氫酶，具體而言，可以舉出丙氨酸脫氫酶、谷氨酸脫氫酶、亮氨酸脫氫酶和苯丙氨酸脫氫酶，可以優選地舉出亮氨酸脫氫酶。

具有將α-氧代羧酸化合物氨基化從而轉化為對應的L-α-氨基酸化合物的能力的上述蛋白質，更具體而言，可以舉出Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic 23 (2003) 239-247所記載的源自球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus) IFO3525株的亮氨酸脫氫酶、和具有在前述亮氨酸脫氫酶的氨基酸序列中第113號的丙氨酸被轉化為甘氨酸而得到的氨基酸序列的蛋白質。

序列編號42所示的氨基酸序列是Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic 23 (2003) 239-247所記載的源自球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus) IFO3525株的亮氨酸脫氫酶的氨基酸序列。

序列編號7所示的氨基酸序列是在序列編號42所示的氨基酸序列中第113號的丙氨酸被轉化為甘氨酸而得到的氨基酸序列。

作為具有將α-氧代羧酸化合物氨基化從而轉化為對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質的氨基酸序列，具體而言，還可以舉出下述(C1)至(C3)中的任一氨基酸序列：

(C1)序列編號7所示的氨基酸序列；

(C2)下述蛋白質的氨基酸序列，i)其為相對于序列編號7所示的氨基酸序列而言具有90%以上的序列一致性的氨基酸序列，并且ii)所述蛋白質具有將α-氧代羧酸化合物氨基化從而轉化為對應的L-α-氨基酸化合物的能力；

(C3)下述蛋白質的氨基酸序列，i)其為序列編號7所示的氨基酸序列中一個或者多個氨基酸缺失、取代或添加而得到的氨基酸序列，并且ii)所述蛋白質具有將α-氧代羧酸化合物氨基化從而轉化為對應的L-α-氨基酸化合物的能力。

本蛋白質(C)的上述氨基酸序列中，在與序列編號7所示的氨基酸序列之間可以被承認的不同為部分氨基酸的缺失、取代或者添加等。前述“添加”中，不僅包括在序列的端部添加氨基酸，還包括在序列中插入氨基酸。作為所述氨基酸的改變，可以舉出例如：(a)具有序列編號7所示的氨基酸序列的蛋白質因在細胞內受到的加工而缺失；(b)根據前述蛋白質所源自的生物的種差、個體差等而因天然發生的基因突變所產生的氨基酸的缺失、取代或者添加；或者(c)因人為導入的基因突變等而產生的氨基酸的缺失、取代或者添加。

所改變的氨基酸的數量只要是在具有發生改變的上述氨基酸序列的蛋白質能夠發揮出將α-氧代羧酸化合物氨基化從而轉化為對應的L-α-氨基酸化合物的能力的范圍內的數量即可。作為本蛋白質(C)的上述氨基酸序列的(C3)中的“多個氨基酸”，可以舉出例如2、3、4、5、6、7、10、15、18、20、25、30、35、36或40個氨基酸。

作為氨基酸的取代，可以舉出例如保守取代為疏水性、電荷、pK、立體結構方面的特征等類似的氨基酸。作為這樣的取代，具體而言可以舉出例如(1)甘氨酸、丙氨酸；(2)纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；(3)天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、(4)絲氨酸、蘇氨酸；(5)賴氨酸、精氨酸；(6)苯丙氨酸、酪氨酸等組內的取代。

作為氨基酸的添加，可以舉出例如在氨基酸序列的氨基末端或羧基末端上添加包含連續的6個殘基左右的組氨酸的約20個殘基的氨基酸。更具體而言，可以舉出在蛋白質的氨基酸序列的氨基末端上添加序列編號44所示的氨基酸序列、在蛋白質的氨基酸序列的羧基末端上添加序列編號45所示的氨基酸序列。

作為本蛋白質(C)的上述氨基酸序列的(C2)中“90%以上的序列一致性”，可以舉出例如90、95、98或99%以上的序列一致性。

對具有將α-氧代羧酸化合物氨基化從而轉化為對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質的氨基酸序列進行編碼的多核苷酸(以下，有時記為本多核苷酸(C))可以例如由具有將α-氧代羧酸化合物氨基化從而轉化為對應的L-α-氨基酸化合物的能力的微生物、例如球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus) IFO3525株等屬于芽孢桿菌屬的微生物而得到。

由球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus) IFO3525株等屬于芽孢桿菌屬的微生物等，按照通常的基因工學手段制備DNA庫，將所制備的DNA庫作為模板、并使用適當的引物來進行PCR，由此可以將對序列編號42所示的氨基酸序列進行編碼的多核苷酸、或者對在序列編號42所示的氨基酸序列中一個或多個氨基酸發生缺失、取代或者添加而得到的氨基酸序列進行編碼的多核苷酸等進行擴增從而制備本多核苷酸(C)。

例如，作為對序列編號42所示的氨基酸序列進行編碼且具有序列編號43所示的堿基序列的多核苷酸的擴增用引物，合成具有序列編號14所示的堿基序列的寡核苷酸和具有序列編號15所示的堿基序列的寡核苷酸。作為用于將序列編號42所示的氨基酸序列的第113號的丙氨酸轉化為甘氨酸的突變引入用引物，合成具有序列編號16所示的堿基序列的寡核苷酸和具有序列編號17所示的堿基序列的寡核苷酸。

將上述DNA庫作為模板，將具有序列編號14所示的堿基序列的寡核苷酸和具有序列編號15所示的堿基序列的寡核苷酸用于引物從而進行PCR，由此，對具有序列編號43所示的堿基序列的多核苷酸進行擴增。通過將經擴增的多核苷酸整合在載體中，得到含有具有序列編號43所示的堿基序列的多核苷酸的重組載體。將所得到的重組載體作為模板，將具有序列編號16所示的堿基序列的寡核苷酸和具有序列編號17所示的堿基序列的寡核苷酸用于引物從而進行PCR，對所得到的PCR產物用Dpn I進行處理后，導入至大腸桿菌中。對所得到的轉化體所保有的重組載體的堿基序列進行分析，得到對導入有目標氨基酸突變的氨基酸序列進行編碼的多核苷酸，即對序列編號42所示的氨基酸序列中第113號的丙氨酸被取代為甘氨酸而得到的氨基酸序列(序列編號7所示的氨基酸序列)進行編碼的多核苷酸。作為對序列編號7所示的氨基酸序列進行編碼的堿基序列，可以舉出序列編號8所示的堿基序列。

本多核苷酸(C)還可以通過下述方式制備：基于該堿基序列，按照例如亞磷酸三酯法(Hunkapiller, M.et al., Nature, 310, 105, 1984)等常規方法，進行具有目標堿基序列的核酸的化學合成，從而進行制備。

作為對上述(C1)至(C3)中的任一氨基酸序列進行編碼的密碼子，通過以與大腸桿菌中的密碼子使用頻率相符合的方式選擇密碼子，從而設計堿基序列，對由所設計的堿基序列形成的多核苷酸進行化學合成，由此也可以制備本多核苷酸(C)。

為了使本多核苷酸(C)在宿主細胞中表達，例如，制備在宿主細胞中能夠發揮功能的啟動子與本多核苷酸(C)以能夠發揮功能的形式連接而得到的多核苷酸，將其導入至宿主細胞內。

作為在微生物中能夠能夠發揮功能的啟動子，可以舉出在如上所述的大腸桿菌內能夠發揮功能的合成啟動子等。還可以利用控制本多核苷酸(C)在球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus)等屬于芽孢桿菌屬的微生物中的表達的啟動子。

可以例如以下述方式來確認以上述方式制備的多核苷酸對具有將α-氧代羧酸化合物(例如2-氧代-4-(甲硫基)丁酸或α-氧代-異己酸)氨基化從而轉化為對應的L-α-氨基酸化合物(例如L-甲硫氨酸或L-亮氨酸)的能力的蛋白質的氨基酸序列進行編碼。

將以上述方式得到的多核苷酸以連接于在宿主細胞中能夠發揮功能的啟動子的下游的方式插入至載體中，將所得到的重組載體導入至宿主細胞內從而取得轉化體。使所得到的轉化體的培養物作用于α-氧代羧酸(例如2-氧代-4-(甲硫基)丁酸或α-氧代-異己酸)。通過分析反應產物中對應的L-α-氨基酸(例如L-甲硫氨酸或L-亮氨酸)的量，從而可以確認所得到的多核苷酸對具有目標能力的蛋白質的氨基酸序列進行了編碼。

將本發明的多核苷酸(A)、本發明的多核苷酸(B)或本多核苷酸(C)、或者含有這些多核苷酸中的一種以上的重組載體導入至宿主細胞內，由此可以制造轉化體。

作為宿主細胞，可以舉出例如屬于埃希氏菌屬、芽孢桿菌屬、棒狀桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈霉菌屬、酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、紅球菌屬和曲霉屬的微生物。

以上述方式，將本發明的多核苷酸(A)、或者在宿主細胞內能夠發揮功能的啟動子與本發明的多核苷酸(A)以能夠發揮功能的形式連接而成的多核苷酸導入至宿主細胞內，由此可以得到保有本發明的多核苷酸(A)、或者在宿主細胞內能夠發揮功能的啟動子與本發明的多核苷酸(A)以能夠發揮功能的形式連接而成的多核苷酸的轉化體。作為所述轉化體，還可以舉出將外來的上述多核苷酸導入至宿主細胞的染色體中而成的轉化體、即在染色體上保有外來的上述多核苷酸的轉化體。

將本發明的多核苷酸(B)、或者在宿主細胞內能夠發揮功能的啟動子與本發明的多核苷酸(B)以能夠發揮功能的形式連接而成的多核苷酸導入至宿主細胞內，由此可以得到保有本發明的多核苷酸(B)、或者在宿主細胞內能夠發揮功能的啟動子與本發明的多核苷酸(B)以能夠發揮功能的形式連接而成的多核苷酸的轉化體。作為所述轉化體，還可以舉出將外來的上述多核苷酸導入至宿主細胞的染色體中而成的轉化體、即在染色體上保有外來的上述多核苷酸的轉化體。

以上述方式，將

a)本發明的多核苷酸(A)、或者在宿主細胞中能夠發揮功能的啟動子與本發明的多核苷酸(A)以能夠發揮功能的形式連接而成的多核苷酸；和

b)本發明的多核苷酸(B)、或者在宿主細胞中能夠發揮功能的啟動子與本發明的多核苷酸(B)以能夠發揮功能的形式連接而成的多核苷酸；

以及

c)對本蛋白質(C)的氨基酸序列進行編碼的多核苷酸、或者該多核苷酸與在宿主細胞內能夠發揮功能的啟動子以能夠發揮功能的形式連接而成的多核苷酸；

導入至宿主細胞內，由此能夠得到保有

a)本發明的多核苷酸(A)、或者在宿主細胞中能夠發揮功能的啟動子與本發明的多核苷酸(A)以能夠發揮功能的形式連接而成的多核苷酸；和

b)本發明的多核苷酸(B)、或者在宿主細胞中能夠發揮功能的啟動子與本發明的多核苷酸(B)以能夠發揮功能的形式連接而成的多核苷酸；

以及

c)對本蛋白質(C)的氨基酸序列進行編碼的多核苷酸、或者該多核苷酸與在宿主細胞內能夠發揮功能的啟動子以能夠發揮功能的形式連接而成的多核苷酸；

的轉化體。

上述a)的多核苷酸、b)的多核苷酸和c)的多核苷酸可以分別整合在單獨的載體中來導入至宿主細胞內，也可以將其中一種以上整合在同一載體上來導入至宿主細胞內。將一種以上的多核苷酸整合在單一載體中時，例如可以通過將啟動子、終止子等與表達控制相關的區域與目標多核苷酸中的每一種相連從而整合在載體中，也可以以使目標多核苷酸表達為乳糖操縱子之類的包含多個順反子的操縱子的方式整合在載體中。上述a)的多核苷酸、b)的多核苷酸和c)的多核苷酸中的任一者、或者它們中的一種以上可以保有于宿主細胞的染色體上。

本發明蛋白質(A)可以通過例如培養保有本發明的多核苷酸(A)的轉化體從而表達出本發明蛋白質(A)來進行制造。

本發明蛋白質(B)可以通過例如培養保有本發明的多核苷酸(B)的轉化體從而表達出本發明蛋白質(B)來進行制造。

本蛋白質(C)可以通過例如培養保有本多核苷酸(C)的轉化體從而表達出本蛋白質(C)來進行制造。

作為從保有本發明的多核苷酸(A)、本發明的多核苷酸(B)或本多核苷酸(C)的轉化體的培養物中純化本發明蛋白質(A)、本發明蛋白質(B)或本蛋白質(C)的方法，可以應用在蛋白質的純化中所使用的常規方法。

包含本發明蛋白質(A)的級分和包含本發明蛋白質(B)的級分例如可以通過將氧化2-羥基-4-(甲硫基)丁酸而優先生產2-氧代-4-(甲硫基)丁酸的能力、或氧化α-羥基-異己酸而優先生產α-氧代-異己酸的能力作為指標來進行挑選。

包含本蛋白質(C)的級分例如可以通過將對2-氧代-4-(甲硫基)丁酸進行氨基化而優先生產L-甲硫氨酸的能力、或者對α-氧代-異己酸進行氨基化而優先生產L-亮氨酸的能力作為指標來進行挑選。

本發明制造方法是L-α-氨基酸化合物的制造方法，其包括：

(1)使本發明蛋白質(A)和本發明蛋白質(B)中的任一者或兩者作用于α-羥基羧酸化合物從而得到對應的α-氧代羧酸化合物的步驟；和

(2)使具有將α-氧代羧酸化合物氨基化從而轉化為對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質作用于步驟(1)中得到的α-氧代羧酸化合物從而得到對應的L-α-氨基酸化合物的步驟。

作為上述α-羥基羧酸化合物，可以舉出式(4)所示的α-羥基羧酸：

R²-CH(OH)COOH (4)

式中，R²為氫；或者碳原子數1-10的直鏈狀、支鏈狀或環式的烷基；或者具有取代基的酰胺基、氨基、單烷基氨基、二烷基氨基、單烷基酰胺基、二烷基酰胺基、烷氧基、烷硫基、羥基、巰基、羧基或烷氧基羰基的碳原子數1-10的直鏈狀或支鏈狀的烷基；或者1H-咪唑基、苯基、3'-吲哚基、對羥基苯基或對烷氧基苯基，前述取代基所包含的烷基和烷氧基的碳原子數分別為1-3。

作為上述L-α-氨基酸化合物，可以舉出L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-組氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-丙氨酸、甘氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸和L-纈氨酸，可以優選地舉出L-丙氨酸、甘氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸或L-纈氨酸。

作為上述α-羥基羧酸化合物，可以優選地舉出α-羥基-異己酸，作為對應的α-氧代羧酸化合物，可以舉出α-氧代-異己酸，作為對應的L-α-氨基酸化合物，可以舉出L-亮氨酸。

作為上述α-羥基羧酸化合物，還可以優選地舉出含硫的α-羥基羧酸化合物，作為對應的α-氧代羧酸化合物，可以舉出含硫的α-氧代羧酸化合物，作為對應的L-α-氨基酸化合物，可以舉出含硫的L-α-氨基酸化合物。

作為上述含硫的α-羥基羧酸，可以例示出式(1)所示的含硫的α-羥基羧酸：

式中，R¹為氫、或被任選取代的碳原子數1-8的烷基。

作為使本發明蛋白質(A)和本發明蛋白質(B)中的任一者或兩者作用于上述式(1)所示的含硫的α-羥基羧酸而得到的含硫的α-氧代羧酸化合物，可以例示出式(2)所示的含硫的α-氧代羧酸：

式中，R¹表示與前述相同的含義。

作為使本蛋白質(C)作用于上述式(2)所示的含硫的α-氧代羧酸而得到的含硫的L-α-氨基酸化合物，可以例示出式(3)所示的含硫的L-α-氨基酸：

。

式(1)的含硫的α-羥基羧酸、式(2)的含硫的α-氧代羧酸、以及式(3)的含硫的L-α-氨基酸中，作為R¹所示的被任選取代的C1-8的烷基中的C1-8的烷基，可以例示出例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、戊基、己基、庚基和辛基。

作為式(1)所示的含硫的α-羥基羧酸，具體而言可以舉出例如2-羥基-4-(甲硫基)丁酸、2-羥基-4-(乙硫基)丁酸、2-羥基-4-(丙硫基)丁酸、2-羥基-4-(丁硫基)丁酸、2-羥基-4-(戊硫基)丁酸、2-羥基-4-(己硫基)丁酸、2-羥基-4-(庚硫基)丁酸、2-羥基-4-(辛硫基)丁酸。

作為式(2)所示的含硫的α-氧代羧酸，具體而言可以舉出例如2-氧代-4-(甲硫基)丁酸、2-氧代-4-(乙硫基)丁酸、2-氧代-4-(丙硫基)丁酸、2-氧代-4-(丁硫基)丁酸、2-氧代-4-(戊硫基)丁酸、2-氧代-4-(己硫基)丁酸、2-氧代-4-(庚硫基)丁酸、2-氧代-4-(辛硫基)丁酸。

作為式(3)所示的含硫的L-α-氨基酸，具體而言可以舉出例如2-氨基-4-(甲硫基)丁酸、2-氨基-4-(乙硫基)丁酸、2-氨基-4-(丙硫基)丁酸、2-氨基-4-(丁硫基)丁酸、2-氨基-4-(戊硫基)丁酸、2-氨基-4-(己硫基)丁酸、2-氨基-4-(庚硫基)丁酸、2-氨基-4-(辛硫基)丁酸。

作為R¹所示的被任選取代的C1-8的烷基，優選為甲基，作為式(1)所示的含硫的α-羥基羧酸，可以優選地例示出2-羥基-4-(甲硫基)丁酸。

本發明制造方法的步驟(1)中，將α-羥基-異己酸作為底物時，在步驟(1)中得到α-氧代-異己酸，在步驟(2)中得到L-亮氨酸。

本發明制造方法的步驟(1)中，將2-羥基-4-(甲硫基)丁酸作為底物時，在步驟(1)中得到2-氧代-4-(甲硫基)丁酸，在步驟(2)中得到L-甲硫氨酸。

本發明制造方法的步驟(1)中，本發明蛋白質(A)和本發明蛋白質(B)各自能夠以各種形態提供在用于作用于α-羥基羧酸化合物的反應體系中。本發明蛋白質(A)和本發明蛋白質(B)各自可以以經純化的蛋白質的形態而提供在本發明制造方法的步驟(1)的反應體系中，也可以以包含在產生該蛋白質的微生物或該微生物的處理物中的形態提供在前述反應體系中。“微生物的處理物”是指以與上述“轉化體的處理物”相同的方式制備的處理物。本發明蛋白質(A)和本發明蛋白質(B)還可以分別以包含在將對該蛋白質進行編碼的多核苷酸導入至宿主細胞內而成的轉化體或其處理物中的形態提供在上述反應體系中。

為了使本發明蛋白質(A)作用于α-羥基羧酸化合物，具體而言，可以在本發明制造方法的步驟(1)的反應體系中提供將例如本發明蛋白質(A)、本發明蛋白質(A)的固定化物、將對本發明蛋白質(A)進行編碼的多核苷酸導入至宿主細胞內而成的產生本發明蛋白質(A)的轉化體的培養物、或者前述轉化體的處理物。

為了使本發明蛋白質(B)作用于α-羥基羧酸化合物，具體而言，可以在本發明制造方法的步驟(1)的反應體系中提供將例如本發明蛋白質(B)、本發明蛋白質(B)的固定化物、將對本發明蛋白質(B)進行編碼的多核苷酸導入至宿主細胞內而成的產生本發明蛋白質(B)的轉化體的培養物、或者前述轉化體的處理物。

