一種具有抗癌作用的小肽ltf及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種具有抗癌活性的小肽LTF，它具有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；所述小肽LTF在較低濃度下具有抗癌活性，在相應濃度時對正常細胞的生長無影響。本發明還公開了所述小肽在制備抗癌藥物中的應用以及在制備轉基因生物中的應用。
【專利說明】一種具有抗癌作用的小肽LTF及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物醫學領域，涉及腫瘤治療和預防，具體涉及具有抗癌作用的小肽及其應用。
【背景技術】
[0002]腫瘤已成為威脅人類健康的主要疾病之一，隨著不健康、不均衡的飲食習慣及環境污染等的影響，腫瘤的發病率正在逐年攀升。中國抗癌協會公布的統計數字顯示，我國近年來乳腺癌發病率正以每年3%的速度遞增，發病年齡也呈逐漸年輕化的趨勢，是城市女性死亡率增長最快的癌癥。在中國主要城市北京、上海、天津等，10年來乳腺癌發病率增長了37%，死亡率增長了 38.9%。在未來10年，我國將面臨癌癥發病和死亡的雙重負擔。目前，癌癥的主要治療手段是手術治療、放療、化療以及近年來發展起來的靶向治療。然而，就療效而言，除早期病人可經手術切除治愈外，對中晚期病人，尤其是有遠處轉移的晚期病人，目前尚無有效的根治性治療。鑒于此，尋找、低毒性，新型抗腫瘤藥物仍然是腫瘤研究者，腫瘤藥物學家及各大生物醫藥公司研究的重點及攻關方向。
[0003]近年來小分子蛋白肽在人體中的作用已引起科學界的高度重視。大量研究結果表明，蛋白質攝入后并不完全水解成氨基酸，而是大部分以肽的形式吸收，同時發現肽被吸收的速度比同組成的氨基酸要快。多肽涉及人體的激素、神經、細胞生長和生殖等各個領域、可被廣泛用于醫療衛生，保健食品等方面。多肽類藥物的主要特點是用量小，生物活性強，對癌癥，自身免疫性疾病等有顯著療效和廣泛的應用前途。隨著醫學及生物化學技術的發展，多肽類藥物將成為21世紀重要的治療、診斷、及預防性藥物。因此開展多肽藥物的研究具有重要的科學和健康意義。多肽類藥物的研究主要包括抗腫瘤多肽，抗菌活性多肽，多肽導向藥物，多肽疫苗，細胞因子模擬太，診斷用多肽及其它藥用小肽等7大類。本發明就是涉及一種可用于抗腫瘤治療的小分子多肽。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供一種能夠抑制腫瘤生長，用于腫瘤治療的小分子肽(命名為小肽LTF)。所述小肽LTF，它是SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列；其所示信息為:長為9氨基酸，具體序列為:Pro Lys He Lys Glu He Ala Ala Lys (或 PKIKEIAAK)。
[0005]本發明的小肽具有抗腫瘤細胞生長的活性，同等濃度下對人正常細胞生長無抑制活性，可用于癌癥的治療以及用作動植物轉基因源頭序列與保健防癌食品的開發。
[0006]相應地，本發明還提供所述小肽LTF在制備抗腫瘤藥物中的應用。包括小肽LTF在制備腫瘤治療性疫苗中的應用。
[0007]功能實驗已證實小分子肽LTF具有抗腫瘤活性，因此本領域普通技術人員知道，由于本發明的小肽B為線性序列，無任何修飾，根據密碼子表，此小肽可以由其氨基酸對應的三聯體密碼堿基序列的任意組合獲得相應的核苷酸序列，根據密碼子的簡并性，相對該序列可以獲得的核酸序列可達74左右。 所述的核酸序列可以作為功能基因用于制備轉基因動物及植物，創造新品種及表達功能蛋白(或小肽)。因而本發明還提供編碼所述小肽的的核苷酸序列及其應用。將此核酸序列通過載體或直接注射入需要轉入基因的動物、植物或微生物體內，使遺傳信息進行翻譯表達便可。例如:以轉基因微生物為例:簡述如下，由本發明的小肽LTF可以獲得如下核酸序列5’-cct aag att aaa gag ate get gca aag_3’(SEQ ID NO:2),將此核酸序列人工合成后，以常規方法連入基因工程載體如大腸桿菌的表達載體PQE30L，轉化DH5a，獲得陽性克隆后，過夜培養，轉培養3_4小時后，用IPTG誘導表達，便可獲得轉入核酸片段，同時有外源性多肽產生的轉基因微生物新品種，其這種表達方法的具體操作非常常規。
