豬nlrc5基因全長克隆及表達量的熒光定量檢測方法
【專利摘要】本發明涉及豬NLRC5基因全長克隆及表達量的熒光定量檢測方法，通過材料的處理與準備、RNA的提取cDNA合成、RT-PCR及3’RACE技術獲得了NLRC5基因，該基因cDNA全長為6638bp，基因開放閱讀框為5538bp,共編碼1846個氨基酸。生物信息學分析發現豬NLRC5基因核苷酸序列與牛、綿羊、獼猴、人的同源性達到了80%左右。本發明通過優化實時熒光定量PCR反應體系參數，我們建立起了一種用于檢測NLRC5基因表達量的SYBR?Green?I熒光定量方法，基于熒光定量PCR方法，首次對豬組織中的NLRC5基因表達進行了定量分析。
【專利說明】豬NLRC5基因全長克隆及表達量的熒光定量檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，涉及豬組織中NLRC5基因克隆及表達量的熒光定量檢測方法。
【背景技術】
[0002]NLRC5是新近被發現的NOD樣受體(N0D_like receptors, NLRs)家族成員之一，其作為一種新型天然免疫調節分子的作用近年來已受到廣泛關注。在人和小鼠的多種細胞類型中，已證實NLRC5可對NF- K B通路、I型IFN產生通路、MHC-1基因轉錄及炎性小體的形成等產生顯著的調控作用，在調控抗病原微生物天然免疫中扮演重要角色。NLRC5蛋白作為一種新型天然免疫調節分子，其可為未來調節微生物感染和免疫炎癥等相關疾病的免疫力提供一個有效的靶標。目前人類、小鼠等物種的NLRC5基因的cDNA序列克隆及鑒定方法均有報道，但是豬NLRC5基因cDNA的克隆方法還沒有建立起來，關于豬NLRC5基因的研究及應用在整個國內外還處于空白狀態。近年來，隨著我國養殖業的發展，集約化程度越來越高，豬傳染病的傳播速度也越來越快，給養殖業帶來了難以置信的損失。另外，由于疫苗的大量的使用和抗生素濫用，造成了病原的生物學特性、抗原性、耐藥性都發生了很大的變化，這又增加了傳染病治療的難度。鑒于此，從機體自身免疫的角度，需要通過尋找抗病相關天然免疫基因，為從根本上防控動物傳染病提供新的手段。
【發明內容】
[0003]鑒于現有技術的以上不足，本發明的目的是提供一種NLRC5基因序列克隆的一種方法，為后面基因功能的研究提供新的手段。
[0004]一種豬NLRC5基因全長序列克隆方法，運用人類、小鼠等物種NLRC5基因已知片段設計分段擴增的引物，用豬的小腸組織提取總RNA，進行RT-PCR擴增，用擴增到的NLRC5基因片段作為已知序列，采用3’ RACE技術`，獲得3’端未知序列，拼接獲得其全長cDNA序列；利用Real-time PCR技術檢測NLRC5基因在不同組織中的表達量。
[0005]所述獲得的全長cDNA全長序列如序列表中的SEQ ID:1所示，它的編碼區從第123個核苷酸到5660個核苷酸。
[0006]所述獲得的全長cDNA全長序列的氨基酸序列對應于序列表中的SEQ ID: 2.[0007]所述之分段擴增的引物為:
[0008]IS:5，-GGGCCTGTCCTATGGAAAGAA-3’
[0009]IA:5’ -CTGCTGTCGTAACGCTGCTG-3’
[0010]2S:5，-GGACCCCATTAGTCGCCAC-3，
[0011]2A: 5，-CAGCCACGCAGTGACATAGC-3’
[0012]3S:5，-TGGACAGAGACACACTTGCCC-3，
[0013]3A:5’ -GCCACCAGTTGACAGCCTTC-3’
[0014]4S:5’ -TGTCTCCGTGTCAACTCTCCTC-3’[0015]4A:5’ -CCTCTGCTGTCACCGCTCA-3’
[0016]5S:5’ -ACGGTTTGTCCCTGGATGCT-3’
[0017]5A: 5，-GCCACGGCTTCTGGGTTCT-3，
[0018]6S:5， -AGGCAACGTCACTGAAATAAGC-3，
[0019]6A:5，-CACAGGCGAATGACTTGGAT-3，
[0020]7S:5，-TCAACTTGGCCGAGAACAGC-3，
[0021]7A:5’ -AGGGGACCTGTGGCTGATG-3’
[0022]8S:5，-GACAACCAGACTGCCAAGCC-3’
[0023]8A:5’ -CTTGGGCCTTCTTGGAAACA-3’