也可以在本發明制造方法的步驟(1)的反應體系中提供將對本發明蛋白質(A)進行編碼的多核苷酸導入至宿主細胞內而成的轉化體或其處理物、以及將對本發明蛋白質(B)進行編碼的多核苷酸導入至宿主細胞內而成的轉化體或其處理物。還可以在上述反應體系中提供將對本發明蛋白質(A)進行編碼的多核苷酸和對本發明蛋白質(B)進行編碼的多核苷酸這兩者導入至同一宿主細胞內而成的轉化體或其處理物。對本發明蛋白質(A)進行編碼的多核苷酸和對本發明蛋白質(B)進行編碼的多核苷酸可以分別整合在單獨的載體中來導入至宿主細胞內，也可以整合在同一載體上來導入至宿主細胞內。將兩種多核苷酸整合在單一載體中時，例如可以通過將啟動子、終止子等與表達控制相關的區域與兩種多核苷酸中的每一種相連從而整合在載體中，也可以以使兩種多核苷酸表達為乳糖操縱子之類的包含多個順反子的操縱子的方式整合在載體中。也可以在宿主細胞的染色體上保有對本發明蛋白質(A)進行編碼的多核苷酸和對本發明蛋白質(B)進行編碼的多核苷酸中的任一者或兩者。

本發明制造方法的步驟(1)通常在水合氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(以下，有時記為NAD+)等輔酶的存在下進行。此時所使用的水可以為緩沖水溶液。作為該緩沖水溶液中使用的緩沖劑，可以舉出例如三羥基甲基氨基甲烷、磷酸鈉或磷酸鉀等磷酸堿金屬鹽、乙酸鈉或乙酸鉀等乙酸堿金屬鹽、或它們的混合物。

本發明制造方法的步驟(1)中，在反應體系中除水以外，還可以共存有有機溶劑。作為所使用的有機溶劑，可以舉出例如叔丁基甲基醚、二異丙基醚、四氫呋喃等醚類；甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、丙酸乙酯、丙酸丁酯等酯類；甲苯、己烷、環己烷、庚烷、異辛烷等烴類；甲醇、乙醇、2-丙醇、丁醇、叔丁醇等醇類；二甲基亞砜等有機硫化合物、丙酮等酮類、乙腈等腈類、和它們的混合物。

本發明制造方法的步驟(1)中，由于作為共軛體系而利用輔因子(cofactor)，因此通常在反應體系中添加輔酶(coenzyme)。作為所添加的輔酶，可以舉出例如氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(以下，有時記為NADP+)。反應體系內的輔因子的量通常為與作為底物的α-羥基羧酸化合物的量等摩爾、或者為其以上，優選在反應開始時預先添加。

本發明制造方法的步驟(1)中，隨著α-羥基羧酸化合物(例如2-羥基-4-(甲硫基)丁酸等含硫的α-羥基羧酸或α-羥基-異己酸)的氧化反應的進行，反應液中的NAD+被轉化為還原型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(以下，有時記為NADH)。通過轉化而生成的NADH可以通過與具有將NADH轉化為氧化型(NAD+)的能力的蛋白質發生作用而復原成原來的NAD+，因此，上述步驟(1)的反應體系內可以進一步存在具有將NADH轉化為NAD+的能力的蛋白質。上述步驟(1)的反應體系內進一步存在具有將NADH轉化為NAD+的能力的蛋白質時，反應體系內的輔因子的量通常可以為催化劑量，為與作為底物的α-羥基羧酸化合物的量等摩爾、或者為其以下。

作為具有將NADH轉化為NAD+的能力的蛋白質，可以舉出例如蘋果酸脫氫酶等有機酸脫氫酶、還原酶、醇脫氫酶、醛脫氫酶、氨基酸脫氫酶、或NADH氧化酶。作為氨基酸脫氫酶，可以舉出本蛋白質(C)，更具體而言，可以舉出屬于Bacillus屬的微生物的亮氨酸脫氫酶。

具有將NADH轉化為NAD⁺的能力的蛋白質為NADH氧化酶時，通過在反應體系內共存有FAD等，有時該蛋白質的活性得到增強，例如可以在反應液中添加FAD等。具有將NADH轉化為NAD⁺的能力的蛋白質為NADH氧化酶時，反應液中的氧氣被消耗并被轉化為過氧化氫。通過轉化而生成的過氧化氫可以通過與具有將過氧化氫轉化為分子氧的能力的蛋白質而復原成原來的分子氧，因此，上述步驟的反應體系內可以進一步共存有具有將過氧化氫轉化為分子氧的能力的蛋白質。作為具有將過氧化氫轉化為分子氧的能力的蛋白質，可以舉出例如過氧化氫酶。

具有將NADH轉化為NAD+的能力的蛋白質、具有將過氧化氫轉化為分子氧的能力的蛋白質各自可以以經純化的蛋白質或其固定化物的形態而提供在本發明制造方法的步驟(1)的反應體系中，也可以以包含在產生該蛋白質的微生物或該微生物的處理物中的形態提供在前述反應體系中。“微生物的處理物”是指以與上述“轉化體的處理物”相同的方式制備的處理物。例如，可以在上述反應體系中提供將對具有將NADH轉化為NAD+的能力的蛋白質進行編碼的多核苷酸導入至宿主細胞內而成的轉化體或其處理物。可以在上述反應體系進一步提供將對具有將過氧化氫轉化為分子氧的能力的蛋白質進行編碼的多核苷酸導入至宿主細胞內而成的轉化體或其處理物。

還可以在上述反應體系中提供將對具有將NADH轉化為NAD+的能力的蛋白質進行編碼的多核苷酸導入至宿主細胞內而成的轉化體或其處理物、以及將對具有將過氧化氫轉化為分子氧的能力的蛋白質進行編碼的多核苷酸導入至宿主細胞內而成的轉化體或其處理物。

還可以在上述反應體系中提供將對具有將NADH轉化為NAD+的能力的蛋白質進行編碼的多核苷酸和對具有將過氧化氫轉化為分子氧的能力的蛋白質進行編碼的多核苷酸這兩者導入至同一宿主細胞內而成的轉化體或其處理物。對具有將NADH轉化為NAD+的能力的蛋白質進行編碼的多核苷酸和對具有將過氧化氫轉化為分子氧的能力的蛋白質進行編碼的多核苷酸可以分別整合在單獨的載體中來導入至宿主細胞內，也可以整合在同一載體上來導入至宿主細胞內。將兩種多核苷酸整合在單一載體中時，例如可以通過將啟動子、終止子等與表達控制相關的區域與兩種多核苷酸中的每一種相連從而整合在載體中，也可以以使兩種多核苷酸表達為乳糖操縱子之類的包含多個順反子的操縱子的方式整合在載體中。可以在宿主細胞的染色體上保有對具有將NADH轉化為NAD+的能力的蛋白質進行編碼的多核苷酸和對具有將過氧化氫轉化為分子氧的能力的蛋白質進行編碼的多核苷酸中的任一者或兩者。

還可以在上述反應體系中提供將選自對本發明蛋白質(A)進行編碼的多核苷酸、對本發明蛋白質(B)進行編碼的多核苷酸、對具有將NADH轉化為NAD+的能力的蛋白質進行編碼的多核苷酸、和對具有將過氧化氫轉化為分子氧的能力的蛋白質進行編碼的多核苷酸中的兩種以上的多核苷酸導入至同一宿主細胞內而成的轉化體或其處理物。

本發明制造方法的步驟(1)中的反應例如可以通過將反應液利用攪拌、振蕩等進行混合從而進行，所述反應液含有水、α-羥基羧酸化合物(例如2-羥基-4-(甲硫基)丁酸等含硫的α-羥基羧酸化合物或α-羥基-異己酸)和NAD+、以及本發明蛋白質(A)和本發明蛋白質(B)中的任一者或兩者、或者產生它們的轉化體或其處理物、根據需要還含有有機溶劑、過氧化氫酶等。

上述方法中的反應時的pH可以適當選擇，通常pH為約3至約10的范圍。反應溫度可以適當選擇，從原料和產物的穩定性、反應速度的觀點出發，通常為約0℃至約60℃的范圍。

隨著α-羥基羧酸化合物(例如2-羥基-4-(甲硫基)丁酸等含硫的α-羥基羧酸或α-羥基-異己酸)的氧化反應的進行，反應液中的NAD+被轉化為NADH。由此，上述步驟(1)的反應體系內不包含具有將NADH轉化為NAD+的能力的蛋白質時，例如通過測定反應液中的NADH的每單位時間的增加量、即增加速度，從而可以監測前述氧化反應的進行。

反應的終點例如可以通過利用液相色譜等對反應液中的α-羥基羧酸化合物(例如2-羥基-4-(甲硫基)丁酸等含硫的α-羥基羧酸化合物或α-羥基-異己酸)的量進行分析來確定。

反應時間可以適當選擇，通常為約0.5小時至約10天的范圍。

從反應液中回收α-氧代羧酸(例如2-氧代-4-(甲硫基)丁酸等含硫的α-氧代羧酸化合物或α-氧代-異己酸)通過通常已知的任意方法來進行即可。

可以舉出例如通過將對反應液進行有機溶劑萃取操作、濃縮操作等后處理與根據需要的柱色譜、蒸餾等進行組合從而純化目標化合物的方法。

將本發明制造方法的步驟(1)中得到的α-氧代羧酸(例如2-氧代-4-(甲硫基)丁酸等含硫的α-氧代羧酸化合物或α-氧代-異己酸)從反應液中純化或部分純化后，可以供于步驟(2)。還可以通過將步驟(1)的反應液添加至步驟(2)的反應液中，從而將步驟(1)中得到的α-氧代羧酸(例如2-氧代-4-(甲硫基)丁酸等含硫的α-氧代羧酸化合物或α-氧代-異己酸)供于步驟(2)。

本發明制造方法的步驟(2)中，本蛋白質(C)能夠以各種形態提供在用于作用于α-氧代羧酸化合物的反應體系中。本蛋白質(C)可以以經純化的蛋白質的形態而提供在上述步驟(2)的反應體系中，也可以以包含在產生該蛋白質的微生物或該微生物的處理物中的形態提供在前述反應體系中。“微生物的處理物”是指以與上述“轉化體的處理物”相同的方式制備的處理物。本蛋白質(C)還可以以包含在將對該蛋白質進行編碼的多核苷酸導入至宿主細胞內而成的轉化體或其處理物中的形態提供在上述反應體系中。

為了使本蛋白質(C)作用于α-氧代羧酸化合物，具體而言，可以在上述步驟(2)的反應體系中提供將例如本蛋白質(C)、本蛋白質(C)的固定化物、將對本蛋白質(C)進行編碼的多核苷酸導入至宿主細胞內而成的產生本蛋白質(C)的轉化體的培養物、或者前述轉化體的處理物。

本發明制造方法的步驟(2)通常在水、銨離子和NADH等輔酶的存在下進行。

此時所使用的水可以為緩沖水溶液。作為該緩沖水溶液中使用的緩沖劑，可以舉出例如三羥基甲基氨基甲烷、磷酸鈉或磷酸鉀等磷酸堿金屬鹽、乙酸鈉或乙酸鉀等乙酸堿金屬鹽、或它們的混合物。

本發明制造方法的步驟(2)中，在反應體系中除水以外，還可以共存有有機溶劑。作為所使用的有機溶劑，可以舉出例如叔丁基甲基醚、二異丙基醚、四氫呋喃等醚類；甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、丙酸乙酯、丙酸丁酯等酯類；甲苯、己烷、環己烷、庚烷、異辛烷等烴類；甲醇、乙醇、2-丙醇、丁醇、叔丁醇等醇類；二甲基亞砜等有機硫化合物、丙酮等酮類、乙腈等腈類、和它們的混合物。

本發明制造方法的步驟(2)中，由于利用銨離子作為氨基供體，因此通常在反應體系中添加銨鹽化合物。作為所添加的銨鹽化合物，可以舉出例如硫酸銨、甲酸銨、氯化銨、硝酸銨、磷酸銨、氫氧化銨、酒石酸銨、乙酸銨等。反應體系內的銨離子的量通常為與作為底物的α-氧代羧酸化合物的量等摩爾、或者為其以上，優選在反應開始時預先添加。

本發明制造方法的步驟(2)中，由于作為共軛體系而利用輔因子(cofactor)，因此通常在反應體系中添加輔酶(coenzyme)。作為所添加的輔酶，可以舉出例如還原型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、還原型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(以下，有時記為NADPH)。反應體系內的輔因子的量通常為與作為底物的α-氧代羧酸化合物的量等摩爾、或者為其以上，優選在反應開始時預先添加。

本發明制造方法的步驟(2)中，隨著α-氧代羧酸(例如2-氧代-4-(甲硫基)丁酸等含硫的α-氧代羧酸或α-氧代-異己酸)的還原性氨基化反應的進行，反應液中的NADH被轉化為氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)。通過轉化而生成的NAD+可以通過與具有將NAD+轉化為還原型(NADH)的能力的蛋白質發生作用而復原成原來的NADH，因此，上述步驟(2)的反應體系內可以進一步存在具有將NAD+轉化為NADH的能力的蛋白質。上述步驟(2)的反應體系內進一步存在具有將NAD+轉化為NADH的能力的蛋白質時，反應體系內的輔因子的量通常可以為催化劑量，為與作為底物的α-氧代羧酸化合物的量等摩爾、或者為其以下。

作為具有將NAD+轉化為NADH的能力的蛋白質，可以舉出例如甲酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶等有機酸脫氫酶、葡糖脫氫酶、醇脫氫酶、醛脫氫酶、或氨基酸脫氫酶。

具有將NAD+轉化為NADH的能力的蛋白質可以以經純化的蛋白質或其固定化物的形態而提供在本發明制造方法的步驟(2)的反應體系中，也可以以包含在產生該蛋白質的微生物或該微生物的處理物中的形態提供在前述反應體系中。“微生物的處理物”是指以與上述“轉化體的處理物”相同的方式制備的處理物。例如，可以在上述反應體系中提供將對具有將NAD+轉化為NADH的能力的蛋白質進行編碼的多核苷酸導入至宿主細胞內而成的轉化體或其處理物。

本發明制造方法的步驟(2)中，可以用于作用于在α-氧代羧酸化合物的反應體系中提供將對本蛋白質(C)進行編碼的多核苷酸導入至宿主細胞內而成的轉化體或其處理物、以及將對具有將NAD+轉化為NADH的能力的蛋白質進行編碼的多核苷酸導入至宿主細胞內而成的轉化體或其處理物。

本發明制造方法的步驟(2)中，還可以在前述反應體系中提供將對本蛋白質(C)進行編碼的多核苷酸和對具有將NAD+轉化為NADH的能力的蛋白質進行編碼的多核苷酸這兩者導入至同一宿主細胞內而成的轉化體或其處理物。對本蛋白質(C)進行編碼的多核苷酸和對具有將NAD+轉化為NADH的能力的蛋白質進行編碼的多核苷酸可以分別整合在單獨的載體中來導入至宿主細胞內，也可以整合在同一載體上來導入至宿主細胞內。將兩種多核苷酸整合在單一載體中時，例如可以通過將啟動子、終止子等與表達控制相關的區域與兩種多核苷酸中的每一種相連從而整合在載體中，也可以以使兩種多核苷酸表達為乳糖操縱子之類的包含多個順反子的操縱子的方式整合在載體中。可以在宿主細胞的染色體上保有對本蛋白質(C)進行編碼的多核苷酸和對具有將NAD+轉化為NADH的能力的蛋白質進行編碼的多核苷酸中的任一者或兩者。

本發明制造方法的步驟(2)中的反應例如可以通過將反應液利用攪拌、振蕩等進行混合從而進行，所述反應液含有水、銨鹽化合物、NADH、α-氧代羧酸化合物(例如2-氧代-4-(甲硫基)丁酸等含硫的α-氧代羧酸化合物或α-氧代-異己酸)、本蛋白質(C)或者產生其的轉化體或其處理物、根據需要還含有有機溶劑、具有將NAD+轉化為NADH的能力的蛋白質等。

上述方法中的反應時的pH可以適當選擇，通常pH為約3至約10的范圍。反應溫度可以適當選擇，從原料和產物的穩定性、反應速度的觀點出發，通常為約0℃至約60℃的范圍。

反應的終點例如可以通過利用液相色譜等對反應液中的α-氧代羧酸化合物(例如2-氧代-4-(甲硫基)丁酸等含硫的α-氧代羧酸化合物或α-氧代-異己酸)的量進行分析來確定。

反應時間可以適當選擇，通常為約0.5小時至約10天的范圍。

從反應液中回收L-α-氨基酸(例如L-甲硫氨酸等含硫的L-α-氨基酸或L-亮氨酸)通過通常已知的任意方法來進行即可。

可以舉出例如通過將對反應液進行過濾、晶析、有機溶劑萃取操作、濃縮操作等后處理與根據需要的柱色譜、蒸餾等進行組合從而純化目標化合物的方法。

還可以在一個反應體系中進行本發明制造方法的步驟(1)和步驟(2)。

此時，本發明蛋白質(A)、本發明蛋白質(B)和本蛋白質(C)各自能夠以各種形態提供在上述反應體系中。

本發明蛋白質(A)、本發明蛋白質(B)和本蛋白質(C)可以以經純化的蛋白質的形態而提供在上述反應體系中，也可以以包含在產生這些蛋白質的微生物或該微生物的處理物中的形態提供在上述反應體系中。

本發明蛋白質(A)、本發明蛋白質(B)和本蛋白質(C)還可以以包含在將對這些蛋白質進行編碼的多核苷酸導入至宿主細胞內而成的轉化體或其處理物中的形態提供在上述反應體系中。

例如，可以在上述反應體系中提供將對本發明蛋白質(A)進行編碼的多核苷酸導入至宿主細胞內而成的轉化體或其處理物、和將對本發明蛋白質(B)進行編碼的多核苷酸導入至宿主細胞內而成的轉化體或其處理物中的任一者或兩者、以及將對本蛋白質(C)進行編碼的多核苷酸導入至宿主細胞內而成的轉化體或其處理物。還可以在上述反應體系中提供將對本發明蛋白質(A)進行編碼的多核苷酸和對本發明蛋白質(B)進行編碼的多核苷酸中的任一者或兩者、以及對本蛋白質(C)進行編碼的多核苷酸導入至同一宿主細胞內而成的轉化體或其處理物。對本發明蛋白質(A)進行編碼的多核苷酸和對本發明蛋白質(B)進行編碼的多核苷酸中的任一者或兩者、以及對本蛋白質(C)進行編碼的多核苷酸可以分別整合在單獨的載體中來導入至宿主細胞內，也可以整合在同一載體上來導入至宿主細胞內。將多種多核苷酸整合在單一載體中時，例如可以通過將啟動子、終止子等與表達控制相關的區域與上述多核苷酸中的每一種相連從而整合在載體中，也可以以使上述多核苷酸表達為乳糖操縱子之類的包含多個順反子的操縱子的方式整合在載體中。也可以在宿主細胞的染色體上保有對本發明蛋白質(A)進行編碼的多核苷酸、對本發明蛋白質(B)進行編碼的多核苷酸和對本蛋白質(C)進行編碼的多核苷酸中的任一者或兩者以上。

在一個反應體系中進行本發明制造方法的步驟(1)和步驟(2)時的反應可以在按照上述本發明制造方法的步驟(2)的反應的反應液和反應條件下進行。

隨著步驟(1)中的α-羥基羧酸化合物(例如2-羥基-4-(甲硫基)丁酸等含硫的α-羥基羧酸或α-羥基-異己酸)的氧化反應的進行，反應液中的NAD+被轉化為NADH。隨著步驟(2)中的α-氧代羧酸(例如2-氧代-4-(甲硫基)丁酸等含硫的α-氧代羧酸或α-氧代-異己酸)的還原性氨基化反應的進行，反應液中的NADH被轉化為NAD+。由此，在一個反應體系中進行本發明制造方法的步驟(1)和步驟(2)時，可以以催化劑量循環輔酶(NAD+和NADH)。

反應的終點例如可以通過利用液相色譜等對反應液中的α-羥基羧酸化合物(例如2-羥基-4-(甲硫基)丁酸等含硫的α-羥基羧酸化合物或α-羥基-異己酸)的量進行分析來確定。

