一種全基因組dna甲基化的導向測序技術的制作方法

一種全基因組dna甲基化的導向測序技術的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種全基因組DNA甲基化的導向測序技術。本發明提供了一種新的核酸甲基化的測定方法。具體地說提供了一種核酸甲基化檢測的“定位”理念，即測序時部分序列用來定位，另一部分序列用于甲基化的檢測，從而徹底解決了全基因組甲基化檢測及生物信息學分析時遇到的定位問題。
【專利說明】—種全基因組DNA甲基化的導向測序技術
【技術領域】
[0001]本發明屬分子生物學-表觀遺傳學領域；更具體地，本發明涉及全基因組DNA甲基化的導向測序技術。
【背景技術】
[0002]DNA甲基化是表觀遺傳學的重要組成部分，其在維持正常細胞功能、胚胎發育、疾病發生以及人類腫瘤中發揮著至關重要的作用。DNA甲基化的水平，尤其是基因啟動子區甲基化的水平直接影響著基因的轉錄活性，控制著基因的表達，在生命過程中DNA甲基化扮演著重要的角色。因此DNA甲基化的研究在表觀遺傳學，甚至在整個生命科學領域都是研究的重中之重。
[0003]DNA甲基化的檢測方法很多，但根據其原理主要可以分為以下三類:
[0004]1.基于甲基化敏感限制性內切酶的方法
[0005]甲基化敏感的限制性內切酶(methylation-sensitiverestrictionendonucleases, MSREs)是一類對甲基化修飾敏感的內切酶。此類酶在其切割位點中含有一個甲基化堿基就可以阻斷該內切酶對DNA的切割，再通過Southern Blot或者PCR來檢測。這種方法中最常用的是HpaII和MspI這一對內切酶，HpaII和MspI識別序列相同但HpaII對甲基化敏感而MspI對甲基化不敏感，此法的優點是操作簡單，缺點是因為受到內切酶酶切位點的限制，對于可研 究的甲基化區域受到很大的限制。
[0006]2.基于DNA甲基化抗體的方法
[0007]基于抗體的DNA甲基化研究方法是應用甲基胞嘧啶抗體或是甲基化結合蛋白的抗體來研究DNA甲基化。其原理和操作都類似于ChIP，即將抗體親和的DNA片段進行芯片雜交或者測序。優點是可以在全基因組范圍內研究DNA甲基化的變化情況，但此方法缺乏精確性，無法知道單個堿基的甲基化情況，而且該方法容易受到基因組中不同區域CG含量的影響，從而對于基因組中低CG含量的區域缺乏敏感性。
[0008]3.基于亞硫酸氫鈉的方法
[0009]DNA甲基化的檢測方法中應用最廣的是基于亞硫酸氫鈉的方法。其優點在于可以精確檢測單堿基分辨率甲基化變化情況。這種方法的原理為DNA經過亞硫酸氫鈉處理后未被甲基化修飾的C (胞嘧啶)可轉變為U (尿嘧啶)，然而有甲基化修飾的C則不會發生改變，經過PCR擴增后測序，再與原序列對比就可以得到基因組中某段區域的甲基化修飾情況。
[0010]近年來隨著人們對DNA甲基化研究的深入，這些傳統的方法已經遠遠不能滿足研究的需要。隨著高通量測序技術的發展，DNA甲基化檢測也由單基因水平逐漸向整個基因組水平發展。這樣基于以上三種方法與高通量技術相結合又衍生出了很多方法:如MeDIP, RRBS, HELP等，但其中應用最廣，覆蓋基因組最多、最精確的方法為MethylC-seq。其原理為基因組DNA經過亞硫酸氫鈉處理后直接進行高通量測序，從理論上講，對測序結果進行分析后就可以得到整個基因組單堿基分辨率的甲基化修飾情況。但是實際操作中對MethylC-seq的數據進行分析時卻遇到了很大的問題:①由于亞硫酸氫鈉處理后基因組中大多數的胞嘧啶(C)都會轉變為胸腺嘧啶(T)，造成堿基不平衡，測序得到的結果比對(map)到參考基因組上效率有限，有的位置即使增大測序通量也無法得到DNA甲基化信息，所以到目前為止全世界還沒有繪制出任何一張細胞完整甲基化圖譜。Felix Krueger等人在 Nature Method (Nat Methods.2012Jan30 ；9(2): 145-51.)雜志上對于 DNA 甲基測序數據分析中遇到的問題進行了詳細的論述。②該檢測方法的設計策略缺陷也使其存在很強的傾向性，容易檢測出高甲基化區域，對低甲基化、CG含量少以及一些重復序列缺乏敏感度。