[0024]克隆過程中，基因3’端添加含有一段特殊接頭引物的Oligo(dT) 18作為鎖定引物反轉錄合成第一鏈cDNA ;用基因特異引物GSP作為上游引物，用含有部分接頭序列的引物作為下游引物，以cDNA第一條鏈為模板，采用TaKaRa LA Taq?.聚合酶進行巢式PCR，把目的基因3’末端的DNA片段擴增出來；RACE引物序列如下:
[0025]Race 引物:5，-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG (T) 18-3，
[0026]GSPl:5，-G GAACTGGCTCACCCCTCCCGTA-3’
[0027]Out primer:5’ -GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’
[0028]GSP2:5， -CGCTGGACCCGGCCACTACCTCA-3’
[0029]Inner primer:5，-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3J
[0030]本發明從豬組織中克隆出了 NLRC5基因cDNA全長，探索了基因在不同組織中轉錄與表達特點，為進一步研究基因在動物體內的功能及開發利用提供了新的路徑。全長基因的獲得是研究基因功能的一個首要環節，而RACE技術是獲得全長基因的一種比較高效的方法，它是在PCR技術的基礎上根據已知的一段cDNA片段，通過向兩端延伸擴增，從而獲得完整的3’端和5’端的技術。
[0031]NLRC5作為一種新發現證明的免疫調節分子，核苷酸及氨基酸序列的獲得可以用于單克隆抗體的制備，同時也能夠指導后續動物體內的免疫角色的研究。另外，由于豬與人在基因及生理方面具有較高的相似性，豬內NLRC5基因的功能研究可以用于指導NLRC5基因在人體內的相關研究。
[0032]本發明的目的還在于，建立起一種檢測NLRC5在表達量的熒光定量方法，利用熒光定量PCR技術檢測NLRC5基因在不同組織中的表達量，采用SYBR Green I實時熒光定量方法對NLRC5基因在豬不同組織表達量進行檢測分析，熒光定量引物如下:
[0033]QNLRC5-S:5，-AACTTGGCCGAGAACAGC-3，
[0034]QNLRC5-A:5， -TTCCACAGGCGAATGACTT-3，
[0035]Qactin-S:5，-GTCATCACCATCGGCAACG-3’
[0036]Qactin-A:5，-AACAGTCCGCCTAGAAGCATT-3’
[0037]本發明通過優化實時熒光定量PCR反應體系參數，建立起了一種用于檢測NLRC5基因表達量的SYBR Green I熒光定量方法。該方法具有操作簡便，檢測靈敏度高，重復性好，污染少，PCR反應結束后，可立即觀察結果，不需要電泳、染色等操作等優點，同時避免了設計、標記熒光探針和價格昂貴等問題。可以用于組織表達譜建立，也可以用于基因的動態定量檢測，具有很廣的應用范圍【專利附圖】
【附圖說明】
[0038]圖1為基因NLRC5在不同物種間的核苷酸序列同源性比較
[0039]圖2為Real-time PCR特異性溶解曲線
[0040]圖2(A):NLRC5在溶解溫度為Tm=87.5°C時出現單一的特異性峰，表明引物反應特異性良好。
[0041]圖2(B):13_actin在溶解溫度STm=86.5°C時出現單一的特異性峰，表明引物反應特異性良好。
[0042]圖3為Real-time PCR檢測NLRC5基因在豬各組織的表達分布
[0043]熒光定量數據表明NLRC5除在豬淋巴結、脾臟等系統免疫組織具有高表達外，在豬小腸、結腸、胃和肺等具有黏膜表面的器官中，通常也具有較高的轉錄水平。
【具體實施方式】
[0044]下面結合附圖與具體實施例進一步說明本發明，但并不是對本發明的進一步的限定。
[0045]在實施過程中，本發明技術方案可采用如下的具體步驟:
[0046](I)材料的準備與處理
[0047]采集新鮮的動物樣本，生理鹽水沖洗掉表面的血液,放入液氮中送回實驗室保存。
`[0048](2) RNA的提取和cDNA的合成
[0049]利用液氮研磨方法提取RNA,按照invitrogen公司SuperSerip# IIIFirst-Strand Synthesis System for RT-PCR 進行 cDNA 的合成，50°C反應 50min,得到的反轉錄產物保存于-20°C低溫冰箱中備用。