反應時間可以適當選擇，通常為約0.5小時至約10天的范圍。

從反應液中回收L-α-氨基酸(例如L-甲硫氨酸等含硫的L-α-氨基酸或L-亮氨酸)可以以與上述本發明制造方法的步驟(2)的情況相同的方式來進行。

實施例

以下，通過實施例等來對本發明進一步詳細地進行說明，但本發明不受這些實施例的限制。

參考例1(染色體DNA的制備)

向兩瓶500ml容量燒瓶中各加入100ml的培養基(在水100ml中溶解葡萄糖2g、多肽0.5g、酵母提取物0.3g、肉提取物0.3g、硫酸銨0.2g、磷酸二氫鉀0.1g、硫酸鎂七水合物0.05g，用2N的HCl將pH調整至6而得到)，在121℃下進行15分鐘滅菌。在此，在同組成的培養基中各添加0.3ml的在30℃下振蕩培養48小時的反硝化無色桿菌(Achromobacter denitrificans)ATCC55564株的培養液，在30℃下振蕩培養24小時。將所得到的培養液在8000rpm、4℃下離心分離10分鐘，收集生成的沉淀。將所得到的沉淀用0.85%食鹽水50ml進行洗滌，得到3.5g的濕菌體。

使用QIAprep Genomic-tip System (Qiagen公司制)，從所得到的菌體中得到染色體DNA(以下，記為染色體DNA(A))。

實施例1(本發明的多核苷酸(A)和本發明的多核苷酸(B)、分別包含它們的重組載體、以及保有該載體的轉化體的載體)

(1)引物合成

合成分別具有序列編號9至12所示的堿基序列的寡核苷酸引物。

[表1]

(2)包含本發明的多核苷酸(B)的重組載體

使用具有序列編號9所示的堿基序列的寡核苷酸引物和序列編號10所示的寡核苷酸引物，以上述染色體DNA(A)為模板，以下述反應液組成進行PCR。

[反應液組成]

染色體DNA(A)溶液 1.5μl

dNTP(各2mM的混合物) 10μl

引物(50pmol/μl) 各 0.3μl

2x緩沖液 25μl

KOD-FX(1U/μl，東洋紡公司制) 1μl

超純水 11.9μl。

將加入有上述組成的反應液的容器安裝于熱循環儀(PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System 9700)中，在94℃下保溫2分鐘后，進行30次在98℃下10秒鐘、接著在60℃下30秒鐘、接著在68℃下60秒鐘的保溫循環，然后保持在4℃下。

其后，將上述PCR反應液的一部分供于瓊脂糖凝膠電泳。檢測到約1.1kb的DNA的帶。

向剩余的PCR反應液中添加限制酶NdeI和XhoI從而使DNA進行雙重消化，對經酶消化的約1.1kb的DNA進行純化。

使質粒載體pET-22b(ノバジェン公司制)通過限制酶NdeI和XhoI進行雙重消化，對經酶消化的載體DNA進行純化。

混合這些經純化的DNA，用T4 DNA連接酶進行連接，用所得到的連接液轉化大腸桿菌(E.coli) DH5α。

將所得到的轉化體在含有50μg/ml的氨比西林的LB瓊脂培養基中進行培養，從生育出的菌落當中隨機挑選8個菌落。將挑選出的菌落接種于各含有50μg/ml的氨比西林的滅菌LB培養基2ml中，在試管中，在37℃下振蕩培養17小時。使用QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen公司制)，從各培養菌體中抽提質粒。將所抽提的質粒的每一種中的一部分通過限制酶NdeI和XhoI進行雙重消化后，供于瓊脂糖凝膠電泳。在6種質粒中，確認到各自約1.1kb的DNA插入至上述載體中。對這些質粒當中的1種所保有的約1.1kb的插入DNA的堿基序列進行分析時，表明該DNA具有序列編號2所示的堿基序列。將該質粒命名為pET774。序列編號2所示的堿基序列對序列編號1所示的氨基酸序列進行編碼。質粒pET774被設計為能夠表達具有下述氨基酸序列的蛋白質，所述氨基酸序列中，在序列編號1所示的氨基酸序列的羧基末端上添加有由包含連續6個殘基的組氨酸的8個氨基酸構成的氨基酸序列(序列編號45：LeuGluHisHisHisHisHisHis)。

(3)包含本發明的多核苷酸(A)的重組載體

使用具有序列編號11所示的堿基序列的寡核苷酸引物和序列編號12所示的寡核苷酸引物，以上述染色體DNA(A)為模板，使用Expand High Fidelity PCR System(擴大高保真PCR系統，ロシュ?ダイアグノスティック公司制)，以下述反應液組成進行PCR。

[反應液組成]

染色體DNA(A)溶液 1μl

dNTP(各2.5mM的混合物) 1μl

引物(20pmol/μl) 各 0.4μl

5x緩沖液(具有MgCl₂) 10μl

enz.expandHiFi (3.5x10³U/ml) 0.5μl

超純水 36.7μl。

將加入有上述組成的反應液的容器安裝于熱循環儀(PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System2400)中，在94℃下保溫2分鐘后，進行10次在94℃下15秒鐘、接著在65℃下30秒鐘、接著在72℃下1分鐘的保溫循環，接著，進行20次在94℃下15秒鐘、接著在70℃下30秒鐘、接著在72℃下1分鐘的保溫循環，進一步在72℃下保持7分鐘。

其后，將上述PCR反應液的一部分供于瓊脂糖凝膠電泳。檢測到約1.0kb的DNA的帶。

向剩余的PCR反應液中添加限制酶NdeI和XhoI從而使DNA進行雙重消化，對經酶消化的約1.0kb的DNA進行純化。

使質粒載體pET-22b(ノバジェン公司制)通過限制酶NdeI和XhoI進行雙重消化，對經酶消化的載體DNA進行純化。

混合這些經純化的DNA，用T4 DNA連接酶進行連接，用所得到的連接液轉化大腸桿菌(E.coli) DH5α。

將所得到的轉化體在含有50μg/ml的氨比西林的LB瓊脂培養基中進行培養，從生育出的菌落當中隨機挑選8個菌落。將挑選出的菌落接種于各含有50μg/ml的氨比西林的滅菌LB培養基2ml中，在試管中，在37℃下振蕩培養17小時。使用QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen公司制)，從各培養菌體中抽提質粒。將所抽提的質粒的每一種中的一部分通過限制酶NdeI和XhoI進行雙重消化后，供于瓊脂糖凝膠電泳。在6種質粒中，確認到各自約1.0kb的DNA插入至上述載體中。對這些質粒當中的1種所保有的約1.0kb的插入DNA的堿基序列進行分析時，表明該DNA具有序列編號4所示的堿基序列。將該質粒命名為pET43。序列編號4所示的堿基序列對序列編號3所示的氨基酸序列進行編碼。質粒pET43被設計為能夠表達具有下述氨基酸序列的蛋白質，所述氨基酸序列中，在序列編號3所示的氨基酸序列的羧基末端上添加有由包含連續6個殘基的組氨酸的8個氨基酸構成的氨基酸序列(序列編號45：LeuGluHisHisHisHisHisHis)。

實施例2(本發明蛋白質(A)和本發明蛋白質(B)的制備、以及使用該蛋白質的L-α-氨基酸化合物的制造)

(1)本發明蛋白質(B)

使用質粒pET774來轉化大腸桿菌(E.coli) BL21(DE3)株。將所得到的轉化體接種于含有0.1mM的IPTG和50μg/ml的氨比西林的滅菌LB培養基800ml中，在30℃下振蕩培養15小時。將所得到的培養液進行離心分離，得到濕菌體。將該濕菌體約4.9g懸浮于包含0.5M NaCl和5mM咪唑的20mM磷酸緩沖液(pH7.4)(以下，有時記為結合緩沖液)40ml中，使用マルチビーズショッカー(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmΦ)，以2500rpm進行20分鐘的破碎處理。將所得到的破碎液在8000rpm、4℃下進行10分鐘離心分離，得到離心上清液約28ml。

將約10ml的所得到的遠心上清液以5ml/分鐘的流速施于親和柱(HisTrap HP、凝膠床5ml、GEヘルスケア公司制)上。向該柱以5ml/分鐘的流速流入約25ml的結合緩沖液，使非吸附蛋白質溶出。其后，在維持流速的情況下，流入包含0.5M NaCl和29.75mM 咪唑的20mM磷酸緩沖液(pH7.4)約35ml，使非吸附蛋白質和低吸附蛋白質溶出。

接著，在流入47.5ml期間，通過將咪唑濃度從29.75mM增加至500mM的梯度溶出來使吸附蛋白質溶出，分離出咪唑濃度為120mM至270mM附近的級分25ml。將所得到的級分供于Amicon Ultra-15(ミリポア公司制)，進行脫鹽濃縮和在0.5M Tris-HCl(pH9)中的緩沖液交換，得到約2ml的純化酶液(40g蛋白質/L)。混合所得到的純化酶液的2倍稀釋液0.31ml、和2-羥基-4-(甲硫基)丁酸的鈣鹽(東京化成公司制)50mg、NAD+10mg、0.5M Tris-HCl緩沖液(pH9.0)0.04ml、硫酸銨40mg、和亮氨酸脫氫酶(和光純藥公司制)60U，在30℃下振蕩24小時。針對該反應液，在下述條件下通過液相色譜進行含量分析。可知，相對于反應中使用的2-羥基-4-(甲硫基)丁酸的鈣鹽的量，生成了35.3%的L-甲硫氨酸。

(含量分析條件)

柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)

移動相：以A液(%):B液(%)=90:10的比例混合包含50mM 磷酸的12mM 1-庚磺酸鈉水溶液(A液)和乙腈(B液)

流量：0.8ml/分鐘

柱溫度：37℃

檢測：210nm。

(2)本發明蛋白質(A)

使用質粒pET43來轉化大腸桿菌(E.coli) BL21(DE3)株。將所得到的轉化體接種于含有0.1mM的IPTG和50μg/ml的氨比西林的滅菌LB培養基800ml中，在30℃下振蕩培養15小時。將所得到的培養液進行離心分離，得到濕菌體。將該濕菌體約5.2g懸浮于包含0.5M的NaCl和5mM咪唑的20mM磷酸緩沖液(pH7.4)(即結合緩沖液)40ml中，使用マルチビーズショッカー(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmΦ)，以2500rpm進行20分鐘的破碎處理。將所得到的破碎液在8000rpm、4℃下進行10分鐘離心分離，得到離心上清液約28ml。

將約10ml的所得到的遠心上清液以5ml/分鐘的流速施于親和柱(HisTrap HP、凝膠床5ml、GEヘルスケア公司制)上。向該柱以5ml/分鐘的流速流入約25ml的結合緩沖液，使非吸附蛋白質溶出。其后，在維持流速的情況下，流入包含0.5M NaCl和29.75mM 咪唑的20mM磷酸緩沖液(pH7.4)約35ml，使非吸附蛋白質和低吸附蛋白質溶出。

接著，在流入47.5ml期間，通過將咪唑濃度從29.75mM增加至500mM的梯度溶出來使吸附蛋白質溶出，分離出咪唑濃度為120至270mM附近的級分25ml。將所得到的級分供于Amicon Ultra-15(ミリポア公司制)，進行脫鹽濃縮和在0.5M Tris-HCl(pH9)中的緩沖液交換，得到約2ml的純化酶液(9g蛋白質/L)。將所得到的純化酶液0.62ml用Amicon Ultra-15(ミリポア公司制)濃縮2倍。混合所得到的0.31ml的濃縮液、和2-羥基-4-(甲硫基)丁酸的鈣鹽(東京化成公司制)50mg、NAD+10mg、0.5M Tris-HCl緩沖液(pH9.0)0.04ml、硫酸銨40mg、和亮氨酸脫氫酶(和光純藥公司制)60U，在30℃下振蕩24小時。針對該反應液，在下述條件下通過液相色譜進行含量分析。可知，相對于反應中使用的2-羥基-4-(甲硫基)丁酸的鈣鹽的量，生成了36.9%的L-甲硫氨酸。

(含量分析條件)

柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)

移動相：以A液(%):B液(%)=90:10的比例混合包含50mM 磷酸的12mM 1-庚磺酸鈉水溶液(A液)和乙腈(B液)

流量：0.8ml/分鐘

柱溫度：37℃

檢測：210nm。

(3)本發明蛋白質(A)和本發明蛋白質(B)

混合實施例2(1)中制備的純化酶液(40g蛋白質/L)的2倍稀釋液0.31ml和實施例2(2)中制備的純化酶液(9g蛋白質/L)的2倍濃縮液0.31ml，用Amicon Ultra-15(ミリポア公司制)濃縮2倍。混合所得到的酶液0.31ml、和2-羥基-4-(甲硫基)丁酸的鈣鹽(東京化成公司制)50mg、NAD+10mg、0.5M Tris-HCl緩沖液(pH9.0)0.04ml、硫酸銨40mg、和亮氨酸脫氫酶(和光公司制)60U，在30℃下振蕩3小時。針對該反應液，在下述條件下通過液相色譜進行含量分析。可知，相對于反應中使用的2-羥基-4-(甲硫基)丁酸的鈣鹽的量，生成了47.0%的L-甲硫氨酸。

(含量分析條件)

柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)

移動相：以A液(%):B液(%)=90:10的比例混合包含50mM 磷酸的12mM 1-庚磺酸鈉水溶液(A液)和乙腈(B液)

流量：0.8ml/分鐘

柱溫度：37℃

檢測：210nm。

實施例3(含有本多核苷酸(C)的重組載體和保有該載體的轉化體的載體、以及本蛋白質(C)的制備)

(1)含有本多核苷酸(C)的重組載體

將球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus) IFO3525株在經滅菌的LB培養基100ml中進行培養，得到菌體0.4g。使用Qiagen Genomic Tip (Qiagen公司制)，按照其附屬的手冊所述的方法，從該菌體中純化染色體DNA(以下，記為染色體DNA(B))。

以Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 23 (2003) 239-247所記載的源自球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus) IFO3525株的對亮氨酸脫氫酶進行編碼的堿基序列為基礎，合成具有序列編號14所示的堿基序列(GCCATGGAAATCTTCAAGTATATGG)的寡核苷酸引物和具有序列編號15所示的堿基序列(GGGCCCGGGTTAACGGCCGTTCAAAATATT)的寡核苷酸引物。

使用具有序列編號14所示的堿基序列的寡核苷酸引物和具有序列編號15所示的堿基序列的寡核苷酸引物，以上述染色體DNA(B)為模板，使用Expand High Fidelity PCR System(擴大高保真PCR系統，ロシュ?ダイアグノスティック公司制)，以下述反應液組成進行PCR。

[反應液組成]

染色體DNA(B)溶液 1μl

dNTP(各2.5mM的混合物) 1μl

引物(20pmol/μl) 0.4μl

引物(4pmol/μl) 2μl

5x緩沖液(具有MgCl₂) 10μl

enz.expandHiFi (3.5x10³U/ml) 0.5μl

超純水 35.1μl。

將加入有上述組成的反應液的容器安裝于熱循環儀(PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System2400)中，在94℃下保溫2分鐘后，進行25次在94℃下20秒鐘、接著在55℃下25秒鐘、接著在72℃下1.5分鐘的保溫循環，進一步在72℃下保持7分鐘。

其后，將上述PCR反應液的一部分供于瓊脂糖凝膠電泳。檢測到約1.1kb的DNA的帶。

向剩余的PCR反應液中添加限制酶NcoI和SmaI從而使DNA進行雙重消化，對經酶消化的約1.1kb的DNA進行純化。

使質粒載體pTrc99A(GEヘルスケア公司制)通過限制酶NcoI和SmaI進行雙重消化，對經酶消化的載體DNA及進行純化。

混合這些經純化的DNA，用T4 DNA連接酶進行連接，用所得到的連接液轉化大腸桿菌(E.coli) DH5α。

將所得到的轉化體在含有50μg/ml的氨比西林的LB瓊脂培養基中進行培養，從生育出的菌落當中隨機挑選8個菌落。將挑選出的菌落接種于各含有50μg/ml的氨比西林的滅菌LB培養基2ml中，在試管中，在37℃下振蕩培養17小時。使用QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen公司制)，從各培養菌體中抽提質粒。將所抽提的質粒的每一種中的一部分通過限制酶NcoI和XbaI進行雙重消化后，供于瓊脂糖凝膠電泳。在6種質粒中，確認到各自約1.1kb的DNA插入至上述載體中。將這些質粒當中之一命名為pTrcLD。

(2)含有本多核苷酸(C)的重組載體

以Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 23 (2003) 239-247所述的源自球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus) IFO3525株的對亮氨酸脫氫酶進行編碼的堿基序列為基礎，作為用于將前述酶的第113號的丙氨酸取代為甘氨酸的突變導入引物，合成具有序列編號16所示的堿基序列(GTCGCTATATTACCGGTGAAGATGTTG)的寡核苷酸(正義引物)、和具有序列編號17所示的堿基序列(CAACATCTTCACCGGTAATATAGCGAC)的寡核苷酸(反義引物)。將具有序列編號16所示的堿基序列的寡核苷酸和具有序列編號17所示的堿基序列的寡核苷酸用于引物，以實施例3(1)所述的重組載體pTrcLD為模板，使用QuikChange II定點突變試劑盒(STRATAGENE公司制)，以下述反應液組成進行PCR。

[反應液組成]

pTrcLD的DNA溶液 0.4μl

dNTP混合物(包含在上述試劑盒內) 1μl

正義引物(50μM) 0.4μl

反義引物(50μM) 0.4μl

10xbuffer(包含在上述試劑盒內) 5μl

PfuUltra (包含在上述試劑盒內) 1μl

超純水 41.8μl。

將加入有上述組成的反應液的容器安裝于熱循環儀(PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System2400)中，在95℃下保溫1分鐘后，進行12次在95℃下50秒鐘、接著在55℃下1分鐘、接著在68℃下5分鐘的保溫循環，然后保存在4℃下。

向所得到的PCR反應液中添加DpnI限制酶(包含在上述試劑盒內)后，在37℃下保溫1小時。使用所得到的保溫液來轉化大腸桿菌(E.coli) DH5α。

從所得到的轉化體的每一種中提取質粒后，通過雙脫氧法來確定突變位置的堿基序列，確認到導入了如所設計那樣的突變。將具有序列編號8所示的堿基序列的質粒命名為pTrcLD(A113G)。序列編號8所示的堿基序列對序列編號7所示的氨基酸序列進行編碼。

(3)含有本多核苷酸(C)的重組載體

(3-1)用于堿基取代的部位特異性的突變導入

以Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 23 (2003) 239-247所記載的源自球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus) IFO3525株的對亮氨酸脫氫酶進行編碼的堿基序列為基礎，作為用于將第993號的腺嘌呤取代為胞嘧啶的突變導入引物，合成具有序列編號18所示的堿基序列(GATAGTATTCCAACCTATGTTGCGGC)的寡核苷酸(正義引物)、和具有序列編號19所示的堿基序列(GCCGCAACATAGGTTGGAATACTATC)的寡核苷酸(反義引物)。

將具有序列編號18所示的堿基序列的寡核苷酸和具有序列編號19所示的堿基序列的寡核苷酸用于引物，以實施例3(2)所述的重組載體pTrcLD(A113G)為模板，使用QuikChange II定點突變試劑盒(STRATAGENE公司制)，以下述反應液組成進行PCR。

[反應液組成]

pTrcLD(A113G)的DNA溶液 1μl

dNTP混合物(包含在上述試劑盒內) 1μl

正義引物(50μM) 0.4μl

反義引物(50μM) 0.4μl

10xbuffer(包含在上述試劑盒內) 5μl

PfuUltra (包含在上述試劑盒內) 1μl

超純水 41.2μl。

將加入有上述組成的反應液的容器安裝于熱循環儀(PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System2400)中，在95℃下保溫1分鐘后，進行12次在95℃下50秒鐘、接著在60℃下1分鐘、接著在68℃下5.5分鐘的保溫循環，然后保存在4℃下。