[0011]總體來說，到目前為止Methyic-seq是DNA甲基化研究比較好的方法，但是其本身的設計缺陷和檢測偏好性以及生物信息學分析時遇到的問題卻極大地阻礙了其應用。而本發明中所使用的定位理念可以徹底解決這些問題，把人們對DNA甲基化的研究提高到了一個新的高度。

【發明內容】

[0012]本發明的目的在于提供一種全基因組DNA甲基化的導向測序技術。
[0013]在本發明的第一方面，提供一種核酸甲基化的測定方法，所述的核酸是雙鏈，所述方法包括:
[0014](I)針對核酸雙鏈，利用具有3’ 一 5’方向切割功能的聚合酶或3’ 一 5’核酸外切酶處理，使兩條鏈分別在3’端產生80-200個堿基(較佳地100-150個堿基)缺失；
[0015](2)加入dNTP，其中的胞嘧啶(C)為甲基化修飾的胞嘧啶(5mC)，使雙鏈3’端的缺失被補平且其中的胞嘧啶為甲基化修飾的胞嘧啶；
[0016](3)處理步驟⑵的雙鏈，使未被甲基化修飾的胞嘧啶轉變為尿嘧啶(U)、甲基化修飾的胞嘧啶則不變；
`[0017](4) PCR擴增(該過程中尿嘧啶轉換為胸腺嘧啶(T))，進行甲基化測序，其中一部分序列中未甲基化的胞嘧啶(C)已轉變為胸腺嘧啶(T)，用于判斷甲基化位點；另一部分序列因胞嘧啶發生甲基化而與原核酸序列相同，用于數據分析時的序列定位；將兩部分序列比對(如果檢測的物種序列已知則不需要拼接；未知序列的物種可以將用于定位的那一端進行拼接后再進行甲基化比對)，從而得知核酸的甲基化狀況。
[0018]在本發明的另一方面，所述的核酸甲基化的測定方法同樣可用于單個基因位點的檢測，其中步驟⑷包括:設計用于擴增感興趣的基因位點的PCR擴增引物，一條引物定位于胞嘧啶發生甲基化的序列位置；另一引物定位于未甲基化的胞嘧啶已轉變為胸腺嘧啶的序列位置，進行PCR擴增，得到感興趣的基因位點的序列并進行甲基化分析。
[0019]在一個優選例中，步驟(3)或步驟(b)中，應用重硫酸鹽、重亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽或重亞硫酸氫鹽處理步驟(2)的雙鏈。
[0020]在另一優選例中，所述的核酸是長度大于2kb(如大于3kb、5kb、10kb)的核酸或是全基因組，在步驟(1)之前，還包括:將核酸序列進行打斷(較佳地，采用超聲打斷)，形成長度為200-1000bp (較佳地400-700bp ;更佳地500bp)的雙鏈片段。
[0021]在另一優選例中，步驟(2)中，在進行補平之后，還包括:在步驟(2)的雙鏈的兩端加上測序接頭，從而應用于高通量測序。
[0022]在另一優選例中，所述的測序接頭如下連接:在雙鏈的3’末端加上I個突出的A)，應用帶有(3’末端含有一個突出的T)的測序接頭與之連接；較佳地，所述的測序接頭是甲基接頭(Methyl Adapterjnillumina Methyl Adapter),后續采用高通量測序方法測序，例如 Illumina high seq2000, Illumina high seq2500> ABI solid、Roche454。
[0023]在另一優選例中，所述的胞嘧啶的甲基化修飾包括:CpG甲基化，CHG甲基化或CHH甲基化。
[0024]在另一優選例中，所述的具有3’ 一 5’方向切割功能的聚合酶包括(但不限于):T4DNA聚合酶，T7DNA聚合酶，Klenow酶； [0025]所述的3’ 一 5’核酸外切酶包括(但不限于):核酸外切酶III ;較佳地，當步驟