[0050](3)cDNA 克隆
[0051]通過RT-PCR進行克隆，參照人、小鼠以及其它物種的NLRC5基因，設計分段擴增豬NLRC5基因的引物。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的片段與PMD-19連接，轉化DH5a,菌液PCR鑒定正確送invitrogen測序,測序結果進行拼接。
[0052]分段擴增引物如下:
[0053]IS:5，-GGGCCTGTCCTATGGAAAGAA-3’
[0054]IA:5’ -CTGCTGTCGTAACGCTGCTG-3’
[0055]2S:5，-GGACCCCATTAGTCGCCAC-3，
[0056]2A:5，-CAGCCACGCAGTGACATAGC-3，
[0057]3S:5，-TGGACAGAGACACACTTGCCC-3，
[0058]3A:5’ -GCCACCAGTTGACAGCCTTC-3’
[0059]4S:5’ -TGTCTCCGTGTCAACTCTCCTC-3’
[0060]4A:5，-CCTCTGCTGTCACCGCTCA-3’
[0061]5S:5’ -ACGGTTTGTCCCTGGATGCT-3’
[0062]5A:5，-GCCACGGCTTCTGGGTTCT-3’
[0063]6S:5，-AGGCAACGTCACTGAAATAAGC-3，
[0064]6A:5，-CACAGGCGAATGACTTGGAT-3，[0065]7S:5’ -TCAACTTGGCCGAGAACAGC-3’
[0066]7A:5，-AGGGGACCTGTGGCTGATG-3’
[0067]8S:5，-GACAACCAGACTGCCAAGCC-3’
[0068]8A:5，-CTTGGGCCTTCTTGGAAACA-3’
[0069](4)3’端轉錄終止區序列的克隆
[0070]本發明所獲得的NLRC5基因的3’端的序列，是用以下核苷酸序列為引物:
[0071 ]Race 引物:5，-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG (T) 18-3，
[0072]Out primer:5’ -GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’
[0073]GSPl:5，-GGAACTGGCTCACCCCTCCCGTA-3’
[0074]Inner primer:5’ -CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3J
[0075]GSP2:5， -CGCTGGACCCGGCCACTACCTCA-3’
[0076]基因cDNA序列為列表中的SEQ ID NO:1。
[0077]本發明NLRC5基因cDNA序列為6638bp，基因開放閱讀框為5538bp，共編碼1846個氨基酸，氨基酸序列為 序列表中的SEQ ID N0:2。
[0078]NLRC5的生物信息學分析:拼接獲得NLRC5的cDNA序列；在NCBI上進行開放閱讀框分析，并推測出NLRC5的氨基酸序列；對見此5基因的同源性進行分析比對發現NLRC5基因核苷酸序列與牛、綿羊、獼猴、人的同源性達到了 80%左右，具有較高的同源性。
[0079]熒光定量PCR檢測NLRC5基因在組織中的表達量，熒光定量引物如下:
[0080]QNLRC5-S:5，-AACTTGGCCGAGAACAGC-3，
[0081]QNLRC5-A:5， -TTCCACAGGCGAATGACTT-3，
[0082]Qactin-S:5，-GTCATCACCATCGGCAACG-3’
[0083]Qactin-A:5，-AACAGTCCGCCTAGAAGCATT-3’
[0084]實施例
[0085]實施例1RNA的提取:
[0086]稱取IOOmg小腸組織，采取液氮研磨法提取RNA, DEPC水進行溶解，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。
[0087]實施例2RT-PCR:
[0088](I)準備一個0.2ml的離心管，加入以下成分:
[0089]總RNA:6ul
[0090]50um oligo (dT) 20 Iul