向所得到的PCR反應液中添加DpnI限制酶(包含在上述試劑盒內)后，在37℃下保溫1小時。使用所得到的保溫液來轉化大腸桿菌(E.coli) DH5α。

從所得到的轉化體中提取質粒后，通過雙脫氧法確定突變位置的堿基序列。將確認到導入了如所設計那樣的突變的質粒命名為pTrcLD(A113G)nd。

(3-2)含有本多核苷酸(C)的重組載體

以Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 23 (2003) 239-247所記載的源自球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus) IFO3525株的對亮氨酸脫氫酶進行編碼的堿基序列為基礎，合成具有序列編號20所示的堿基序列(GGGCATATGGAAATCTTCAAGTATATGG)的寡核苷酸引物(正義引物)、和具有序列編號21所示的堿基序列(GGATCCTTAACGGCCGTTCAAAATATT)的寡核苷酸引物(反義引物)。使用具有序列編號20所示的堿基序列的寡核苷酸引物和序列編號21所示的寡核苷酸引物，以實施例3(3-1)所述的重組載體pTrcLD(A113G)nd為模板，使用Expand High Fidelity PCR System(擴大高保真PCR系統，ロシュ?ダイアグノスティック公司制)，以下述反應液組成進行PCR。

[反應液組成]

pTrcLD(A113G)nd的DNA溶液 1μl

dNTP(各2.5mM的混合物) 1μl

引物(20pmol/μl) 各 0.4μl

5x緩沖液(具有MgCl₂) 10μl

enz.expandHiFi (3.5x10³U/ml) 0.5μl

超純水 36.7μl。

將加入有上述組成的反應液的容器安裝于熱循環儀(PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System2400)中，在94℃下保溫2分鐘后，進行10次在94℃下15秒鐘、接著在55℃下30秒鐘、接著在72℃下1.5分鐘的保溫循環，接著，進行20次在94℃下15秒鐘、接著在60℃下30秒鐘、接著在72℃下1.5分鐘的保溫循環，進一步在72℃下保持7分鐘。

其后，將上述PCR反應液的一部分供于瓊脂糖凝膠電泳。檢測到約1.1kb的DNA的帶。

向剩余的PCR反應液中添加限制酶NdeI和BamHI從而使DNA進行雙重消化，對經酶消化的約1.1kb的DNA進行純化。

使質粒載體pET-15b(ノバジェン制)通過限制酶NdeI和BamHI進行雙重消化，對經酶消化的載體DNA進行純化。

混合這些經純化的DNA，用T4 DNA連接酶進行連接，用所得到的連接液轉化大腸桿菌(E.coli) DH5α。

將所得到的轉化體在含有50μg/ml的氨比西林的LB瓊脂培養基中進行培養，從生育出的菌落當中隨機挑選10個菌落。將挑選出的菌落接種于各含有50μg/ml的氨比西林的滅菌LB培養基2ml中，在試管中，在37℃下振蕩培養17小時。使用QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen公司制)，從各培養菌體中抽提質粒。將所抽提的質粒的每一種中的一部分通過限制酶NdeI和BamHI進行雙重消化后，供于瓊脂糖凝膠電泳。在4種質粒中，確認到各自約1.1kb的DNA插入至上述載體中。以這樣的方式得到的質粒被設計為能夠表達具有下述氨基酸序列的蛋白質，所述氨基酸序列中，在重組載體pTrcLD(A113G)nd所編碼的亮氨酸脫氫酶的氨基末端添加有由包含連續6個殘基的組氨酸的20個氨基酸構成的氨基酸序列(序列編號44：MetGlySerSerHisHisHisHisHisHisSerSerGlyLeuValProArgGlySerHis)。將所得到的質粒當中之一命名為pETLD(A113G)。

(4)本蛋白質(C)

使用重組載體pETLD(A113G)來轉化大腸桿菌(E.coli) BL21(DE3)株。將所得到的轉化體接種于含有0.1mM的IPTG和50μg/ml的氨比西林的滅菌LB培養基800ml中，在30℃下振蕩培養15小時。將所得到的培養液進行離心分離，得到約6g的濕菌體。將該濕菌體約6g懸浮于包含0.5M的NaCl和5mM咪唑的20mM磷酸緩沖液(pH7.4)(即結合緩沖液)40ml中，使用マルチビーズショッカー(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmΦ)，以2500rpm進行20分鐘的破碎處理。將所得到的破碎液在8000rpm、4℃下進行10分鐘離心分離，得到離心上清液約25ml。

將約10ml的所得到的遠心上清液以5ml/分鐘的流速施于親和柱(HisTrap HP、凝膠床5ml、GEヘルスケア公司制)上。向該柱以5ml/分鐘的流速流入約25ml的結合緩沖液，使非吸附蛋白質溶出。其后，在維持流速的情況下，流入包含0.5M NaCl和29.75mM 咪唑的20mM磷酸緩沖液(pH7.4)約35ml，使非吸附蛋白質和低吸附蛋白質溶出。接著，在流入47.5ml期間，通過將咪唑濃度從29.75mM增加至500mM的梯度溶出來使吸附蛋白質溶出，分離出咪唑濃度為160mM至443mM附近的級分30ml。將所得到的級分供于Amicon Ultra-15(ミリポア公司制)，進行脫鹽濃縮和在0.5M Tris-HCl(pH9)中的緩沖液交換，得到約2ml的級分(32.6g蛋白質/L)。以下，將該級分記為亮氨酸脫氫酶(A113G)純化酶液。

實施例4(使用本發明蛋白質(A)、本發明蛋白質(B)和本蛋白質(C)的L-α-氨基酸化合物的制造)

混合實施例2(1)中制備的純化酶液(40g蛋白質/L)的2倍稀釋液0.31ml和實施例2(2)中制備的純化酶液(9g蛋白質/L)的2倍濃縮液0.31ml，用Amicon Ultra-15(ミリポア公司制)濃縮2倍。混合所得到的酶液0.31ml、2-羥基-4-(甲硫基)丁酸的鈣鹽(東京化成公司制)50mg、NAD+10mg、0.5M Tris-HCl緩沖液(pH9.0)0.04ml、硫酸銨40mg、和實施例3(4)中制備的亮氨酸脫氫酶(A113G)純化酶液(32.6g蛋白質/L)0.15ml，在30℃下振蕩1小時。針對該反應液，在下述條件下通過液相色譜進行含量分析。可知，相對于反應中使用的2-羥基-4-(甲硫基)丁酸的鈣鹽的量，生成了49.9%的L-甲硫氨酸。

(含量分析條件)

柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)

移動相：以A液(%):B液(%)=90:10的比例混合包含50mM 磷酸的12mM 1-庚磺酸鈉水溶液(A液)和乙腈(B液)

流量：0.8ml/分鐘

柱溫度：37℃

檢測：210nm。

實施例5(本發明的多核苷酸(A)、本發明重組載體(ABC)、和保有該載體的轉化體的載體)

(1)含有本發明的多核苷酸(A)的重組載體

制備具有下述堿基序列的雙鏈DNA，所述堿基序列中，分別在序列編號13所示的堿基序列的5’末端添加有堿基序列ccatggct、在3’末端添加有堿基序列ggatcc。序列編號13所示的堿基序列對序列編號3所示的氨基酸序列進行編碼。

使所制備的約1.0kb的雙鏈DNA通過限制酶NcoI和BamHI進行雙重消化，對經酶消化的DNA進行純化。

使質粒載體pTrc99A(GEヘルスケア公司制)通過限制酶NcoI和BmaHI進行雙重消化，對經酶消化的載體DNA及進行純化。

混合這些經純化的DNA，用T4 DNA連接酶進行連接，用所得到的連接液轉化大腸桿菌(E.coli) JM109株。

將所得到的轉化體在含有50μg/ml的氨比西林的LB瓊脂培養基中進行培養，從生育出的菌落當中隨機挑選8個菌落。將挑選出的菌落接種于各含有50μg/ml的氨比西林的滅菌LB培養基2ml中，在試管中，在37℃下振蕩培養17小時。使用QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen公司制)，從各培養菌體中抽提質粒。將所抽提的質粒的每一種中的一部分通過限制酶NcoI和BamHI進行雙重消化后，供于瓊脂糖凝膠電泳。在6種質粒中，確認到各自約1.0kb的DNA插入至上述載體中。確定所得到的質粒的堿基序列，將具有目標堿基序列的質粒命名為pTrc43SC。

(2)本發明重組載體(ABC)

(2-1)含有本多核苷酸(C)的重組載體

以Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 23 (2003) 239-247所記載的源自球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus) IFO3525株的亮氨酸脫氫酶的堿基序列為基礎，作為用于將第561號的鳥嘌呤取代為腺嘌呤的突變導入引物，合成具有序列編號22所示的堿基序列(CGTAGCTTACAAACTTTGCGAGTATTTAC)的寡核苷酸(正義引物)、和具有序列編號23所示的堿基序列(GTAAATACTCGCAAAGTTTGTAAGCTACG)的寡核苷酸(反義引物)。將具有序列編號22所示的堿基序列的寡核苷酸和具有序列編號23所示的堿基序列的寡核苷酸用于引物，以實施例3(3)所述的質粒pTrcLD(A113G)nd為模板，使用QuikChange II定點突變試劑盒(STRATAGENE公司制)，以下述反應液組成進行PCR。

[反應液組成]

pTrcLD(A113G)nd的DNA溶液 1μl

dNTP混合物(包含在上述試劑盒內) 1μl

正義引物(50μM) 0.4μl

反義引物(50μM) 0.4μl

10xbuffer(包含在上述試劑盒內) 5μl

PfuUltra (包含在上述試劑盒內) 1μl

超純水 41.2μl。

將加入有上述組成的反應液的容器安裝于熱循環儀(PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System2400)中，在95℃下保溫1分鐘后，進行12次在95℃下50秒鐘、接著在60℃下1分鐘、接著在68℃下5.5分鐘的保溫循環，然后保存在4℃下。

向所得到的PCR反應液中添加DpnI限制酶(包含在上述試劑盒內)后，在37℃下保溫1小時。使用所得到的保溫液來轉化大腸桿菌(E.coli) DH5α。

從所得到的轉化體中提取質粒后，通過雙脫氧法確定突變位置的堿基序列。將確認到導入了如所設計那樣的突變的質粒命名為pTrcLD(A113G)ndhd。

(2-2)含有本發明的多核苷酸(B)的重組載體

將具有序列編號24所示的堿基序列(CCATGGCTATGAAAAAGCTCTCCATCGCCC)的寡核苷酸(正義引物)和具有序列編號25所示的堿基序列(CAAGCTTGCTAGCCTTCGTGCGGCAGGGCTTC)的寡核苷酸(反義引物)用于引物，以實施例1(2)所述的質粒pET774為模板，以下述反應液組成進行PCR。

[反應液組成]

pET774的DNA溶液 1.5μl

dNTP(各2mM的混合物) 10μl

引物(50pmol/μl) 各 0.3μl

2x緩沖液 25μl

KOD-FX(1U/μl，東洋紡公司制) 1μl

超純水 11.9μl。

將加入有上述組成的反應液的容器安裝于熱循環儀(PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System 9700)中，在94℃下保溫2分鐘后，進行30次在98℃下10秒鐘、接著在60℃下30秒鐘、接著在68℃下60秒鐘的保溫循環，然后保持在4℃下。

其后，將上述PCR反應液的一部分供于瓊脂糖凝膠電泳。檢測到約1.1kb的DNA的帶。

向剩余的PCR反應液中添加限制酶NcoI和HindIII從而使DNA進行雙重消化，對經酶消化的約1.1kb的DNA進行純化。

使質粒載體pTrc99A(GEヘルスケア公司制)通過限制酶NcoI和HindIII進行雙重消化，對經酶消化的載體DNA及進行純化。

混合這些經純化的DNA，用T4 DNA連接酶進行連接，用所得到的連接液轉化大腸桿菌(E.coli) DH5α。

將所得到的轉化體在含有50μg/ml的氨比西林的LB瓊脂培養基中進行培養，從生育出的菌落當中隨機挑選8個菌落。將挑選出的菌落接種于各含有50μg/ml的氨比西林的滅菌LB培養基2ml中，在試管中，在37℃下振蕩培養17小時。使用QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen公司制)，從各培養菌體中抽提質粒。將所抽提的質粒的每一種中的一部分通過限制酶NcoI和HindIII進行雙重消化后，供于瓊脂糖凝膠電泳。在6種質粒中，確認到各自約1.1kb的DNA插入至上述載體中。將這些質粒當中之一命名為pTrc774NH。

(2-3)含有本發明的多核苷酸(B)和本多核苷酸(C)的重組載體

使用具有序列編號26所示的堿基序列(CGGATCCGAGGAAACAGACCATGG)的寡核苷酸(正義引物)和具有序列編號27所示的堿基序列(GCTGCAGCCTAGCCTTCGTGCGGCAGGGCTTC)的寡核苷酸(反義引物)，以實施例5(2-2)所述的質粒pTrc774NH為模板，以下述反應液組成進行PCR。

[反應液組成]

pTrc774NH的DNA溶液 1.5μl

dNTP(各2mM的混合物) 10μl

引物(50pmol/μl) 各 0.3μl

2x緩沖液 25μl

KOD-FX(1U/μl，東洋紡公司制) 1μl

超純水 11.9μl。

將加入有上述組成的反應液的容器安裝于熱循環儀(PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System 9700)中，在94℃下保溫2分鐘后，進行30次在98℃下10秒鐘、接著在60℃下30秒鐘、接著在68℃下60秒鐘的保溫循環，然后保持在4℃下。

其后，將上述PCR反應液的一部分供于瓊脂糖凝膠電泳。檢測到約1.1kb的DNA的帶。

向剩余的PCR反應液中添加限制酶BamHI和PstI從而使DNA進行雙重消化，對經酶消化的約1.1kb的DNA進行純化。

使實施例5(2-1)所述的質粒pTrcLD(A113G)ndhd通過限制酶BamHI和PstI進行雙重消化，對經酶消化的質粒DNA進行純化。

混合這些經純化的DNA，用T4 DNA連接酶進行連接，用所得到的連接液轉化大腸桿菌(E.coli) DH5α。

將所得到的轉化體在含有50μg/ml的氨比西林的LB瓊脂培養基中進行培養，從生育出的菌落當中隨機挑選8個菌落。將挑選出的菌落接種于各含有50μg/ml的氨比西林的滅菌LB培養基2ml中，在試管中，在37℃下振蕩培養17小時。使用QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen公司制)，從各培養菌體中抽提質粒。將所抽提的質粒的每一種中的一部分通過限制酶BamHI和PstI進行雙重消化后，供于瓊脂糖凝膠電泳。在6種質粒中，確認到各自約1.1kb的DNA插入至質粒pTrcLD(A113G)ndhd中。將這些質粒當中之一命名為pTrcLD(A113G)/774。

(2-4)含有本發明的多核苷酸(A)、本發明的多核苷酸(B)和本多核苷酸(C)的重組載體

將具有序列編號28所示的堿基序列(GCTGCAGCAGGAAACAGACCATGG)的寡核苷酸(正義引物)和序列編號29所示的堿基序列(CAAGCTTGTTAGCCACGGGCTTCCCACACC)所示的寡核苷酸(反義引物)用于引物，以實施例5(1)所述的質粒pTrc43SC為模板，使用Expand High Fidelity PCR System(擴大高保真PCR系統，ロシュ?ダイアグノスティック公司制)，以下述反應液組成進行PCR。

[反應液組成]

pTrc43SC的DNA溶液 1μl

dNTP(各2.5mM的混合物) 1μl

引物(20pmol/μl) 各 0.4μl

5x緩沖液(具有MgCl₂) 10μl

enz.expandHiFi (3.5x10³U/ml) 0.5μl

超純水 36.7μl。

將加入有上述組成的反應液的容器安裝于熱循環儀(PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System2400)中，在94℃下保溫2分鐘后，進行10次在94℃下15秒鐘、接著在65℃下30秒鐘、接著在72℃下1分鐘的保溫循環，接著，進行20次在94℃下15秒鐘、接著在70℃下30秒鐘、接著在72℃下1分鐘的保溫循環，進一步在72℃下保持7分鐘。

其后，將上述PCR反應液的一部分供于瓊脂糖凝膠電泳。檢測到約1.0kb的DNA的帶。

向剩余的PCR反應液中添加限制酶PstI和HindIII從而使DNA進行雙重消化，對經酶消化的約1.0kb的DNA進行純化。

使實施例5(2-3)所述的質粒pTrcLD(A113G)/774通過限制酶PstI和HindIII進行雙重消化，對經酶消化的質粒DNA進行純化。

混合這些經純化的DNA，用T4 DNA連接酶進行連接，用所得到的連接液轉化大腸桿菌(E.coli) DH5α。

將所得到的轉化體在含有50μg/ml的氨比西林的LB瓊脂培養基中進行培養，從生育出的菌落當中隨機挑選8個菌落。將挑選出的菌落接種于各含有50μg/ml的氨比西林的滅菌LB培養基2ml中，在試管中，在37℃下振蕩培養17小時。使用QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen公司制)，從各培養菌體中抽提質粒。將所抽提的質粒的每一種中的一部分通過限制酶PstI和HindIII進行雙重消化后，供于瓊脂糖凝膠電泳。在6種質粒中，確認到各自約1.0kb的DNA插入至質粒pTrcLD(A113G)/774中。將這些質粒當中之一命名為pTrcLD(A113G)/774/43SC。

實施例6(使用保有本發明重組載體(ABC)的轉化體的處理物的L-α-氨基酸化合物的制造)

使用質粒pTrcLD(A113G)/774/43SC來轉化大腸桿菌(E.coli) JM109株。將所得到的轉化體接種于含有0.1mM的IPTG和50μg/ml的氨比西林的滅菌LB培養基100ml中，在30℃下振蕩培養15小時。將所得到的培養液進行離心分離，得到濕菌體。將該濕菌體約0.8g懸浮于0.5M Tris-HCl緩沖液(pH9)5ml中，使用マルチビーズショッカー(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmΦ)，以2500rpm進行20分鐘的破碎處理。將所得到的破碎液在8000rpm、4℃下進行10分鐘離心分離，得到離心上清液(28g蛋白質/L)約3.5ml。

將0.34ml的所得到的離心上清液用Amicon Ultra-15(ミリポア公司制)濃縮3.4倍。混合所得到的濃縮離心上清液0.1ml、使用氨水制備為pH9的2-羥基-4-(甲硫基)丁酸(東京化成公司制)的40%水溶液0.35ml、NAD+10mg、0.5M Tris-HCl緩沖液(pH9.0)0.05ml、和硫酸銨20mg，在30℃下振蕩1小時。針對該反應液，在下述條件下通過液相色譜進行含量分析。可知，生成93.5g/L的L-甲硫氨酸。相對于反應中使用的2-羥基-4-(甲硫基)丁酸的量，L-甲硫氨酸收率為30.4%。

(含量分析條件)

柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)

移動相：以A液(%):B液(%)=90:10的比例混合包含50mM 磷酸的12mM 1-庚磺酸鈉水溶液(A液)和乙腈(B液)

流量：0.8ml/分鐘

柱溫度：37℃

檢測：210nm。

實施例7（含有編碼本發明蛋白質(A)的多核苷酸的重組載體和保有該載體的轉化體的制作）

（1）含有編碼具有序列編號3所示的氨基酸序列的本發明蛋白質(A)的多核苷酸的重組載體

（1-1）

合成具有序列編號30所示的堿基序列（CCATATGTCTCAAAAACCAAAAATCATCG）的低聚核苷酸（正義引物）、和具有序列編號31所示的堿基序列（ACTCGAGGCCACGGGCTTCCCACACCTGCG）的低聚核苷酸（反義引物）。使用具有序列編號30所示的堿基序列的低聚核苷酸引物和序列編號31所示的低聚核苷酸引物，以實施例5的（1）中記載的質粒pTrc43SC為模板，在使用了Expand High Fidelity PCR System（ロシュ?ダイアグノスティック公司制）的下述反應液組成中進行PCR。