(I)應用3’一 5’核酸外切酶時，步驟(2)中還加入聚合酶；較佳地，所述的聚合酶包括(但不限于):Taq酶，Pfu,逆轉錄酶。
[0026]在另一優選例中，所述的T4DNA聚合酶處理的時間為60-140分鐘；較佳地為80-120 分鐘。
[0027]在另一優選例中，所述的核酸是DNA或RNA。
[0028]在另一優選例中，步驟⑷或步驟(C)中，與原核酸序列相同的序列為雙端測序中的一個read,或是單端測序中一個read的一部分(如單端測序為IOObp時前50bp用于定位，后50bp用于甲基化檢測)；較佳地，進行雙端測序，測序結果中，一端(readl或read2)核酸序列中未甲基化的胞嘧啶(C)已轉變為胸腺嘧啶(T)，用于判斷甲基化位點；另一端(read2或readl)序列因胞嘧啶發生甲基化而與原核酸序列相同，用于序列定位；將雙端序列進行比對，從而得知核酸的甲基化狀況。
[0029]本發明的另一方面，提供一種核酸序列的分析比對方法，包括:序列為雙端測序，一端序列作初步定位，另一端序列在其附近檢索，所述的方法包括:
[0030](a)將一端序列定位到基因組上，允許每個序列定位到基因組的多個位置；
[0031](b)為已定位到基因組上的序列匹配另一端序列；
[0032](c)根據在基因組中的初步定位，在其附近尋找另一端的位置；
[0033](d)若可獲得多個比對位置，選取最佳比對位置；
[0034](e)去除PCR產生的擴增序列；
[0035](f)分析基因組的甲基化水平，統計甲基化率。
[0036]在另一優選例中，所述的雙端序列是指在核酸序列5’端和3’分別作一定長度的測序，如在 Illumina Hiseq200, Illumina Hiseq2500,以及 Illumina Analyzer GenomeIIx上的Pair-End的測序；
[0037]在另一優選例中，所述的一端序列初步定位到基因組的多個位置是指定位到20個或50個以下的位置(但不限于如此)。
[0038]在另一優選例中，在初步定位的附近查找，是指根據測序文庫的大小的I至3倍作為查找的范圍；查找的方法包括(但不限于):字符比對，正則表達式檢索，序列檢索。
[0039]在另一優選例中，最佳比對位置的選取依據是:兩端之間的總長度是否在文庫的范圍之內；錯配數是否最低。
[0040]本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
【專利附圖】

【附圖說明】[0041]圖1、本發明實施方案中所描述的實驗流程圖。
[0042]圖2、本發明實施方案克隆測序的一個代表性read(SEQ ID NO:1)。
[0043]圖3、本發明實施方案克隆測序結果在UCSC genome browser中比對的結果。
[0044]圖4、本發明實施例1中超聲打斷的基因組的電泳結果。
[0045]圖5、本發明實施例5中膠回收去除多余接頭的結果。
[0046]圖6、本發明實施例7中PCR后的電泳結果，圖中顯示的DNA片段為400_700bp。
[0047]圖7、應用于單個基因位點的檢測的實驗流程圖。
【具體實施方式】
[0048]本發明人經過研究和探索，提供了一種新的核酸(包括DNA和RNA)甲基化的測定方法。具體地說提供了一種核酸甲基化檢測的“定位”理念，即測序時部分序列用來定位(與基因組序列相同)，另一部分序列用于甲基化的檢測(經過亞硫酸鹽處理后未甲基化的胞嘧啶變為尿嘧啶)，從而徹底解決了甲基化檢測生物信息學分析時遇到的定位問題。在此基礎上完成了本發明。