[0091]IOmM dNTP mix Iul
[0092]DEPC-treated H2O 2ul
[0093](2)65°C溫育5min,放置冰上冷卻。
[0094](3)按順序加入以下成分:
[0095]10 X RT buffer 2ul
[0096]25mM Mgcl2 4ul
[0097]0.1mM DTT 2ul
[0098]RNase OUT? (40U/ul) Iul
[0099]200U/ul Superscript* III RT Iul[0100]總體積為:20ul
[0101](4)短暫離心、混勻。
[0102](5)50。〇下反應5011^11。
[0103](6)85°〇反應511^11，冰上泠卻。
[0104](7)加入 Iul RNase H,離心混勻，37°C下反應 20min.[0105](8)產物放置_20°C低溫冰箱中保存備用。
[0106]實施例3cDNA克隆:
[0107]首先參照人、小鼠以及其它物種的NLRC5基因，設計分段擴增豬NLRC5基因的引物。PCR擴增所用的聚合酶為TaKaRa LA Taq?，在50uL反應體系中加入以下成分:TaKaRaLA Taq0.5uL; 10XLA PCR Buffer 11 (Mg2+Free) 5uL; Mgcl2 (25mM) 5uL; dNTP Mixture (各
2.5mM)8uL;模板IuL;上下游引物各IuL;滅菌蒸餾水28.5uL。PCR反應條件為:94°C 5min, 35 個循環(94°C 30s, 58°C 30s72°C 90s), 72°C IOmin0 PCR 產物用 1% 瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的片段與PMD-19連接，轉化DH5a，菌液PCR鑒定正確送上海invitrogen測序，測序結果進行拼接。
[0108]實施例4cDNA3’端序列的克隆:
[0109]本發明采用添加一段特殊的接頭引物的Oligo(dT) 18作為鎖定引物反轉錄合成第一鏈cDNA，以GSPl和3’ RACE Out Primer為引物進行第一輪PCR，其反應條件為940C 5min, 35 個循環(94°C 30s, 60°C 30s72°C 60s), 72°C IOmin ;以第一輪 PCR產物為模板，3’ RACE Inner Primer和GSP2為引物進行第二輪PCR,其反應條件為94°C 5min, 35個循環(94°C 30s, 60°C 30s72°C 50s),` 72°C IOmin ;將兩輪PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，將目的條帶割膠回收并與PMD-19連接，轉化DH5a，菌液PCR鑒定正確送至上海invitrogen公司進行測序，RACE引物如下:
[0110]反轉錄弓丨物:5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG (T) 18-3’
[0111]Out primer:5，-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3，
[0112]GSP1: 5 ’ -GGAACTGGCTCACCCCTCCCGTA-3，
[0113]Inner primer:5’ -CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3J
[0114]GSP2: 5，-CGCTGGACCCGGCCACTACCTCA-3，
[0115]實施例5NLRC5生物信息學分析:
[0116]拼接獲得NLRC5的mRNA序列；推測出NLRC5的氨基酸序列；對NLRC5基因的同源性進行分析比對。
[0117]實施例6熒光定量PCR檢測NLRC5基因在組織中的表達量:
[0118]采用BioRad CFX_96manger 儀器，用的聚合酶為 TaKaRa SYBR?: Premix Ex Taq?II polymerase,每反應體系中加入5uL聚合酶液,上下游引物各0.4uL, cDNA模板IuL,添加3.2uL 滅菌蒸餾水。PCR 反應程序如下:95°C 30s，39 個循環(95°C 5s, 55°C 30s, 72°C 20s)PCR反應結束后繪制溶解曲線，溫度增加梯度為每5秒增加0.5°C，β-actin作為內參基因。