［反應液組成］

pTrc43SC的DNA溶液 1μl

dNTP(各2.5mM的混合物) 1μl

引物(20pmol/μl) 各 0.4μl

5xbuffer(with MgCl₂) 10μl

enz.expandHiFi (3.5ｘ10³U/ml) 0.5μl

超純水 36.7μl

將放入了上述組成的反應液的容器固定于熱循環儀（PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System2400）中，在94℃保溫2分鐘后，進行10次94℃ 15秒、接著55℃ 30秒、接著72℃ 1.5分鐘的保溫循環，接著進行20次94℃ 15秒、接著60℃ 30秒、接著72℃ 1.5分鐘的保溫循環，進而在72℃保持7分鐘。

然后，將上述PCR反應液的一部分供于瓊脂糖凝膠電泳。檢測出約1.0kb的DNA條帶。

在剩余的PCR反應液中加入限制性內切酶NdeI和XhoI，使DNA雙酶切，將酶切過的約1.0kbDNA進行純化。

利用限制性內切酶NdeI和XhoI使質粒載體pET-22b（ノバジェン制）雙酶切，將酶切過的DNA進行純化。

將這些純化的DNA混合，用T4 DNA連接酶進行連接反應，用所得的連接反應液將E.coli DH5α轉化。

將所得的轉化體用含有50μg/ml的氨芐西林的LB瓊脂培養基培養，從繁殖的菌落中隨機挑選10個菌落。將挑選的菌落分別在含有50μg/ml的氨芐西林的滅菌LB培養基2ml中接種，在試驗管中于37℃振蕩培養17小時。使用QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen公司制)從各培養菌體中取出質粒。將取出的質粒各自的一部分利用限制性內切酶NdeI和XhoI雙酶切后，供于瓊脂糖凝膠電泳。確認在4個質粒中，各自約1.0kb的DNA被插入到上述載體中。將這些質粒中的1個命名為質粒pET43SCcHis。質粒pET43SCcHis以可表達具有下述氨基酸序列的蛋白質的方式被設計，所述氨基酸序列在序列編號3所示的氨基酸序列的羧基末端附加了由含有連續6個殘基的組氨酸的8個氨基酸構成的氨基酸序列（序列編號45：LeuGluHisHisHisHisHisHis）。

（1-2）

合成具有序列編號32所示的堿基序列（GCCATGGCTATGTCTCAAAAACCAAAAATC）的低聚核苷酸（正義引物）、和具有序列編號33所示的堿基序列（GGATCCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTG）的低聚核苷酸（反義引物）。使用具有序列編號32所示的堿基序列的低聚核苷酸引物和序列編號33所示的低聚核苷酸引物，以實施例7（1-1）中記載的質粒pET43SCcHis為模板，在使用了Expand High Fidelity PCR System（ロシュ?ダイアグノスティック公司制）的下述反應液中進行PCR。

［反應液組成］

pET43SCcHis的DNA溶液 1μl

dNTP(各2.5mM的混合物) 1μl

引物(20pmol/μl) 各 0.4μl

5xbuffer(with MgCl₂) 10μl

enz.expandHiFi (3.5ｘ10³U/ml) 0.5μl

超純水 36.7μl

將放入了上述組成的反應液的容器固定于熱循環儀（PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System2400）中，在94℃保溫2分鐘后，進行10次94℃ 15秒、接著55℃ 30秒、接著72℃ 1.5分鐘的保溫循環，接著進行20次94℃ 15秒、接著60℃ 30秒、接著72℃ 1.5分鐘的保溫循環，進而在72℃保持7分鐘。

然后，將上述PCR反應液的一部分供于瓊脂糖凝膠電泳。檢測出約1.0kb的DNA條帶。

在剩余的PCR反應液中加入限制性內切酶NcoI和BamHI，使DNA雙酶切，將酶切過的DNA進行純化。

利用限制性內切酶NcoI和BamHI使質粒載體pTrc99A（GE healthcare公司制）雙酶切，將酶切過的DNA進行純化。

將這些純化的DNA混合，用T4 DNA連接酶進行連接反應，用所得的連接反應液將E.coli DH5α轉化。

將所得的轉化體用含有50μg/ml的氨芐西林的LB瓊脂培養基培養，從繁殖的菌落中隨機挑選10個菌落。將挑選的菌落分別在含有50μg/ml的氨芐西林的滅菌LB培養基2ml中接種，在試驗管中于37℃振蕩培養17小時。使用QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen公司制)從各培養菌體中取出質粒。將取出的質粒各自的一部分利用限制性內切酶NcoI和BamHI雙酶切后，供于瓊脂糖凝膠電泳。確認在4個質粒中，前述約1.0kb的DNA被插入。將這些質粒中的1個命名為pTrc43SCcHis。質粒pTrc43SCcHis以可表達具有下述氨基酸序列的蛋白質的方式被設計，所述氨基酸序列在序列編號3所示的氨基酸序列的羧基末端附加了由含有連續6個殘基的組氨酸的8個氨基酸構成的氨基酸序列（序列編號45：LeuGluHisHisHisHisHisHis）。

（2）含有編碼具有改変氨基酸序列V109I的本發明蛋白質(A)的多核苷酸的重組載體

作為用于基于序列編號13所示的堿基序列、將第325位的鳥嘌呤置換為腺嘌呤的變異引入引物，合成具有序列編號34所示的堿基序列（CGCTGTTGCTGATATTACCATCGGCCTG）的低聚核苷酸（正義引物）、和具有序列編號35所示的堿基序列（CAGGCCGATGGTAATATCAGCAACAGCG）的低聚核苷酸（反義引物）。序列編號13所示的堿基序列中的第325位的鳥嘌呤向腺嘌呤的置換導致序列編號3所示的氨基酸序列中的第109位的纈氨酸向異亮氨酸的置換。

將具有序列編號34所示的堿基序列的低聚核苷酸和具有序列編號35所示的堿基序列的低聚核苷酸用于引物，以實施例7（1-2）中記載的質粒pTrc43SCcHis為模板，在使用了QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE公司制）的下述反應液組成中進行PCR。

［反應液組成］

pTrc43SCcHis的DNA溶液　　　　 1μl

dNTP mix（包含在上述Kit中）　　 1μl

正義引物（50μM）　　　　　 0.4μl

反義引物（50μM）　 　0.4μl

10ｘbuffer（包含在上述Kit中）　　5μl

PfuUltra （包含在上述Kit中）　 1μl

超純水　　　　　　　　　　　　41.2μl

將放入了上述組成的反應液的容器固定于熱循環儀（PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System2400）中，在95℃保溫1分鐘后，進行12次95℃ 50秒、接著60℃ 1分鐘、接著68℃ 5.5分鐘的保溫循環后，在4℃保存。

在所得的PCR反應液中，添加1μl的DpnI 限制性內切酶（包含在上述Kit中）后，在37℃保溫1小時。使用所得的保溫液將E.coli DH5α轉化。

從所得的轉化體中抽提質粒后，利用雙脫氧法確定變異處的堿基序列。將確認有如設計那樣的變異被導入的質粒命名為pTrc43SCcHis-g325a。質粒pTrc43SCcHis-g325a以可表達具有下述氨基酸序列的蛋白質的方式被設計，所述氨基酸序列在改變(altered)的氨基酸序列的羧基末端附加了由含有連續6個殘基的組氨酸的8個氨基酸構成的氨基酸序列（序列編號45：LeuGluHisHisHisHisHisHis），所述改變(altered)的氨基酸序列是在序列編號3所示的氨基酸序列中第109位的纈氨酸置換為異亮氨酸的氨基酸序列。

（3）含有編碼具有改変氨基酸序列G191D的本發明蛋白質(A)的多核苷酸的重組載體

作為用于基于序列編號13所示的堿基序列、將第572位的鳥嘌呤置換為腺嘌呤的變異引入引物，合成具有序列編號36所示的堿基序列（GGCGGCATACGTCGATCGTGACGAGCTG）的低聚核苷酸（正義引物）、和具有序列編號37所示的堿基序列（CAGCTCGTCACGATCGACGTATGCCGCC）的低聚核苷酸（反義引物）。序列編號13所示的堿基序列中的第572位的鳥嘌呤向腺嘌呤的置換導致序列編號3所示的氨基酸序列中的第191位的甘氨酸向天冬氨酸的置換。

將具有序列編號36所示的堿基序列的低聚核苷酸和具有序列編號37所示的堿基序列的低聚核苷酸用于引物，以實施例7（1-2）中記載的質粒pTrc43SCcHis為模板，在使用了QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE公司制）的以下的反應液組成中進行PCR。

［反應液組成］

pTrc43SCcHis的DNA溶液　　　　 1μl

dNTP mix（包含在上述Kit中）　　 1μl

正義引物（50μM）　　　　 　0.4μl

反義引物（50μM）　 　 0.4μl

10ｘbuffer（包含在上述Kit中）　　5μl

PfuUltra （包含在上述Kit中） 　1μl

超純水　　　　　　　　　　　　41.2μl

將放入了上述組成的反應液的容器固定于熱循環儀（PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System2400）中，在95℃保溫1分鐘后，進行12次95℃ 50秒、接著60℃ 1分鐘、接著68℃ 5.5分鐘的保溫循環后，在4℃保存。

在所得的PCR反應液中添加1μl的DpnI 限制性內切酶（包含在上述Kit中）后，在37℃保溫1小時。使用所得的保溫液將E.coli DH5α轉化。

從所得的轉化體中抽提質粒后，利用雙脫氧法確定變異處的堿基序列。將確認有如設計那樣的變異被導入的質粒命名為pTrc43SCcHis-g572a。質粒pTrc43SCcHis-g572a以可表達具有下述氨基酸序列的蛋白質的方式被設計，所述氨基酸序列在改變(altered)的氨基酸序列的羧基末端附加了由含有連續6個殘基的組氨酸的8個氨基酸構成的氨基酸序列（序列編號45：LeuGluHisHisHisHisHisHis），所述改變(altered)的氨基酸序列是在序列編號3所示的氨基酸序列中第191位的甘氨酸置換為天冬氨酸的氨基酸序列。

（4）含有編碼具有改変氨基酸序列Q246R的本發明蛋白質(A)的多核苷酸的重組載體

作為用于基于序列編號13所示的堿基序列、將第737位的腺嘌呤置換為鳥嘌呤的變異引入引物，合成具有序列編號38所示的堿基序列（GCAGCACTGGTACGGGCACTGCGCTCTG）的低聚核苷酸（正義引物）、和具有序列編號39所示的堿基序列（CAGAGCGCAGTGCCCGTACCAGTGCTGC）的低聚核苷酸（反義引物）。序列編號13所示的堿基序列中的第737位的腺嘌呤向鳥嘌呤的置換導致序列編號3所示的氨基酸序列中的第246位的谷氨酰胺向精氨酸的置換。

將具有序列編號38所示的堿基序列的低聚核苷酸和具有序列編號39所示的堿基序列的低聚核苷酸用于引物，以實施例7（1-2）中記載的質粒pTrc43SCcHis為模板，在使用了QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE公司制）的以下的反應液組成中進行PCR。

［反應液組成］

pTrc43SCcHis的DNA溶液　　　　 1μl

dNTP mix（包含在上述Kit中）　 　1μl

正義引物（50μM）　　　　 　0.4μl

反義引物（50μM）　 　0.4μl

10ｘbuffer（包含在上述Kit中）　　5μl

PfuUltra （包含在上述Kit中）　 1μl

超純水　　　　　　　　　　　　41.2μl

將放入了上述組成的反應液的容器固定于熱循環儀（PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System2400）中，在95℃保溫1分鐘后，進行12次95℃ 50秒、接著60℃ 1分鐘、接著68℃ 5.5分鐘的保溫循環后，在4℃保存。

在所得的PCR反應液中添加1μl的DpnI 限制性內切酶（包含在上述Kit中）后，在37℃保溫1小時。使用所得的保溫液將E.coli DH5α轉化。

從所得的轉化體中抽提質粒后，利用雙脫氧法確定變異處的堿基序列。將確認有如設計那樣的變異被導入的質粒命名為pTrc43SCcHis-a737g。質粒pTrc43SCcHis-a737g以可表達具有下述氨基酸序列的蛋白質的方式被設計，所述氨基酸序列在改變(altered)的氨基酸序列的羧基末端附加了由含有連續6個殘基的組氨酸的8個氨基酸構成的氨基酸序列（序列編號45：LeuGluHisHisHisHisHisHis），所述改變(altered)的氨基酸序列是在序列編號3所示的氨基酸序列中第246位的谷氨酰胺置換為精氨酸的氨基酸序列。

（5）含有編碼具有改変氨基酸序列V109I/G191D的本發明蛋白質(A)的多核苷酸的重組載體

引物使用用于將序列編號13所示的堿基序列中的第572位的鳥嘌呤變換為腺嘌呤的變異引入引物、即具有序列編號36所示的堿基序列的低聚核苷酸和具有序列編號37所示的堿基序列的低聚核苷酸，以實施例7（2）中記載的質粒pTrc43SCcHis-g325a為模板，在使用了QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE公司制）的以下的反應液組成中進行PCR。

［反應液組成］

pTrc43SCcHis-g325a的DNA溶液　 1μl

dNTP mix（包含在上述Kit中）　 　1μl

正義引物（50μM）　　　　　 0.4μl

反義引物（50μM）　 　0.4μl

10ｘbuffer（包含在上述Kit中）　　5μl

PfuUltra （包含在上述Kit中）　 1μl

超純水　　　　　　　　　　　　41.2μl

將放入了上述組成的反應液的容器固定于熱循環儀（PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System2400）中，在95℃保溫1分鐘后，進行12次95℃ 50秒、接著60℃ 1分鐘、接著68℃ 5.5分鐘的保溫循環后，在4℃保存。

在所得的PCR反應液中添加1μl的DpnI 限制性內切酶（包含在上述Kit中）后，在37℃保溫1小時。使用所得的保溫液將E.coli DH5α轉化。

從所得的轉化體中抽提質粒后，利用雙脫氧法確定變異處的堿基序列。將確認有如設計那樣的變異被導入的質粒命名為pTrc43SCcHis-g325a/g572a。質粒pTrc43SCcHis-g325a/g572a以可表達具有下述氨基酸序列的蛋白質的方式被設計，所述氨基酸序列在改變(altered)的氨基酸序列的羧基末端附加了由含有連續6個殘基的組氨酸的8個氨基酸構成的氨基酸序列（序列編號45：LeuGluHisHisHisHisHisHis），所述改變(altered)的氨基酸序列是在序列編號3所示的氨基酸序列中第109位的纈氨酸置換為異亮氨酸和第191位的甘氨酸置換為天冬氨酸的氨基酸序列。

（6）含有編碼具有改変氨基酸序列V109I/Q246R的本發明蛋白質(A)的多核苷酸的重組載體

引物使用用于將序列編號13所示的堿基序列中的第737位的鳥嘌呤變換為腺嘌呤的變異引入引物、即具有序列編號38所示的堿基序列的低聚核苷酸和具有序列編號39所示的堿基序列的低聚核苷酸，以實施例7（2）中記載的質粒pTrc43SCcHis-g325a為模板，在使用了QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE公司制）的以下的反應液組成中進行PCR。

［反應液組成］

pTrc43SCcHis-g325a的DNA溶液　 1μl

dNTP mix（包含在上述Kit中）　 　1μl

正義引物（50μM）　　　　 　0.4μl

反義引物（50μM）　 　0.4μl

10ｘbuffer（包含在上述Kit中）　　5μl

PfuUltra （包含在上述Kit中）　 1μl

超純水　　　　　　　　　　　　41.2μl

將放入了上述組成的反應液的容器固定于熱循環儀（PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System2400）中，在95℃保溫1分鐘后，進行12次95℃ 50秒、接著60℃ 1分鐘、接著68℃ 5.5分鐘的保溫循環后，在4℃保存。

在所得的PCR反應液中添加1μl的DpnI 限制性內切酶（包含在上述Kit中）后，在37℃保溫1小時。使用所得的保溫液將E.coli DH5α轉化。

從所得的轉化體中抽提質粒后，利用雙脫氧法確定變異處的堿基序列。將確認有如設計那樣的變異被導入的質粒命名為pTrc43SCcHis-g325a/a737g。質粒pTrc43SCcHis-g325a/a737g以可表達具有下述氨基酸序列的蛋白質的方式被設計，所述氨基酸序列在改變(altered)的氨基酸序列的羧基末端附加了由含有連續6個殘基的組氨酸的8個氨基酸構成的氨基酸序列（序列編號45：LeuGluHisHisHisHisHisHis），所述改變(altered)的氨基酸序列是在序列編號3所示的氨基酸序列中第109位的纈氨酸置換為異亮氨酸和第246位的谷氨酰胺置換為精氨酸的氨基酸序列。

（7）含有編碼具有改変氨基酸序列G191D/Q246R的本發明蛋白質(A)的多核苷酸的重組載體

引物使用用于將序列編號13所示的堿基序列中的第737位的鳥嘌呤變換為腺嘌呤的變異引入引物、即具有序列編號38所示的堿基序列的低聚核苷酸和具有序列編號39所示的堿基序列的低聚核苷酸，以實施例7（3）中記載的質粒pTrc43SCcHis-g572a為模板，在使用了QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE公司制）的以下的反應液組成中進行PCR。

［反應液組成］

pTrc43SCcHis-g572a的DNA溶液　 1μl

dNTP mix（包含在上述Kit中）　　 1μl

正義引物（50μM）　　　　 　0.4μl

反義引物（50μM）　 　0.4μl

10ｘbuffer（包含在上述Kit中）　　5μl

PfuUltra （包含在上述Kit中）　 1μl

超純水　　　　　　　　　　　　41.2μl

將放入了上述組成的反應液的容器固定于熱循環儀（PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System2400）中，在95℃保溫1分鐘后，進行12次95℃ 50秒、接著60℃ 1分鐘、接著68℃ 5.5分鐘的保溫循環后，在4℃保存。

在所得的PCR反應液中添加1μl的DpnI 限制性內切酶（包含在上述Kit中）后，在37℃保溫1小時。使用所得的保溫液將E.coli DH5α轉化。

從所得的轉化體中抽提質粒后，利用雙脫氧法確定變異處的堿基序列。將確認有如設計那樣的變異被導入的質粒命名為pTrc43SCcHis-g572a/a737g。質粒pTrc43SCcHis-g572a/a737g以可表達具有下述氨基酸序列的蛋白質的方式被設計，所述氨基酸序列在改變(altered)的氨基酸序列的羧基末端附加了由含有連續6個殘基的組氨酸的8個氨基酸構成的氨基酸序列（序列編號45：LeuGluHisHisHisHisHisHis），所述改變(altered)的氨基酸序列是在序列編號3所示的氨基酸序列中第191位的甘氨酸置換為天冬氨酸和第246位的谷氨酰胺置換為精氨酸的氨基酸序列。

（8）含有編碼具有改変氨基酸序列V109I/G191D/Q246R的本發明蛋白質(A)的多核苷酸的重組載體

引物使用用于將序列編號13所示的堿基序列中的第737位的腺嘌呤變換為鳥嘌呤的變異引入引物、即具有序列編號38所示的堿基序列的低聚核苷酸和具有序列編號39所示的堿基序列的低聚核苷酸，以實施例7（5）中記載的質粒pTrc43SCcHis-g325a/g572a為模板，在使用了QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE公司制）的以下的反應液組成中進行PCR。

［反應液組成］

pTrc43SCcHis-g325a/g572a的DNA溶液 1μl

dNTP mix（包含在上述Kit中）　 　1μl

正義引物（50μM）　　　　 　0.4μl

反義引物（50μM）　 　0.4μl

10ｘbuffer（包含在上述Kit中）　 　5μl

PfuUltra （包含在上述Kit中）　 　1μl

超純水　　　　　　　　　　　　　 　41.2μl

將放入了上述組成的反應液的容器固定于熱循環儀（PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System2400）中，在95℃保溫1分鐘后，進行12次95℃ 50秒、接著60℃ 1分鐘、接著68℃ 5.5分鐘的保溫循環后，在4℃保存。