[0049]本發明是利用具有3’ 一 5’方向切割功能的聚合酶或3’ 一 5’核酸外切酶處理核酸雙鏈，使雙鏈產生3’缺失，然后加入的dNTP(其中胞嘧啶(C)為甲基化修飾的胞嘧啶(5mC))，以聚合酶會使雙鏈上缺失部分產生5’向3’延伸，使核酸鏈的3’缺失補平并將5mC摻入到3’端。這樣經過亞硫酸氫鹽(或其類似物)處理后進行雙端測序，測序的一端(readl)C就會變為T，而另一端(read2)由于C都為甲基化的C則保持原基因組序列不變，這樣readl可以對基因組的甲 基化程度進行分析，而read2就可以在基因組中進行map，這樣就徹底解決了甲基化測序中數據分析的問題。
[0050]使雙鏈產生3’端缺失的酶可以是具有3’ 一 5’方向切割功能的聚合酶或3’ 一 5’核酸外切酶。其中，所述的具有3’ 一 5’方向切割功能的聚合酶包括但不限于:T4DNA聚合酶，T7DNA聚合酶，Klenow酶。所述的3’ 一 5’核酸外切酶包括但不限于:核酸外切酶III。
[0051]作為本發明的優選方式，應用具有3’ 一 5’方向切割功能的聚合酶，這樣，在需要使得雙鏈產生3’端缺失時，其可發揮3’ 一 5’方向切割功能；當需要使得3’端在加入dNTP后延伸時，其可發揮聚合酶的作用。最優選地，所述的具有3’ 一 5’方向切割功能的聚合酶是T4DNA聚合酶。
[0052]當應用3’ 一 5’核酸外切酶使得雙鏈產生3’端缺失時，后續需要進一步加入聚合酶來使得3’端在含有dNTP的情況下延伸。
[0053]亞硫酸氫鹽處理后測序(bisulfite sequencing PCR, BSP)方法是檢測基因甲基化的經典方法，其原理為:用亞硫酸氫鹽修飾處理基因組DNA，所有未發生甲基化的胞嘧啶(C)被轉化為尿嘧啶(U)而甲基化的胞嘧啶則不變。因而，經過亞硫酸氫鹽或重亞硫酸氫鹽處理核酸后，甲基化的位點產生類似于一個C/T的多核苷酸多態性(SNP)。基因組DNA經亞硫酸鹽處理后，擴增目的片段，此時尿嘧啶⑶全部轉化為胸腺嘧啶(T)，最后對PCR產物進行測序就可以判斷是否發生甲基化。
[0054]本發明的方法適用于長度較長的核酸，例如長度大于IOkb的核酸或是全基因組。本發明的方法也可以應用于短的核酸。對于不同長度的核酸，在核酸打斷時需要控制長度，例如可通過控制超聲打斷時的超聲時間來控制長度。對于較長的核酸，先進行核酸序列的打斷，以有利于后續的操作。本發明對于將核酸打斷的方法沒有特別的限制，可以應用本領域已知的各種方法；較佳地，采用超聲打斷的方法。超聲的條件主要取決于所應用的超聲設備核酸的G+C含量和所需片段的大小等。本實驗應用BioRuptor公司生產的非接觸式超聲儀進行超聲打斷一般來說如果基因組G+C含量在50%左右，最高功率超聲6次，每次30秒間歇30秒，可得到400-700bp左右的片段。應用不同的超聲系統，如要獲得較佳的超聲條件，可以根據電泳情況來獲得超聲打斷后的序列片段的大小。
[0055]作為本發明的優選方式，將長的核酸或基因組序列打斷，以形成長度為200-1000bp ;較佳地400-700bp ;更佳地500bp的雙鏈片段。
[0056]當核酸序列較長時或針對全基因組序列進行測定時，需要采用高通量測序技術。此時，在使雙鏈3’端的缺失被補平且其中的胞嘧啶為甲基化修飾的胞嘧啶后，還包括:被補平的雙鏈的兩端加上測序接頭，從而應用于高通量測序。本發明中，所述的測序接頭是指配合一些高通量測序技術而涉及的核酸接頭，本領域技術人員清楚針對具體的測序技術所應用的測序接頭，例如，Illumina公司的測序技術為廣大用戶提供了強大的高通量測序方法，其提供商品化的測序接頭以便于待測序列與其測序儀器實現對接；Illumina測序技術以外的其它測序技術及其測序接頭也是商品化的或是本領域技術人員所了解的。
[0057]本發明的方法同樣適用于起始于核酸單鏈的測序，通過在合成第二鏈時摻入胞嘧啶(C)發生甲基化修飾的dNTP，使得后續的亞硫酸氫鹽處理后，合成的核酸雙鏈的兩條鏈中一條鏈后續堿基不轉變，而未甲基化修飾的鏈胞嘧啶發生轉變。因此，測序時一條序列用來定位，另一條序列用于甲基化的檢測。