[0119]QNLRC5-S: 5，-AACTTGGCCGAGAACAGC-3，
[0120]QNLRC5-A:5， -TTCCACAGGCGAATGACTT-3，
[0121]Qactin-S:5，-GTCATCACCATCGGCAACG-3’
[0122]Qactin-A:5，-AACAGTCCGCCTAGAAGCATT-3’[0123] 采用相對定量的2_ ΛΛετ法進行數據分析，以肌肉的表達量為參考基準，計算出其他各組織的相對表達量，繪 制柱形圖。
【權利要求】
1.一種豬NLRC5基因全長序列克隆方法，其特征在于是運用人類、小鼠等物種NLRC5基因已知片段設計分段擴增的引物，用豬的小腸組織提取總RNA，進行RT-PCR擴增，用擴增到的NLRC5基因片段作為已知序列，采用3’ RACE技術，獲得3’端未知序列，拼接獲得其全長cDNA序列；利用Real-time PCR技術檢測NLRC5基因在不同組織中的表達量。
2.如權利I所述之豬NLRC5基因全長序列克隆方法，其特征在于，所述獲得的全長cDNA全長序列如序列表中的SEQ ID:1所示，它的編碼區從第123個核苷酸到5660個核苷酸。
3.如權利要求1所述之豬NLRC5基因全長序列克隆方法，所述獲得的全長cDNA全長序列的氨基酸序列對應于序列表中的SEQ ID:2。
4.如權利要求1所述之豬NLRC5基因全長序列克隆方法，分段擴增的引物為:
IS:5’ -GGGCCTGTCCTATGGAAAGAA-3’
IA:5’ -CTGCTGTCGTAACGCTGCTG-3’
2S:5， -GGACCCCATTAGTCGCCAC-3，
2A:5’ -CAGCCACGCAGTGACATAGC-3’
3S:5， -TGGACAGAGACACACTTGCCC-3，
3A:5’ -GCCACCAGTTGACAGCCTTC-3’
4S:5’ -TGTCTCCGTGTCAACTCTCCTC-3’
4A:5’ -CCTCTGCTGTCACCGCTCA-3’
5S:5’ -ACGGTTTGTCCCTGGATGCT-3’
5A:5’ -GCCACGGCTTCTGGGTTCT-3’
6S:5， -AGGCAACGTCACTGAAATAAGC-3，
6A:5’ -CACAGGCGAATGACTTGGAT-3’
7S:5， -TCAACTTGGCCGAGAACAGC-3，
7A:5’ -AGGGGACCTGTGGCTGATG-3’
8S:5， -GACAACCAGACTGCCAAGCC-3，
8A:5’ -CTTGGGCCTTCTTGGAAACA-3’。
5.如權利要求1所述之豬NLRC5基因全長序列克隆方法，基因3’端添加含有一段特殊接頭引物的Oligo (dT) 18作為鎖定引物反轉錄合成第一鏈cDNA ;用基因特異引物GSP作為上游引物，用含有部分接頭序列的引物作為下游引物，以cDNA第一條鏈為模板，采用TaKaRa LA Taqt聚合酶進行巢式PCR，把目的基因3’末端的DNA片段擴增出來；RACE引物序列如下:
Race 引物:5，-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T) 18-3，
GSPl:5’ -GGAACTGGCTCACCCCTCCCGTA-3’
Out primer:5’ -GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’
GSP2:5， -CGCTGGACCCGGCCACTACCTCA-3’
Inner primer:5’ -CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3’。
6.一種NLRC5表達量的熒光定量檢測方法，利用熒光定量PCR技術檢測NLRC5基因在不同組織中的表達量，采用SYBR Green I實時熒光定量方法對NLRC5基因在豬不同組織表達量進行檢測分析，熒光定量引物如下:
【文檔編號】C12N15/10GK103820429SQ201310446798
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2013年9月26日 優先權日:2013年9月26日
【發明者】蘭道亮, 陳亞冰, 李鍵, 熊顯榮, 林寶山, 王樹茂 申請人:西南民族大學