在所得的PCR反應液中添加1μl的DpnI 限制性內切酶（包含在上述Kit中）后，在37℃保溫1小時。使用所得的保溫液將E.coli DH5α轉化。

從所得的轉化體中抽提質粒后，利用雙脫氧法確定變異處的堿基序列。將確認有如設計那樣的變異被導入的質粒命名為pTrc43SCcHis-g325a/g572a/a737g。質粒pTrc43SCcHis-g325a/g572a/a737g以可表達具有下述氨基酸序列的蛋白質的方式被設計，所述氨基酸序列在改變(altered)的氨基酸序列的羧基末端附加了由含有連續6個殘基的組氨酸的8個氨基酸構成的氨基酸序列（序列編號45：LeuGluHisHisHisHisHisHis），所述改變(altered)的氨基酸序列是在序列編號3所示的氨基酸序列中第109位的纈氨酸置換為異亮氨酸、第191位的甘氨酸置換為天冬氨酸和第246位的谷氨酰胺置換為精氨酸的氨基酸序列。

實施例8（本發明蛋白質(A)的熱穩定性評價）

（1）

使用質粒pTrc43SCcHis、pTrc43SCcHis-g325a/g572a、pTrc43SCcHis-g325a/a737g、或者質粒pTrc43SCcHis-g325a/g572a/a737g，將E.coli JM109株進行轉化。將所得的轉化體分別在含有0.1mM的IPTG和50μg/ml氨芐西林的滅菌LB培養基20ml接種，在30℃振蕩培養15小時。將所得的各培養液離心分離，得到約0.1g的濕菌體。將濕菌體各自約0.1g分別懸浮于含有0.5M的NaCl和5mM咪唑的20mM磷酸緩沖液（pH7.4）（即，結合緩沖液）1ml中，使用多珠搖床（安井器械公司制）和玻璃珠（0.1mmΦ），以2500rpm進行20分鐘的破碎處理。將所得的破碎液在13000rpm、4℃的條件下進行10分鐘離心分離，得到各自的離心上清液約0.7ml。

在所得的各自的離心上清液中補加約0.3ml的結合緩沖液，形成為約1ml后，將其施加于親和柱（HisTrap HP、凝膠床1ml、GE healthcare公司制）上。在該柱子中流過約3ml的結合緩沖液，使非吸附蛋白質洗脫。然后，使含有0.5M NaCl和500mM 咪唑的20mM磷酸緩沖液（pH7.4）約2ml流過，使各自的吸附蛋白質洗脫，收集洗脫液。將各自的洗脫液約2ml供于Amicon Ultra-15（Millipore公司制)，進行脫鹽濃縮和向0.5M Tris-HCl（pH9）的緩沖液交換，得到各自約0.4ml的純化酶液。測定各自的純化酶液的蛋白質濃度。來自導入pTrc43SCcHis的轉化體的純化酶液的蛋白質濃度為3.1g蛋白質/L，來自導入pTrc43SCcHis-g325a/g572a的轉化體的純化酶液的蛋白質濃度為2.5g蛋白質/L，來自導入pTrc43SCcHis-g325a/a737g的轉化體的純化酶液的蛋白質濃度為3.1g蛋白質/L，來自導入pTrc43SCcHis-g325a/g572a/a737g的轉化體的純化酶液的蛋白質濃度為3.2g蛋白質/L。

將所得的純化酶液分別以形成為0.45g蛋白質/L的方式稀釋，將所得的稀釋酶液0.06ml在41℃熱處理30分鐘后，冷卻至4℃。將所得的酶液0.045ml和0.5M Tris-HCl緩沖液（pH9.0）0.055ml混合，以使2-羥基-4-（甲硫基）丁酸鈣（東京化成公司制）為47mM、NAD＋為3.2mM的方式進行添加，在30℃保溫。以340nm的波長每10秒測定一次前述反應液的吸光度，測定約10分鐘。將1分鐘使1μmol的NAD+還原的酶量設為1U，求得酶活性。作為對照，使用沒有進行熱處理的稀釋酶液同樣進行反應，測定反應液的吸光度，求得酶活性。將使用了沒有進行熱處理的稀釋酶液的反應中的酶活性設為100％，算出熱處理過的稀釋酶液的殘留活性。結果示于表2。

[表2]

（2）使用質粒pTrc43SCcHis、pTrc43SCcHis-g325a、pTrc43SCcHis-g572a、pTrc43SCcHis-a737g、pTrc43SCcHis-g325a/g572a、pTrc43SCcHis-g572a/a737g、pTrc43SCcHis-g325a/a737g、或者質粒pTrc43SCcHis-g325a/g572a/a737g，將E.coli JM109株進行轉化。將所得的轉化體分別在含有0.1mM的IPTG和50μg/ml的氨芐西林的滅菌LB培養基20ml中接種，在30℃振蕩培養15小時。將所得的各培養液離心分離，得到約0.1g的濕菌體。將濕菌體各自約0.1g分別懸浮于含有0.5M的NaCl和5mM咪唑的20mM磷酸緩沖液（pH7.4）（即，結合緩沖液）1ml中，使用多珠搖床（安井器械公司制）和玻璃珠（0.1mmΦ），以2500rpm進行20分鐘的破碎處理。將所得的破碎液在12000rpm、4℃的條件下進行10分鐘的離心分離，分別得到離心上清液約0.7ml。

（3）在所得的各自的離心上清液中補加約0.3ml的結合緩沖液，形成為約1ml后，將其施加于親和柱（HisTrap HP、凝膠床1ml、GE healthcare公司制）上。在該柱子中流過約3ml的結合緩沖液，使非吸附蛋白質洗脫。然后，使含有0.5M NaCl和500mM 咪唑的20mM磷酸緩沖液（pH7.4）約2ml流過，使各自的吸附蛋白質洗脫，收集洗脫液。將各自的洗脫液約2ml供于Amicon Ultra-15（Millipore公司制)，進行脫鹽濃縮和向0.5M Tris-HCl（pH9）的緩沖液交換，得到各自約0.4ml的純化酶液。測定各自的純化酶液的蛋白質濃度。來自導入pTrc43SCcHis的轉化體的純化酶液的蛋白質濃度為2.3g蛋白質/L，來自導入pTrc43SCcHis-g325a的轉化體的純化酶液的蛋白質濃度為2.9g蛋白質/L，來自導入pTrc43SCcHis-g572a的轉化體的純化酶液的蛋白質濃度為2.9g蛋白質/L，來自pTrc43SCcHis-a737g轉化體的純化酶液的蛋白質濃度為4.2g蛋白質/L，來自導入pTrc43SCcHis-g325a/g572a的轉化體的純化酶液的蛋白質濃度為2.1g蛋白質/L，來自導入pTrc43SCcHis-g572a/a737g的轉化體的純化酶液的蛋白質濃度為3.3g蛋白質/L，來自導入pTrc43SCcHis-g325a/a737g的轉化體的純化酶液的蛋白質濃度為2.6g蛋白質/L，來自導入pTrc43SCcHis-g325a/g572a/a737g的轉化體的純化酶液的蛋白質濃度為2.7g蛋白質/L。

將所得的純化酶液分別以形成為0.45g蛋白質/L的方式稀釋，將所得的稀釋酶液0.06ml在40.5℃熱處理30分鐘后，冷卻至4℃。將所得的酶液0.045ml和0.5M Tris-HCl緩沖液（pH9.0）0.055ml混合，以使2-羥基-4-（甲硫基）丁酸鈣（東京化成公司制）為47mM、NAD＋為3.2mM的方式進行添加，在30℃保溫。以340nm的波長每10秒測定一次前述反應液的吸光度，測定約10分鐘。將1分鐘使1μmol的NAD+還原的酶量設為1U，求得酶活性。作為對照，使用沒有進行熱處理的稀釋酶液同樣進行反應，測定反應液的吸光度，求得酶活性。將使用了沒有進行熱處理的稀釋酶液的反應中的酶活性設為100％，算出熱處理過的稀釋酶液的殘留活性。結果示于表3。

[表3]

實施例9（本發明重組載體(ABC)和保有該載體的轉化體的制作）（1）含有編碼具有序列編號3所示的氨基酸序列的本發明蛋白質(A)的多核苷酸的本發明重組載體(ABC)

（1-1）含有本多核苷酸(C)的重組載體

作為用于基于Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 23 (2003) 239-247中記載的源于Bacillus sphaericus IFO3525株的亮氨酸脫氫酶的堿基序列、將第561位的鳥嘌呤變換為腺嘌呤的變異引入引物，合成具有序列編號22所示的堿基序列（CGTAGCTTACAAACTTTGCGAGTATTTAC）的低聚核苷酸（正義引物）、和具有序列編號23所示的堿基序列（GTAAATACTCGCAAAGTTTGTAAGCTACG）的低聚核苷酸（反義引物）。

將具有序列編號22所示的堿基序列的低聚核苷酸和具有序列編號23所示的堿基序列的低聚核苷酸用于引物，以實施例3的（3-2）中記載的質粒pETLD(A113G)為模板，在使用了QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE公司制）的以下的反應液組成中進行PCR。

［反應液組成］

pETLD(A113G)的DNA溶液　　　　 1μl

dNTP mix（包含在上述Kit中）　　 1μl

正義引物（50μM）　　　　　 0.4μl

反義引物（50μM）　 　0.4μl

10ｘbuffer（包含在上述Kit中）　　5μl

PfuUltra （包含在上述Kit中）　 1μl

超純水　　　　　　　　　　　　41.2μl。

［PCR反應條件］

將放入了上述反應液組成的反應液的容器固定于熱循環儀（PERKIN ELMER-GeneAmp PCR Sｙstem2400）中，在95℃保溫1分鐘后，進行12次95℃ 50秒、接著60℃ 1分鐘、接著68℃ 6.8分鐘的保溫循環后，在4℃保存。

在所得的PCR反應液中添加1μl的DpnI限制性內切酶（包含在上述Kit中）后，在37℃保溫1小時。使用所得的保溫液將E.coli DH5α轉化。

從所得的轉化體中抽提質粒后，利用雙脫氧法確定變異處的堿基序列。將確認有如設計那樣的變異被導入了的質粒命名為pETLD(A113G)hd。

在質粒pETLD(A113G)hd中加入限制性內切酶NcoI和BamHI，使該質粒DNA雙酶切，將酶切過的約1.1kb的DNA純化。

利用限制性內切酶NcoI和BamHI使質粒載體pTrc99A（GE healthcare公司制）雙酶切，將酶切過的載體DNA純化。

將這些純化的DNA混合，用T4 DNA連接酶進行連接反應，用所得的連接反應液將E.coli DH5α轉化。

將所得的轉化體用含有50μg/ml的氨芐西林的LB瓊脂培養基培養，從繁殖的菌落中隨機挑選10個菌落。將挑選的菌落分別在含有50μg/ml的氨芐西林的滅菌LB培養基2ml中接種，在試驗管中于37℃振蕩培養17小時。使用QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen公司制)從各培養菌體中取出質粒。將取出的質粒各自的一部分利用限制性內切酶NcoI和BamHI雙酶切后，供于瓊脂糖凝膠電泳。確認在4個質粒中，約1.1kb的DNA被插入到上述載體中。將這些質粒中的1個命名為pTrcLD(A113G)nh。質粒pTrcLD(A113G)nh以可表達具有下述氨基酸序列的蛋白質的方式被設計，所述氨基酸序列在序列編號7所示的氨基酸序列的氨基末端附加了由含有連續6個殘基的組氨酸的20個氨基酸構成的氨基酸序列（序列編號44：MetGlySerSerHisHisHisHisHisHisSerSerGlyLeuValProArgGlySerHis）。

（1-2）含有本發明多核苷酸(B)的重組載體

將具有序列編號24所示的堿基序列（CCATGGCTATGAAAAAGCTCTCCATCGCCC）的低聚核苷酸（正義引物）和具有序列編號40所示的堿基序列（GCTGCAGCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTG）的低聚核苷酸（反義引物）用于引物，以實施例1的（2）中記載的質粒pET774為模板，在下述反應液組成中進行PCR。

［反應液組成］

質粒pET774的DNA溶液 1.5μl

dNTP(各2mM的混合物) 10μl

引物(50pmol/μl) 各 0.3μl

2xbuffer 　25μl

KOD-FX(1U/μl、東洋紡公司制) 1μl

超純水 　11.9μl

將放入了上述組成的反應液的容器固定于熱循環儀（PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System 9700）中，在94℃保溫2分鐘后，進行30次98℃ 10秒、接著60℃ 30秒、接著68℃ 60秒的保溫循環后，在4℃保持。

然后，將上述PCR反應液的一部分供于瓊脂糖凝膠電泳。檢測出約1.1kb的DNA條帶。

在剩余的PCR反應液中加入限制性內切酶NcoI和PstI，使DNA雙酶切，將酶切過的約1.1kbDNA進行純化。

利用限制性內切酶NcoI和PstI使質粒載體pTrc99A（GE healthcare公司制）雙酶切，將酶切過的載體DNA進行純化。

將這些純化了的DNA混合，用T4 DNA連接酶進行連接反應，用所得的連接反應液將E.coli DH5α轉化。

將所得的轉化體用含有50μg/ml的氨芐西林的LB瓊脂培養基培養，從繁殖的菌落中隨機挑選8個菌落。將挑選的菌落分別在含有50μg/ml的氨芐西林的滅菌LB培養基2ml中接種，在試驗管中于37℃振蕩培養17小時。使用QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen公司制)從各培養菌體中取出質粒。將取出的質粒各自的一部分利用限制性內切酶NcoI和PstI雙酶切后，供于瓊脂糖凝膠電泳。確認在6個質粒中，約1.1kb的DNA被插入到上述載體中。將這些質粒中的1個命名為pTrc774chNP。質粒pTrc774chNP以可表達具有下述氨基酸序列的蛋白質的方式被設計，所述氨基酸序列在序列編號1所示的氨基酸序列的羧基末端附加了由含有連續6個殘基的組氨酸的8個氨基酸構成的氨基酸序列（序列編號45：LeuGluHisHisHisHisHisHis）。

（1-3）含有本發明多核苷酸(B)和本多核苷酸(C)的重組載體

將具有序列編號26所示的堿基序列（CGGATCCGAGGAAACAGACCATGG）的低聚核苷酸（正義引物）和具有序列編號40所示的堿基序列（GCTGCAGCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTG）所示的低聚核苷酸（反義引物）用于引物，以實施例9（1-2）中記載的質粒pTrc774chNP為模板，在下述反應液組成中進行PCR。

［反應液組成］

pTrc774chNP的DNA溶液 1.5μl

dNTP(各2mM的混合物) 10μl

引物(50pmol/μl) 各 0.3μl

2xbuffer 　25μl

KOD-FX(1U/μl、東洋紡公司制) 1μl

超純水 　 11.9μl

將放入了上述組成的反應液的容器固定于熱循環儀（PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System 9700）中，在94℃保溫2分鐘后，進行30次98℃ 10秒、接著60℃ 30秒、接著68℃ 60秒的保溫循環后，在4℃保持。

然后，將上述PCR反應液的一部分供于瓊脂糖凝膠電泳。檢測出約1.1kb的DNA條帶。

在剩余的PCR反應液中加入限制性內切酶BamHI和PstI，使DNA雙酶切，將酶切過的約1.1kb的DNA進行純化。

利用限制性內切酶BamHI和PstI使實施例9（1-1）中記載的質粒pTrcLD(A113G)nh雙酶切，將酶切過的質粒DNA進行純化。

將這些純化的DNA混合，用T4 DNA連接酶進行連接反應，用所得的連接反應液將E.coli DH5α轉化。

將所得的轉化體用含有50μg/ml的氨芐西林的LB瓊脂培養基培養，從繁殖的菌落中隨機挑選8個菌落。將挑選的菌落分別在含有50μg/ml的氨芐西林的滅菌LB培養基2ml中接種，在試驗管中于37℃振蕩培養17小時。使用QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen公司制)從各培養菌體中取出質粒。將取出的質粒各自的一部分利用限制性內切酶BamHI和PstI雙酶切后，供于瓊脂糖凝膠電泳。確認在6個質粒中，約1.1kb的DNA被插入到質粒pTrcLD(A113G)nh中。將這些質粒中的1個命名為質粒pTrcLD(A113G)nh/774ch。

（1-4）含有本發明多核苷酸(A)的重組載體

合成具有序列編號32所示的堿基序列（GCCATGGCTATGTCTCAAAAACCAAAAATC）的低聚核苷酸（正義引物）、和具有序列編號41所示的堿基序列（CAAGCTTGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTG）的低聚核苷酸（反義引物）。使用具有序列編號32所示的堿基序列的低聚核苷酸引物和序列編號41所示的低聚核苷酸引物，以實施例7的（1-1）中記載的質粒pET43SCcHis為模板，在使用了Expand High Fidelity PCR System(ロシュ?ダイアグノスティック公司制)的下述反應液組成中進行PCR。

［反應液組成］

pET43SCcHis的DNA溶液 　 　1μl

dNTP(各2.5mM的混合物) 1μl

引物(20pmol/μl) 各 0.4μl

5xbuffer(with MgCl₂) 　10μl

enz.expandHiFi (3.5ｘ10³U/ml) 0.5μl

超純水 　　 　36.7μl

將放入了上述組成的反應液的容器固定于熱循環儀（PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System2400）中，在94℃保溫2分鐘后，進行10次94℃ 15秒、接著55℃ 30秒、接著72℃ 1.5分鐘的保溫循環，接著進行20次94℃ 15秒、接著60℃ 30秒、接著72℃ 1.5分鐘的保溫循環，進而在72℃保持7分鐘。

然后，將上述PCR反應液的一部分供于瓊脂糖凝膠電泳。檢測出約1.0kb的DNA條帶。

在剩余的PCR反應液中加入限制性內切酶NcoI和HindIII，使DNA雙酶切，將酶切過的約1.0kb的DNA進行純化。

利用限制性內切酶NcoI和HindIII使質粒載體pTrc99A（GE healthcare公司制）雙酶切，將酶切過的載體DNA進行純化。

將這些純化的DNA混合，用T4 DNA連接酶進行連接反應，用所得的連接反應液將E.coli DH5α轉化。

將所得的轉化體用含有50μg/ml的氨芐西林的LB瓊脂培養基培養，從繁殖的菌落中隨機挑選10個菌落。將挑選的菌落分別在含有50μg/ml的氨芐西林的滅菌LB培養基2ml中接種，在試驗管中于37℃振蕩培養17小時。使用QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen公司制)從各培養菌體中取出質粒。將取出的質粒各自的一部分利用限制性內切酶NcoI和HindIII雙酶切后，供于瓊脂糖凝膠電泳。確認在4個質粒中，約1.0kb的DNA被插入到上述載體中。將這些質粒中的1個命名為pTrc43SCchNH。質粒pTrc43SCchNH以可表達具有下述氨基酸序列的蛋白質的方式被設計，所述氨基酸序列在序列編號3所示的氨基酸序列的羧基末端附加了由含有連續6個殘基的組氨酸的8個氨基酸構成的氨基酸序列（序列編號45：LeuGluHisHisHisHisHisHis）。

（1-5）含有本發明多核苷酸(A)、本發明多核苷酸(B)和本多核苷酸(C)的重組載體

將具有序列編號28所示的堿基序列（GCTGCAGCAGGAAACAGACCATGG）的低聚核苷酸（正義引物）和具有序列編號41所示的堿基序列（CAAGCTTGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTG）的低聚核苷酸（反義引物）用于引物，以實施例9（1-4）中記載的質粒pTrc43SCchNH作為模板，在使用了Expand High Fidelity PCR System(ロシュ?ダイアグノスティック公司制)的下述反應液組成中進行PCR。

［反應液組成］

pTrc43SCchNH的DNA溶液 1μl

dNTP(各2.5mM的混合物) 1μl

引物(20pmol/μl) 各 0.4μl

5xbuffer(with MgCl₂) 　10μl

enz.expandHiFi (3.5ｘ10³U/ml) 0.5μl

超純水 　　　 36.7μl

將放入了上述組成的反應液的容器固定于熱循環儀（PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System2400）中，在94℃保溫2分鐘后，進行10次94℃ 15秒、接著65℃ 30秒、接著72℃ 1分鐘的保溫循環，接著進行20次94℃ 15秒、接著70℃ 30秒、接著72℃ 1分鐘的保溫循環，進而在72℃保持7分鐘。