[0058]本發明的方法不但可以直接檢測整個基因組甲基化的水平，而且還可以與其他方法聯合使用，如RRBS，從而提高RRBS的map效率。此外本方法還可以對未知物種進行測序，利用read2進行序列的拼接，而readl檢測甲基化水平，這樣可以同時得到這個物種的基因組序列和基因組甲基化水 平。本發明的甲基化測序是指胞嘧啶上的甲基化，包括CpG甲基化，CHG甲基化和CHH甲基化。
[0059]本發明克服了現有甲基化檢測技術的缺點，以高通量高分辨率為目的，可以真正做到在全基因組范圍內、單堿基分辨率研究DNA甲基化的分布情況，得到表觀基因組的同時也可得到基因組的信息。
[0060]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0061]以下實施例主要為檢測組織及細胞中全基因組DNA甲基化情況，整個過程包括超聲打斷DNA，T4DNA聚合酶處理，末端加“A”，接頭連接，膠回收去接頭，重亞硫酸氫鈉處理，PCR擴增等步驟，主要流程如圖1。
[0062]實施例1、超聲打斷DNA
[0063]將提取好的人類細胞系293T基因組DNA3ug溶解于250ul超純水中，使用合適的超聲條件將DNA打斷至400-700bp左右的片段，使用QIAGEN公司PCR回收試劑盒回收超聲產物，具體的操作步驟為在超聲產物中加入5倍體積(Iml)緩沖液PB，輕彈充分混勻，瞬離，轉至柱子中，13000rpm離心lmin。去除洗脫液體。加入750ul緩沖液PE (已加乙醇)，13000rpm離心lmin,同上去除液體。再加入500ul bufferPE,再次洗漆一次,去除液體,蓋上蓋子，空轉2min,打開蓋子，靜置，晾干。加入170ul超純水靜置l-2min, 13000rpm尚心lmin,洗脫液備用。
[0064]超聲打斷的基因組進行電泳，結果如圖4，從圖中可以看出超聲3min時DNA已經超聲到1000bp到200bp之間，且主要集中在500bp左右。
[0065]實施例2、T4DNA聚合酶處理
[0066]在回收產物中依次加入下列試劑:
[0067]10XNEB 緩沖液 220ul
[0068]T4DNA 聚合酶IOul
[0069]輕彈充分混勻，瞬離(1000g離心30秒時間)，12 °C酶切IOOmin約切除3’端100-150個堿基；之后，加入終濃度為IOmM的dNTP (其中胞嘧啶為甲基化修飾胞嘧啶即5mC)，輕彈充分混勻，瞬離(1000g離心30秒)，37°C 15min。PCR回收(過程同上)，最終用42ul超純水洗脫備用。
[0070]實施例3、3’末端加I個“A”
`[0071]在回收產物中依次加入下列試劑:
[0072]10XNEB 緩沖液 25ul
[0073]IOmM dATP1.5ul
[0074]缺失了 3’到5’外切酶活性的Klenow 3ul
[0075]輕彈充分混勻，瞬離，37°C，lh，使用QIAGEN公司Mini Elute PCR回收試劑盒回收，17.5ul超純水洗脫備用。
[0076]實施例4、接頭連接
[0077]在回收產物中依次加入下列試劑:
[0078]10XT4DNA 連接緩沖液2.5ul
[0079]Illumina 甲基接頭(Illumina Methyl Adapter) 5ul
[0080]T4DNA 連接酶Iul
[0081]輕彈充分混勻，瞬離，16°C連接過夜。其中，Illumina Methyl Adapter是illumina公司生產的用于甲基化高通量測序的接頭。
[0082]實施例5、膠回收去除多余接頭
[0083]1.配膠
[0084]用80_90ml TAE配制2%(重量比)的瓊脂糖(Invitrogen)，在微波爐中煮熟沸騰2-3次，待瓶子不燙時，加入EB3ul，充分混勻，倒板。
[0085]2.電泳