然后，將上述PCR反應液的一部分供于瓊脂糖凝膠電泳。檢測出約1.0kb的DNA條帶。

在剩余的PCR反應液中加入限制性內切酶PstI和HindIII，使DNA片段雙酶切，將酶切過的約1.0kbDNA進行純化。

利用限制性內切酶PstI和HindIII使實施例9（1-3）中記載的質粒pTrcLD(A113G)nh/774ch雙酶切，將酶切過的質粒DNA進行純化。

將這些純化了的DNA混合，用T4 DNA連接酶進行連接反應，用所得的連接反應液將E.coli DH5α轉化。

將所得的轉化體用含有50μg/ml的氨芐西林的LB瓊脂培養基培養，從繁殖的菌落中隨機挑選8個菌落。將挑選的菌落分別在含有50μg/ml的氨芐西林的滅菌LB培養基2ml中接種，在試驗管中于37℃振蕩培養17小時。使用QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen公司制)從各培養菌體中取出質粒。將取出的質粒各自的一部分利用限制性內切酶PstI和HindIII雙酶切后，供于瓊脂糖凝膠電泳。確認在6個質粒中，約1.0kb的DNA被插入到質粒pTrcLD(A113G)nh/774ch中。將這些質粒中的1個命名為pTrcLD(A113G)nh/774ch/43SCch。

（2）含有編碼具有改変氨基酸序列V109I/G191D/Q246R的本發明蛋白質(A)的多核苷酸的本發明重組載體(ABC)

將具有序列編號28所示的堿基序列（GCTGCAGCAGGAAACAGACCATGG）的低聚核苷酸（正義引物）和具有序列編號41所示的堿基序列（CAAGCTTGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTG）的低聚核苷酸（反義引物）用于引物，以實施例7的（8）中記載的質粒pTrc43SCcHis-g325a/g572a/a737g作為模板，在使用了Expand High Fidelity PCR System(ロシュ?ダイアグノスティック公司制)的下述反應液組成中進行PCR。

［反應液組成］

pTrc43SCcHis-g325a/g572a/a737g的DNA溶液 1μl

dNTP(各2.5mM的混合物) 1μl

引物(20pmol/μl) 各 0.4μl

5xbuffer(with MgCl₂) 　 10μl

enz.expandHiFi (3.5ｘ10³U/ml) 0.5μl

超純水 　　 　36.7μl

將放入了上述組成的反應液的容器固定于熱循環儀（PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System2400）中，在94℃保溫2分鐘后，進行10次94℃ 15秒、接著65℃ 30秒、接著72℃ 1分鐘的保溫循環，接著進行20次94℃ 15秒、接著70℃ 30秒、接著72℃ 1分鐘的保溫循環，進而在72℃保持7分鐘。

然后，將上述PCR反應液的一部分供于瓊脂糖凝膠電泳。檢測出約1.0kb的DNA條帶。

在剩余的PCR反應液中加入限制性內切酶PstI和HindIII，使DNA片段雙酶切，將酶切過的約1.0kbDNA進行純化。

利用限制性內切酶PstI和HindIII使實施例9（1-5）中記載的質粒pTrcLD(A113G)nh/774ch/43SCch雙酶切，將酶切過的約6.4kb的質粒DNA進行純化。

將這些純化的DNA混合，用T4 DNA連接酶進行連接反應，用所得的連接反應液將E.coli DH5α轉化。

將所得的轉化體用含有50μg/ml的氨芐西林的LB瓊脂培養基培養，從繁殖的菌落中隨機挑選8個菌落。將挑選的菌落分別在含有50μg/ml的氨芐西林的滅菌LB培養基2ml中接種，在試驗管中于37℃振蕩培養17小時。使用QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen公司制)從各培養菌體中取出質粒。將取出的質粒各自的一部分利用限制性內切酶PstI和HindIII雙酶切后，供于瓊脂糖凝膠電泳。確認在6個質粒中，約1.0kb的DNA被插入到上述約6.4kb的質粒DNA中。將這些質粒中的1個命名為pTrcLD(A113G)nh/774ch/43SCMch。

實施例10（使用了保有本發明重組載體(ABC)的轉化體的處理物的L-α-氨基酸化合物的制造）

（1）保有本發明重組載體(ABC)的轉化體，所述本發明重組載體(ABC)含有編碼具有序列編號3所示的氨基酸序列的本發明蛋白質(A)的多核苷酸

使用質粒pTrcLD(A113G)nh/774ch/43SCch將E.coli JM109株進行轉化。將所得的轉化體在含有0.1mM的IPTG和50μg/ml的氨芐西林的滅菌LB培養基20ml上接種，在30℃振蕩培養15小時。將所得的培養液離心分離，得到濕菌體。將該濕菌體約0.1g懸浮于0.5M Tris-HCl緩沖液（pH9）1ml中，使用多珠搖床（安井器械公司制）和玻璃珠（0.1mmΦ），以2500rpm進行20分鐘的破碎處理。將所得的破碎液在8000rpm、4℃的條件下進行10分鐘的離心分離，得到離心上清液約0.7ml。

將所得的離心上清液0.1ml、使用氨水調節為pH9的2-羥基-4-（甲硫基）丁酸（東京化成公司制）的40％水溶液0.4ml、NAD＋10mg、和硫酸銨20mg混合，在30℃振蕩18小時。對于該反應液，在下述條件下進行采用了液相色譜的含量分析。可知生成85.1g/L的L-蛋氨酸。相對于在反應中使用的2-羥基-4-（甲硫基）丁酸的量，L-蛋氨酸收率為21.5％。

（含量分析條件）

柱子：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)

流動相：將含有50mM 磷酸的12mM 1-庚烷磺酸鈉水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液（％）：B液（％）＝90：10的比例混合

流量：0.8ml/分鐘

柱溫：37℃

檢測：210nm。

（2）保有本發明重組載體(ABC)的轉化體，所述本發明重組載體(ABC)含有編碼具有改変氨基酸序列V109I/G191D/Q246R的本發明蛋白質(A)的多核苷酸

使用質粒pTrcLD(A113G)nh/774ch/43SCMch將E.coli JM109株進行轉化。將所得的轉化體在含有0.1mM的IPTG和50μg/ml的氨芐西林的滅菌LB培養基20ml上接種，在30℃振蕩培養15小時。將所得的培養液離心分離，得到濕菌體。將該濕菌體約0.1g懸浮于0.5M Tris-HCl緩沖液（pH9）1ml中，使用多珠搖床（安井器械公司制）和玻璃珠（0.1mmΦ），以2500rpm進行20分鐘的破碎處理。將所得的破碎液在8000rpm、4℃的條件下進行10分鐘的離心分離，得到離心上清液約0.7ml。

將所得的離心上清液0.1ml、使用氨水調節為pH9的2-羥基-4-（甲硫基）丁酸（東京化成公司制）的40％水溶液0.4ml、NAD＋10mg、和硫酸銨20mg混合，在30℃振蕩2小時。對于該反應液，在下述條件下進行采用了液相色譜的含量分析。可知生成82.5g/L的L-蛋氨酸。相對于在反應中使用的2-羥基-4-（甲硫基）丁酸的量，L-蛋氨酸收率為20.8％。

（含量分析條件）

柱子：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)

流動相：將含有50mM 磷酸的12mM 1-庚烷磺酸鈉水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液（％）：B液（％）＝90：10的比例混合

流量：0.8ml/分鐘

柱溫：37℃

檢測：210nm。

實施例11（使用了本發明蛋白質(A)、本發明蛋白質(B)和本蛋白質(C)的L-α-氨基酸化合物的制造）

（1）使用了具有序列編號3所示的氨基酸序列的本發明蛋白質(A)、本發明蛋白質(B)和本蛋白質(C)的L-α-氨基酸化合物的制造

將實施例2（1）中制備的本發明蛋白質(B)的純化酶液（40g蛋白質/L）的2倍稀釋液0.1ml、實施例2（2）中制備的本發明蛋白質(A)的純化酶液（9g蛋白質/L）的2倍濃縮液0.1ml、和實施例3（4）中制備的亮氨酸脫氫酶（A113G）純化酶液（32.6g蛋白質/L）的2倍稀釋液0.1ml混合，用Amicon Ultra-15（Millipore公司制)濃縮，得到0.1ml的純化酶混合液。將所得的純化酶混合液0.1ml、使用氨水調節為pH9的DL‐α‐羥基異己酸（ACROS ORGANICS公司制）的40％水溶液0.1ml、NAD＋10mg、0.5M Tris-HCl緩沖液（pH9.0）0.3ml、和硫酸銨20mg混合，在30℃振蕩18小時。對于該反應液，在下述條件下進行采用了液相色譜的含量分析。可知相對于在反應中使用的DL‐α‐羥基異己酸的量，生成的L-亮氨酸為60.9％。

（含量分析條件）

柱子：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)

流動相：將含有50mM 磷酸的12mM 1-庚烷磺酸鈉水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液（％）：B液（％）＝90：10的比例混合

流量：0.8ml/分鐘

柱溫：37℃

檢測：210nm。

（2）使用了具有改変氨基酸序列V109I/G191D/Q246R的本發明蛋白質(A)、本發明蛋白質(B)和本蛋白質(C)的L-α-氨基酸化合物的制造

將實施例2（1）中制備的本發明蛋白質(B)的純化酶液（40g蛋白質/L）的2.5倍稀釋液0.1ml、實施例8（1）中由pTrc43SCcHis-g325a/g572a/a737g轉化體制備的本發明蛋白質(A)的純化酶液（3.2g蛋白質/L）的4.5倍濃縮液0.1ml、和實施例3（4）中制備的亮氨酸脫氫酶（A113G）純化酶液（32.6g蛋白質/L）的2倍稀釋液0.1ml混合，用Amicon Ultra-15（Millipore公司制)濃縮，得到0.1ml的純化酶混合液。將所得的純化酶混合液0.1ml、使用氨水調節為pH9的DL‐α‐羥基異己酸（ACROS ORGANICS公司制）的40％水溶液0.1ml、NAD＋10mg、0.5M Tris-HCl緩沖液（pH9.0）0.3ml、和硫酸銨20mg混合，在30℃振蕩18小時。對于該反應液，在下述條件下進行采用了液相色譜的含量分析。可知相對于在反應中使用的DL‐α‐羥基異己酸的量，生成的L-亮氨酸為88.0％。

（含量分析條件）

柱子：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)

流動相：將含有50mM 磷酸的12mM 1-庚烷磺酸鈉水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液（％）：B液（％）＝90：10的比例混合

流量：0.8ml/分鐘

柱溫：37℃

檢測：210nm。

產業可利用性

根據本發明，可提供氧化酶、編碼其的多核苷酸、和利用了它們的、蛋氨酸、亮氨酸等α-氨基酸化合物的制造方法等。

［序列表自由文本］

序列編號9-12

為了進行PCR而設計的低聚核苷酸引物

序列編號13

編碼脫氫酶的多核苷酸

序列編號14-41

為了進行PCR而設計的低聚核苷酸引物

序列編號44-45

設計的氨基酸序列。

序列表

<110> SUMITOMO CHEMICAL CO., LTD.

<120> 脫氫酶、編碼該酶的多核苷酸、以及它們的應用

<130> S33397WO01

<150> JP2014-143022

<151> 2014-7-11

<160> 45

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 353

<212> PRT

<213> 反硝化無色桿菌（Achromobacter denitrificans）

<400> 1

Met Lys Lys Leu Ser Ile Ala Gln Ala Tyr Glu Tyr Gly Arg Arg Val

1 5 10 15

Leu Met Ala Gln Gly Val Pro Glu Asp Ile Ala Arg Asp Val Ala Glu

20 25 30

His Leu Val Glu Ser Asp Arg Val Gly Tyr Ala Ser His Gly Leu Ser

35 40 45

Ile Leu Thr Asn Tyr Arg Arg Val Leu Ser Glu Gly Leu Ala Arg Pro

50 55 60

Asp Gly Arg Pro Glu Leu Val Asn Asp Arg Gly Ala Met Leu Ala Tyr

65 70 75 80

Asp Gly His Asn Gly Leu Gly Gln Tyr Val Gly Lys Val Val Ile Glu

85 90 95

Lys Ala Ile Glu Arg Thr Gln Glu His Gly Gln Cys Ile Leu Thr Leu

100 105 110

Arg His Ser His His Leu Gly Arg Met Gly His Phe Gly Glu Met Val

115 120 125

Ala Ala Lys Gly Leu Ile Leu Leu Ala Phe Thr Asn Val Ile Asn Arg

130 135 140

Ala Pro Thr Val Ala Pro Phe Gly Gly Ala Gln Ala Cys Leu Thr Thr

145 150 155 160

Asn Pro Leu Cys Phe Ala Gly Pro Leu Pro Gly Gly Arg Pro Pro Phe

165 170 175

Ile Val Asp Met Ala Thr Ser Ser Ile Ala Val Asn Lys Ala Arg Val

180 185 190

Leu Ala Ala Lys Gly Glu Pro Ala Pro Glu Gly Ala Leu Ile Asp Ala

195 200 205

Gln Gly Asn Pro Thr Thr Asp Pro Gly Ala Leu Phe Thr Asp Pro Pro

210 215 220

Gly Ala Leu Leu Pro Phe Gly Gly His Lys Gly Tyr Ala Leu Gly Leu

225 230 235 240

Val Ala Glu Leu Leu Ala Gly Val Leu Ser Gly Gly Gly Thr Ile Gln

245 250 255

Pro Glu His Pro Arg Asn Gly Val Ala Thr Asn Asn Met Phe Ala Leu

260 265 270

Leu Leu Asp Pro Gln Val Asp Phe Asn Thr Asp Trp Arg Ser Leu Glu

275 280 285

Val Gly Ala Phe Ile Asp Tyr Leu His Ala Cys Lys Pro Gln Pro Gly

290 295 300

Val Glu Ser Val Gln Tyr Pro Gly Glu Tyr Glu Ala Arg Asn Arg Ala

305 310 315 320

Ile Asn Ala Asp Thr Val Glu Phe Asp Thr Arg Ile Trp Glu Gly Leu

325 330 335

Thr Arg Leu Ala Val Asp Leu Gly Val Pro Glu Ala Leu Pro His Glu

340 345 350

Gly

<210> 2

<211> 1059

<212> DNA

<213> 反硝化無色桿菌

<400> 2

atgaaaaagc tctccatcgc ccaagcctat gaatacggcc gccgcgtgct gatggcgcaa 60

ggcgtgcccg aggacatcgc ccgcgacgtg gccgaacacc tggtcgaatc cgaccgcgtg 120

ggctacgcca gccacggcct gtccatcctg acgaactacc gccgcgtgct gtccgagggc 180

ctggcccgcc ccgacggccg ccccgaactg gtcaacgacc gcggcgccat gctggcctac 240

gacggccaca acggcctggg ccagtacgtc ggcaaggtgg tcatcgaaaa agccatcgag 300

cgcacccagg agcacggcca gtgcatcctg accctgcgcc acagccacca cctgggccgc 360

atgggccatt tcggcgaaat ggtggcggcc aagggcctga tcctgctggc cttcaccaac 420

gtgatcaacc gcgcccccac cgtggccccc ttcggcggcg cgcaggcctg cctgaccacc 480

aacccgctgt gcttcgccgg ccccctgccc ggaggccgcc cgcccttcat cgtggacatg 540

gccaccagct ccatcgccgt caacaaggcc cgcgtgctgg ccgccaaggg cgaacccgcc 600

cccgaaggcg cgctgatcga cgcccagggc aaccccacca cggaccccgg cgcgctcttc 660

accgacccgc ccggcgccct gctgcccttc ggcggccaca agggctacgc cctgggcctg 720

gtggccgaac tgctggccgg cgtcctgtcc ggcggcggca cgatccagcc ggaacacccc 780

cgcaacggcg tggccacgaa caacatgttc gcgctcctgc tggacccgca ggtggacttc 840

aacaccgact ggcgctccct ggaagtcggc gccttcatcg actacctgca cgcctgcaag 900

ccccaacccg gcgtcgaatc ggtgcaatat cccggcgaat acgaagcccg caaccgcgcc 960

atcaacgcgg acaccgtgga attcgacacc cgcatctggg aaggcctgac cagactcgcc 1020

gtggacctgg gcgtcccgga agccctgccg cacgaaggc 1059

<210> 3

<211> 325

<212> PRT

<213> 反硝化無色桿菌

<400> 3

Met Ser Gln Lys Pro Lys Ile Ile Val Ser Ala Pro Val Pro Ala Asp

1 5 10 15

Leu Arg Glu Arg Val Ala Ala Ala Cys Glu Ile Ile Asp Val Pro Val

20 25 30

Gly Gln Asn Pro Ala Gln Ala Val Pro Glu Ala Gln Arg Ala Glu Val

35 40 45

Ala Gly Met Val Cys Thr Val Arg Thr Arg Val Asp Gln Ala Leu Leu

50 55 60

Asp Ala Phe Pro Ala Leu Ala Val Ser Ser Asn Phe Ala Val Gly Phe

65 70 75 80

Asp Asn Val Asp Leu Asp Ala Ala Asn Arg Arg Gln Val Leu Ile Cys

85 90 95

Asn Thr Pro Gly Val Leu Asp Gly Ala Val Ala Asp Val Thr Ile Gly

100 105 110

Leu Met Leu Cys Leu Ala Arg Asn Leu Val Ala Gly Asp Ala Phe Val

115 120 125

Arg Ser Gly Ala Trp Thr Lys Ser Ala Phe Pro Leu Thr Thr Asp Ile

130 135 140

Arg Gly Lys Thr Leu Gly Leu Leu Gly Met Gly Arg Ile Gly Lys Val

145 150 155 160

Val Ala Arg Thr Ala Gln Ala Phe Asp Met Lys Val Ile Tyr His Asn

165 170 175

Arg Arg Glu Asp Arg Ser Val Gln Gly Leu Ala Ala Tyr Val Gly Arg

180 185 190

Asp Glu Leu Phe Lys Phe Ser Asp Val Leu Ser Ile His Ile Pro Leu

195 200 205

Ser Ala Glu Thr Arg His Ser Val Gly Lys Arg Glu Phe Glu Leu Met

210 215 220

Lys Pro Thr Ala Tyr Val Ile Asn Thr Ala Arg Gly Pro Val Leu Asp

225 230 235 240

Glu Ala Ala Leu Val Gln Ala Leu Arg Ser Gly Thr Ile Ala Gly Ala

245 250 255

Gly Leu Asp Val Met Glu Gln Glu Pro Leu Pro Pro Ser Ser Pro Leu

260 265 270

Cys Glu Leu Pro Asn Val Val Leu Gln Ala His Val Gly Ser Ala Thr

275 280 285

His Glu Thr Arg Arg Ala Met Ile Asp Leu Ala Val Ala Asn Leu Leu

290 295 300

Asp Ala Leu Ala Gly Arg Lys Pro Gln Ala Met Val Asn Pro Gln Val

305 310 315 320

Trp Glu Ala Arg Gly

325

<210> 4

<211> 975

<212> DNA

<213> 反硝化無色桿菌

<400> 4

atgagccaaa aaccgaaaat catcgtatcc gcgccggtgc ccgccgatct gcgcgagcgc 60

gtggccgccg cctgtgaaat catcgacgtg cccgtggggc agaaccccgc gcaagccgtg 120

cccgaggcgc agcgcgccga agtcgctggc atggtctgca cggtgcgcac ccgcgtggac 180

caggcgttgc tcgacgcttt tcccgcgcta gccgtcagtt ccaatttcgc cgtgggattc 240

gacaacgtcg atctggacgc ggccaaccgc cgccaggtgc tcatctgcaa tacgcccggc 300

gtgctggacg gcgcggtcgc ggacgtgacc atcggcctga tgctgtgcct ggcccgcaac 360

ctggtggccg gcgacgcgtt cgtgcgcagc ggcgcctgga ccaagagcgc gtttccactg 420

accacggaca tacgcggcaa gacgctgggc ctgctcggca tgggccgtat cggcaaggtg 480

gtggcgcgca cggcgcaggc tttcgacatg aaggtgatct atcacaaccg gcgcgaggat 540

cggtcggtgc aaggtctggc cgcctacgtc gggcgcgacg agctgttcaa gttctcggac 600

gtgctgagca tccacatccc gctgtcggcc gagacgcgcc attccgtggg caagcgtgaa 660

ttcgagctga tgaagcctac ggcttatgtc atcaatacgg cgcgcggccc ggtgctggac 720

gaggcggcgc tggtccaggc gctgcgcagc ggcacgatcg ccggcgccgg cctggacgtg 780

atggagcagg agccgctgcc gccgtccagc cccttgtgcg agctgcccaa cgtggtgttg 840

caggcgcacg tgggcagcgc cacccacgag acgcggcgcg ccatgatcga cctggcggtg 900

gccaacctgc tggacgcgct ggccgggcgc aagccgcagg ccatggtcaa cccgcaggtg 960

tgggaagccc gcggc 975

<210> 5

<211> 325

<212> PRT

<213> 反硝化無色桿菌

<400> 5

Met Ser Gln Lys Pro Lys Ile Ile Val Ser Ala Pro Val Pro Ala Asp

1 5 10 15

Leu Arg Glu Arg Val Ala Ala Ala Cys Glu Ile Ile Asp Val Pro Val

20 25 30

Gly Gln Asn Pro Ala Gln Ala Val Pro Glu Ala Gln Arg Ala Glu Val

35 40 45

Ala Gly Met Val Cys Thr Val Arg Thr Arg Val Asp Gln Ala Leu Leu

50 55 60

Asp Ala Phe Pro Ala Leu Ala Val Ser Ser Asn Phe Ala Val Gly Phe

65 70 75 80

Asp Asn Val Asp Leu Asp Ala Ala Asn Arg Arg Gln Val Leu Ile Cys

85 90 95

Asn Thr Pro Gly Val Leu Asp Gly Ala Val Ala Asp Ile Thr Ile Gly

100 105 110

Leu Met Leu Cys Leu Ala Arg Asn Leu Val Ala Gly Asp Ala Phe Val

115 120 125

Arg Ser Gly Ala Trp Thr Lys Ser Ala Phe Pro Leu Thr Thr Asp Ile

130 135 140

Arg Gly Lys Thr Leu Gly Leu Leu Gly Met Gly Arg Ile Gly Lys Val

145 150 155 160

Val Ala Arg Thr Ala Gln Ala Phe Asp Met Lys Val Ile Tyr His Asn

165 170 175

Arg Arg Glu Asp Arg Ser Val Gln Gly Leu Ala Ala Tyr Val Asp Arg

180 185 190

Asp Glu Leu Phe Lys Phe Ser Asp Val Leu Ser Ile His Ile Pro Leu

195 200 205

Ser Ala Glu Thr Arg His Ser Val Gly Lys Arg Glu Phe Glu Leu Met

210 215 220

Lys Pro Thr Ala Tyr Val Ile Asn Thr Ala Arg Gly Pro Val Leu Asp

225 230 235 240

Glu Ala Ala Leu Val Arg Ala Leu Arg Ser Gly Thr Ile Ala Gly Ala

245 250 255

Gly Leu Asp Val Met Glu Gln Glu Pro Leu Pro Pro Ser Ser Pro Leu

260 265 270

Cys Glu Leu Pro Asn Val Val Leu Gln Ala His Val Gly Ser Ala Thr

275 280 285

His Glu Thr Arg Arg Ala Met Ile Asp Leu Ala Val Ala Asn Leu Leu

290 295 300

Asp Ala Leu Ala Gly Arg Lys Pro Gln Ala Met Val Asn Pro Gln Val

305 310 315 320

Trp Glu Ala Arg Gly

325

<210> 6

<211> 978

<212> DNA

<213> 反硝化無色桿菌

<400> 6

atgtctcaaa aaccaaaaat catcgttagc gcaccagttc cggccgatct gcgcgaacgt 60

gttgcagcgg cctgcgaaat tatcgatgtg cctgttggtc agaatccggc gcaggcggtt 120

ccagaggcgc agcgtgcgga agtagccggt atggtatgta ctgtacgtac gcgtgtggat 180

caggctctgc tggatgcgtt cccggccctg gccgtttcca gcaacttcgc ggtgggtttt 240

gacaacgtgg acctggacgc ggcgaaccgt cgccaggtac tgatttgcaa cacccctggc 300

gttctggacg gcgctgttgc tgatattacc atcggcctga tgctgtgcct ggctcgtaac 360

ctggtggcag gtgacgcttt cgttcgcagc ggtgcttgga ccaaatccgc ctttccgctg 420

accaccgaca tccgtggtaa aaccctgggc ctgctgggca tgggccgcat cggcaaagtc 480

gtcgcacgca ccgcgcaggc tttcgatatg aaggtgatct accataaccg tcgtgaagat 540

cgctctgtac agggcctggc ggcatacgtc gatcgtgacg agctgttcaa attcagcgac 600

gtcctgtcta tccacatccc gctgtctgct gaaacgcgcc actccgtagg caaacgtgag 660

tttgaactga tgaagccgac cgcgtatgtt attaacactg cgcgtggtcc ggttctggat 720

gaagcagcac tggtacgggc actgcgctct ggtacgattg ctggtgctgg tctggacgtg 780

atggaacagg aaccgctgcc gccgtcttcc ccgctgtgtg agctgccgaa tgtcgtgctg 840

caagctcacg tgggttccgc gactcacgaa actcgtcgtg ctatgattga tctggcggtt 900

gctaacctgc tggacgcact ggcaggccgt aaaccgcagg caatggttaa cccgcaggtg 960

tgggaagccc gtggctaa 978

<210> 7

<211> 364

<212> PRT

<213> 球形芽孢桿菌（Bacillus sphaericus）

<400> 7

Met Glu Ile Phe Lys Tyr Met Glu Lys Tyr Asp Tyr Glu Gln Leu Val

1 5 10 15

Phe Cys Gln Asp Glu Ala Ser Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Ile His

20 25 30

Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Ala Arg Met Trp Thr Tyr

35 40 45

Ala Thr Glu Glu Asn Ala Ile Glu Asp Ala Leu Arg Leu Ala Arg Gly

50 55 60

Met Thr Tyr Lys Asn Ala Ala Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly Gly Lys

65 70 75 80

Thr Val Ile Ile Gly Asp Pro Phe Lys Asp Lys Asn Glu Glu Met Phe

85 90 95

Arg Ala Leu Gly Arg Phe Ile Gln Gly Leu Asn Gly Arg Tyr Ile Thr

100 105 110

Gly Glu Asp Val Gly Thr Thr Val Thr Asp Met Asp Leu Ile His Glu

115 120 125

Glu Thr Asn Tyr Val Thr Gly Ile Ser Pro Ala Phe Gly Ser Ser Gly

130 135 140

Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala Tyr Gly Val Tyr Arg Gly Met Lys Ala

145 150 155 160

Ala Ala Lys Glu Ala Phe Gly Thr Asp Met Leu Glu Gly Arg Thr Ile

165 170 175

Ser Val Gln Gly Leu Gly Asn Val Ala Tyr Lys Leu Cys Glu Tyr Leu

180 185 190

His Asn Glu Gly Ala Lys Leu Val Val Thr Asp Ile Asn Gln Ala Ala

195 200 205

Ile Asp Arg Val Val Asn Asp Phe Gly Ala Thr Ala Val Ala Pro Asp

210 215 220

Glu Ile Tyr Ser Gln Glu Val Asp Ile Phe Ser Pro Cys Ala Leu Gly

225 230 235 240

Ala Ile Leu Asn Asp Glu Thr Ile Pro Gln Leu Lys Ala Lys Val Ile

245 250 255

Ala Gly Ser Ala Asn Asn Gln Leu Gln Asp Ser Arg His Gly Asp Tyr

260 265 270

Leu His Glu Leu Gly Ile Val Tyr Ala Pro Asp Tyr Val Ile Asn Ala

275 280 285

Gly Gly Val Ile Asn Val Ala Asp Glu Leu Tyr Gly Tyr Asn Arg Glu

290 295 300

Arg Ala Leu Lys Arg Val Asp Gly Ile Tyr Asp Ser Ile Glu Lys Ile

305 310 315 320

Phe Glu Ile Ser Lys Arg Asp Ser Ile Pro Thr Tyr Val Ala Ala Asn

325 330 335

Arg Leu Ala Glu Glu Arg Ile Ala Arg Val Ala Lys Ser Arg Ser Gln

340 345 350

Phe Leu Lys Asn Glu Lys Asn Ile Leu Asn Gly Arg

355 360

<210> 8

<211> 1095

<212> DNA

<213> 球形芽孢桿菌

<400> 8

atggaaatct tcaagtatat ggaaaagtat gattatgaac aattggtatt ttgccaagac 60

gaagcatctg ggttaaaagc gattatcgct atccatgaca caacacttgg accagcatta 120

ggtggtgctc gtatgtggac ctacgcgaca gaagaaaatg cgattgagga tgcattaaga 180

ttagcacgcg ggatgacata taaaaatgca gctgctggtt taaaccttgg cggtggaaaa 240

acggtcatta ttggggaccc atttaaagat aaaaacgaag aaatgttccg tgctttaggt 300

cgtttcattc aaggattaaa cggtcgctat attaccggtg aagatgttgg tacaaccgta 360

acagatatgg atttaatcca tgaggaaaca aattacgtta caggtatatc gccagcgttt 420

ggttcatcgg gtaatccttc accagtaact gcttatggcg tttatcgtgg catgaaagca 480

gcggcgaaag aagcatttgg tacggatatg ctagaaggtc gtactatatc ggtacaaggg 540

ctaggaaacg tagcttacaa gctttgcgag tatttacata atgaaggtgc aaaacttgta 600

gtaacagata ttaaccaagc ggctattgat cgtgttgtca atgattttgg cgctacagca 660

gttgcacctg atgaaatcta ttcacaagaa gtcgatattt tctcaccgtg tgcacttggc 720

gcaattttaa atgacgaaac gattccgcaa ttaaaagcaa aagttattgc tggttctgct 780

aataaccaac tacaagattc acgacatgga gattatttac acgagctagg cattgtttat 840

gcacctgact atgtcattaa tgcaggtggt gtaataaatg tcgcggacga attatatggc 900

tataatcgtg aacgagcgtt gaaacgtgta gatggtattt acgatagtat tgaaaaaatc 960

tttgaaattt ccaaacgtga tagtattcca acatatgttg cggcaaatcg tttggcagaa 1020

gaacgtattg ctcgtgtagc gaaatcgcgt agtcagttct taaaaaatga aaaaaatatt 1080

ttgaacggcc gttaa 1095

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 9

ccatatgaaa aagctctcca tcgcccaag 29

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 10

actcgaggcc ttcgtgcggc agggcttc 28

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 11

ccatatgagc caaaaaccga aaatcatcg 29

<210> 12

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 12

actcgaggcc gcgggcttcc cacacctgcg gg 32

<210> 13

<211> 978

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 多核苷酸，編碼脫氫酶

<400> 13

atgtctcaaa aaccaaaaat catcgttagc gcaccagttc cggccgatct gcgcgaacgt 60

gttgcagcgg cctgcgaaat tatcgatgtg cctgttggtc agaatccggc gcaggcggtt 120

ccagaggcgc agcgtgcgga agtagccggt atggtatgta ctgtacgtac gcgtgtggat 180

caggctctgc tggatgcgtt cccggccctg gccgtttcca gcaacttcgc ggtgggtttt 240

gacaacgtgg acctggacgc ggcgaaccgt cgccaggtac tgatttgcaa cacccctggc 300

gttctggacg gcgctgttgc tgatgttacc atcggcctga tgctgtgcct ggctcgtaac 360

ctggtggcag gtgacgcttt cgttcgcagc ggtgcttgga ccaaatccgc ctttccgctg 420

accaccgaca tccgtggtaa aaccctgggc ctgctgggca tgggccgcat cggcaaagtc 480

gtcgcacgca ccgcgcaggc tttcgatatg aaggtgatct accataaccg tcgtgaagat 540

cgctctgtac agggcctggc ggcatacgtc ggtcgtgacg agctgttcaa attcagcgac 600

gtcctgtcta tccacatccc gctgtctgct gaaacgcgcc actccgtagg caaacgtgag 660

tttgaactga tgaagccgac cgcgtatgtt attaacactg cgcgtggtcc ggttctggat 720

gaagcagcac tggtacaggc actgcgctct ggtacgattg ctggtgctgg tctggacgtg 780

atggaacagg aaccgctgcc gccgtcttcc ccgctgtgtg agctgccgaa tgtcgtgctg 840

caagctcacg tgggttccgc gactcacgaa actcgtcgtg ctatgattga tctggcggtt 900

gctaacctgc tggacgcact ggcaggccgt aaaccgcagg caatggttaa cccgcaggtg 960

tgggaagccc gtggctaa 978

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 14

gccatggaaa tcttcaagta tatgg 25

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 15

gggcccgggt taacggccgt tcaaaatatt 30

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 16

gtcgctatat taccggtgaa gatgttg 27

<210> 17

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 17

caacatcttc accggtaata tagcgac 27

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 18

gatagtattc caacctatgt tgcggc 26

<210> 19

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 19

gccgcaacat aggttggaat actatc 26

<210> 20

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 20

gggcatatgg aaatcttcaa gtatatgg 28

<210> 21

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 21

ggatccttaa cggccgttca aaatatt 27

<210> 22

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 22

cgtagcttac aaactttgcg agtatttac 29

<210> 23

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 23

gtaaatactc gcaaagtttg taagctacg 29

<210> 24

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 24

ccatggctat gaaaaagctc tccatcgccc 30

<210> 25

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 25

caagcttgct agccttcgtg cggcagggct tc 32

<210> 26

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 26

cggatccgag gaaacagacc atgg 24

<210> 27

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 27

gctgcagcct agccttcgtg cggcagggct tc 32

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 28

gctgcagcag gaaacagacc atgg 24

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 29

caagcttgtt agccacgggc ttcccacacc 30

<210> 30

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 30

ccatatgtct caaaaaccaa aaatcatcg 29

<210> 31

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 31

actcgaggcc acgggcttcc cacacctgcg 30

<210> 32

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 32

gccatggcta tgtctcaaaa accaaaaatc 30

<210> 33

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 33

ggatcctcag tggtggtggt ggtggtg 27

<210> 34

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 34

cgctgttgct gatattacca tcggcctg 28

<210> 35

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 35

caggccgatg gtaatatcag caacagcg 28

<210> 36

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 36

ggcggcatac gtcgatcgtg acgagctg 28

<210> 37

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 37

cagctcgtca cgatcgacgt atgccgcc 28

<210> 38

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 38

gcagcactgg tacgggcact gcgctctg 28

<210> 39

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 39

cagagcgcag tgcccgtacc agtgctgc 28

<210> 40

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 40

gctgcagctc agtggtggtg gtggtggtg 29

<210> 41

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 41

caagcttgtc agtggtggtg gtggtggtg 29

<210> 42

<211> 364

<212> PRT

<213> 球形芽孢桿菌

<400> 42

Met Glu Ile Phe Lys Tyr Met Glu Lys Tyr Asp Tyr Glu Gln Leu Val

1 5 10 15

Phe Cys Gln Asp Glu Ala Ser Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Ile His

20 25 30

Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Ala Arg Met Trp Thr Tyr

35 40 45

Ala Thr Glu Glu Asn Ala Ile Glu Asp Ala Leu Arg Leu Ala Arg Gly

50 55 60

Met Thr Tyr Lys Asn Ala Ala Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly Gly Lys

65 70 75 80

Thr Val Ile Ile Gly Asp Pro Phe Lys Asp Lys Asn Glu Glu Met Phe

85 90 95

Arg Ala Leu Gly Arg Phe Ile Gln Gly Leu Asn Gly Arg Tyr Ile Thr

100 105 110

Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Val Thr Asp Met Asp Leu Ile His Glu

115 120 125

Glu Thr Asn Tyr Val Thr Gly Ile Ser Pro Ala Phe Gly Ser Ser Gly

130 135 140

Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala Tyr Gly Val Tyr Arg Gly Met Lys Ala

145 150 155 160

Ala Ala Lys Glu Ala Phe Gly Thr Asp Met Leu Glu Gly Arg Thr Ile

165 170 175

Ser Val Gln Gly Leu Gly Asn Val Ala Tyr Lys Leu Cys Glu Tyr Leu

180 185 190

His Asn Glu Gly Ala Lys Leu Val Val Thr Asp Ile Asn Gln Ala Ala

195 200 205

Ile Asp Arg Val Val Asn Asp Phe Gly Ala Thr Ala Val Ala Pro Asp

210 215 220

Glu Ile Tyr Ser Gln Glu Val Asp Ile Phe Ser Pro Cys Ala Leu Gly

225 230 235 240

Ala Ile Leu Asn Asp Glu Thr Ile Pro Gln Leu Lys Ala Lys Val Ile

245 250 255

Ala Gly Ser Ala Asn Asn Gln Leu Gln Asp Ser Arg His Gly Asp Tyr

260 265 270

Leu His Glu Leu Gly Ile Val Tyr Ala Pro Asp Tyr Val Ile Asn Ala

275 280 285

Gly Gly Val Ile Asn Val Ala Asp Glu Leu Tyr Gly Tyr Asn Arg Glu

290 295 300

Arg Ala Leu Lys Arg Val Asp Gly Ile Tyr Asp Ser Ile Glu Lys Ile

305 310 315 320

Phe Glu Ile Ser Lys Arg Asp Ser Ile Pro Thr Tyr Val Ala Ala Asn

325 330 335

Arg Leu Ala Glu Glu Arg Ile Ala Arg Val Ala Lys Ser Arg Ser Gln

340 345 350

Phe Leu Lys Asn Glu Lys Asn Ile Leu Asn Gly Arg

355 360

<210> 43

<211> 1095

<212> DNA

<213> 球形芽孢桿菌

<400> 43

atggaaatct tcaagtatat ggaaaagtat gattatgaac aattggtatt ttgccaagac 60

gaagcatctg ggttaaaagc gattatcgct atccatgaca caacacttgg accagcatta 120

ggtggtgctc gtatgtggac ctacgcgaca gaagaaaatg cgattgagga tgcattaaga 180

ttagcacgcg ggatgacata taaaaatgca gctgctggtt taaaccttgg cggtggaaaa 240

acggtcatta ttggggaccc atttaaagat aaaaacgaag aaatgttccg tgctttaggt 300

cgtttcattc aaggattaaa cggtcgctat attaccgctg aagatgttgg tacaaccgta 360

acagatatgg atttaatcca tgaggaaaca aattacgtta caggtatatc gccagcgttt 420

ggttcatcgg gtaatccttc accagtaact gcttatggcg tttatcgtgg catgaaagca 480

gcggcgaaag aagcatttgg tacggatatg ctagaaggtc gtactatatc ggtacaaggg 540

ctaggaaacg tagcttacaa gctttgcgag tatttacata atgaaggtgc aaaacttgta 600

gtaacagata ttaaccaagc ggctattgat cgtgttgtca atgattttgg cgctacagca 660

gttgcacctg atgaaatcta ttcacaagaa gtcgatattt tctcaccgtg tgcacttggc 720

gcaattttaa atgacgaaac gattccgcaa ttaaaagcaa aagttattgc tggttctgct 780

aataaccaac tacaagattc acgacatgga gattatttac acgagctagg cattgtttat 840

gcacctgact atgtcattaa tgcaggtggt gtaataaatg tcgcggacga attatatggc 900

tataatcgtg aacgagcgtt gaaacgtgta gatggtattt acgatagtat tgaaaaaatc 960

tttgaaattt ccaaacgtga tagtattcca acatatgttg cggcaaatcg tttggcagaa 1020

gaacgtattg ctcgtgtagc gaaatcgcgt agtcagttct taaaaaatga aaaaaatatt 1080

ttgaacggcc gttaa 1095

<210> 44

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的氨基酸序列

<400> 44

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His

20

<210> 45

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的氨基酸序列

<400> 45

Leu Glu His His His His His His

1 5