[0086]樣品中加入5ullOX上樣緩沖液,準備IOObp marker,兩邊加marker,中間加樣品，注意不同樣品間隔一個孔，防止污染。150V電泳40min。
[0087]3.割膠
[0088]先用紙蘸取TAE清洗紫外凝膠成像載物臺，鋪上保鮮膜。盡量減少膠在紫外下照射的時間。15ml離心管稱重，記錄。割取400-700bp的凝膠片段，記錄膠在切割前后的照片，將膠放入管子中。稱量，記錄。
[0089]4.膠回收[0090]使用QIAGEN 公司 Gel Extractionmini elute kit 回收凝膠中的 DNA,IOOmg=IOOul體積,加入3倍體積Buffer QG, 42°C IOmin,每隔2_3min混勻一次直至完全溶解。瞬離，加入一倍體積的異丙醇，瞬離，每次取750ul至Elute柱，13000rpm離心lmin,加A 500ul BufferQG,離心 lmin。加入 750uL BufferPE,離心 lmin,再一次加入 500ul bufferPE洗滌，空轉2min，打開蓋子，靜置，晾干，加入22ul超純水，靜置l_2min，13000rpm離心lmin,回收備用。
[0091]膠回收去除多余接頭的結果如圖5，左圖中400bp以上的大片段為超聲后的基因組DNA，200bp左右的小片段為要去除的接頭DNA。右圖中所示為切較后凝膠圖片，圖中400-700bp大小的DNA已經切去并進行回收。
[0092]實施例6、重亞硫酸氫鈉處理DNA
[0093]使用Zymo-Research公司甲基化試劑盒處理上述回收產物,將20ul回收產物加Λ 130ul CT轉換試劑(CT Conversion Reagent)中，將瞬離后的樣品放入PCR儀,設定反應程序如下:98°C，IOmin ；64°C，2.5h ；4°C，00 ;將 Zymo 柱(Zymo-Spin (TM) IC Column)放入收集管(Collection Tube)中，加入600ul M-結合液(Μ-Binding Buffer),然后加入反應后的樣品，蓋緊，顛倒混勻；12, OOOrpm?10, OOOg)離心30s ;加入IOOul M-清洗液(M-WashBuffer)，12, OOOrpm 離心 30s ;加入 200ul M-脫橫化液(M-Desulphonation Buffer)，室溫(20 ~30°C )靜置 15 ~20min，12，OOOrpm 離心 30s ;加入 200ul M-清洗液(M-WashBuffer)，12，OOOrpm離心30s，去除收集管中的廢液；重復清洗一次；將柱子移入干凈的1.5ml EP管中，在柱子底部加入 IOul M-溶解液(Μ-Elution Buffer), 12，OOOrpm離心30s,洗脫液備用。
[0094]實施例7、PCR擴增
[0095]由于亞硫酸氫鈉處理后的DNA片段中C轉變為U，普通的高保真酶無法識別U從而造成處理后的片段無法擴增，本實驗中使用KAPA公司生產的2xKAPA mix進行擴增，可以克服這一問題。
[0096]在PCR管中加入下列試劑:
[0097]
【權利要求】
1.一種核酸甲基化的測定方法，其特征在于，所述的核酸是雙鏈，所述方法包括: (1)針對核酸雙鏈，利用具有3’一 5’方向切割功能的聚合酶或3’ 一 5’核酸外切酶處理，使兩條鏈分別在3’端產生80-200個堿基缺失； (2)加入dNTP，其中的胞嘧啶為甲基化修飾的胞嘧啶，使雙鏈3’端的缺失被補平且其中的胞嘧啶為甲基化修飾的胞嘧啶； (3)處理步驟(2)的雙鏈，使未被甲基化修飾的胞嘧啶轉變為尿嘧啶、甲基化修飾的胞嘧啶則不變； (4)PCR擴增，進行甲基化測序，其中一部分序列中未甲基化的胞嘧啶已轉變為胸腺嘧啶，用于判斷甲基化位點；另一部分序列因胞嘧啶發生甲基化而與原核酸序列相同，用于數據分析時的序列定位；將兩部分序列比對，從而得知核酸的甲基化狀況。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)或步驟(b)中，應用重硫酸鹽、重亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽或重亞硫酸氫鹽處理步驟(2)的雙鏈。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的核酸是長度大于2kb的核酸或是全基因組，在步驟(1)之前，還包括:將核酸序列進行打斷，形成長度為200-1000bp的雙鏈片段。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，應用于感興趣的基因位點的檢測，其中步驟(4)包括: 設計用于擴增感興趣的基因位點的PCR擴增引物，一條引物定位于胞嘧啶發生甲基化的序列位置；另一引物定位于未甲基化的胞嘧啶已轉變為胸腺嘧啶的序列位置，進行PCR擴增，得到感興趣的基因位點的`序列并進行甲基化分析。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，在進行補平之后，還包括:在步驟(2)的雙鏈的兩端加上測序接頭，從而應用于高通量測序。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的測序接頭如下連接:在雙鏈的3’末端加上I個突出的A，應用帶有3’末端含有一個突出的T的測序接頭與之連接；較佳地，所述的測序接頭是甲基接頭，后續采用高通量測序方法測序，例如Illumina high seq2000,Illumina high seq2500、ABI solid、Roche454。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的胞嘧啶的甲基化修飾包括:CpG甲基化，CHG甲基化或CHH甲基化。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的具有3’一5’方向切割功能的聚合酶包括:T4DNA聚合酶，T7DNA聚合酶，Klenow酶； 所述的3’ 一 5’核酸外切酶包括:核酸外切酶III ;較佳地，當步驟(1)應用3’ 一 5’核酸外切酶時，步驟(2)中還加入聚合酶；較佳地，所述的聚合酶包括:Taq酶，Pfu,逆轉錄酶。
9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)中，與原核酸序列相同的序列為雙端測序中的一個read，或是單端測序中一個read的一部分；較佳地，進行雙端測序，測序結果中，一端核酸序列中未甲基化的胞嘧啶已轉變為胸腺嘧啶，用于判斷甲基化位點；另一端序列因胞嘧啶發生甲基化而與原核酸序列相同，用于序列定位；將雙端序列進行比對，從而得知核酸的甲基化狀況。
10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)中，核酸序列的分析比對方法為雙端測序，一端序列作初步定位，另一端序列在其附近檢索，所述的方法包括:(a)將一端序列定位到基因組上，允許每個序列定位到基因組的多個位置；(b)為已定位到基因組上的序列匹配另一端序列；(c)根據在基因組中的初步定位，在其附近尋找另一端的位置；(d)若可獲得多個比對位置，選取最佳比對位置；(e)去除PCR產生的擴增序列；(f)分析基因組的甲基化水平，統計甲基化率。
【文檔編號】C12Q1/68GK103555856SQ201310572289
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月15日 優先權日:2013年11月15日
【發明者】于文強, 李巖, 吳飛珍 申請人:復旦大學