[0008] 鑒于本發明所述的小肽LTF有特異性抗癌細胞的作用，因此本領域普通技術人員可以人工合成以后，作為有防癌效果的保健食品或食品成分在工業生產，食品開發等中使用。本發明所述小肽LTF在制備預防癌癥的保健食品中的應用。
[0009]功能實驗顯示:本發明所述小肽LTF能抑制肝癌，肺癌，乳腺癌，及甲狀腺癌等癌細胞株的生長，提示其在癌癥臨床治療中具有重要的開發和應用價值，可用來開發抗腫瘤多肽藥物。本發明提供的氨基酸長度小于10個，其不需要任何修飾連接，為線性多肽，且人工合成方便，實驗證明其具有有效的抑制癌細胞，抗腫瘤生長的功能，對人正常細胞無毒性。因此，上述也表明了本發明的優點所在。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0010]圖1.小肽LTF抑制肺癌細胞(H460)生長活性。用MTT法測定不同小肽LTF濃度下活性細胞的數量。
[0011]圖2.小肽LTF抑制乳腺癌細胞(MCF7)生長活性。用MTT法測定不同小肽LTF濃度下活性細胞的數量。
[0012]圖3.小肽LTF抑制肝癌細胞(MCF7)生長活性。用MTT法測定不同小肽LTF濃度下活性細胞的數量。
[0013]圖4.小肽LTF對正常乳腺上皮細胞MCFlOA生長無抑制活性。用MTT法測定不同小肽LTF濃度下活性細胞的數量。
[0014]圖5.小肽LTF抑制小鼠乳腺移植瘤生長。用熒光素酶標記的MCF7細胞(IxlO7細胞/注射)與等體積基底膜基質蛋白(Matrigel basement membrane matrix) (BDBiosciences, NJ)混合,皮下注射到4_6周齡的裸鼠。形成明顯腫瘤后，動物隨機分組，用小肽LTF處理。左:小肽LTF，注射量I mM ;右:生理鹽水(PBS)對照。
[0015]
【具體實施方式】
[0016]下面通過【具體實施方式】的詳細描述來進一步闡明本發明，但并不是對本發明的限制，僅僅作示例說明。
[0017]實施例1:多肽的設計與合成
利用蛋白質分析數據庫(http://www.expasy.0rg/)及蛋白質資料庫(http://www.rcsb.0rg/pdb/home/home.do)分析已知活性的多肽序列與設計的多肽序列的二級結構的相似度，結合其它物理化學參數預測進行設計序列的修正。[0018]多肽序列送至生物公司合成或利用自動多肽合成儀合成全序列。HPLC檢測純度要大于96%，同時通過質譜檢測確定多肽合成質量。樣品以凍干狀態保存。
[0019]其中，合成后的多肽進行抗癌功能檢測篩選，獲得具有抗癌活性的多肽序列，試驗序號為23號肽，本發明中命名為小肽LTF，其氨基酸序列為Pro Lys He Lys Glu He AlaAla Lys (SEQ ID NO:1)?
[0020]實施例2:利用MTT法檢測小肽LTF體外抑癌活性
1.材料與試劑
O小肽LTF，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。
[0021]2) H460細胞(人非小細胞肺癌株系)、MCF7細胞(人乳腺癌細胞株系)、H印G2細胞(人肝癌細胞株系)、HT2細胞(人甲狀腺癌細胞株系)，MCFlOA細胞(人正常乳腺上皮細胞株系)，中科院細胞庫/中科院上海生命科學研究院細胞資源中心。
[0022]3) RPMI 1460培養基，美國GIBCO公司產品。
[0023]4) DMEM培養基，為美國HyClone公司產品。
[0024]5)新生小牛血清,為美國HyClone公司產品。
[0025]6) 二甲基亞砜(DMS0)，四甲基偶氮唑(MTT)和胰蛋白酶為Sigma公司產品。
[0026]2.實驗
I)用稀釋液(無菌PBS或無菌水或者相應的細胞培養基)將小肽LTF稀釋至ImM的初始測量濃度，過濾除菌，分裝于_20°C凍存。
[0027]2)細胞培養:癌細胞采用肺癌細胞(H460)、乳腺癌細胞(MCF7)、肝癌細胞(HepG2),以及正常乳腺上皮細胞MCF10A。所述各種細胞于含10%小牛血清的RPMI 1640或DMEM培養液中(含100U/ml青霉素和鏈霉素)培養，細胞每2_3天傳代I次；正常細胞于
4-5天傳代一次。細胞生長呈80%左右融合狀態時，采用胰酶消化的方法分離細胞，用相應的培養基制備單細胞懸液并調整合適的細胞濃度，分瓶傳代，置37°C 5%C02的濕化環境中培養。
[0028]3)細胞已貼壁后，棄去孔中原培養基，實驗組分別加入含有梯度稀釋(在初始濃度基礎上以10倍體積稀釋)肽的IOOul培養基。陰性對照組加入含有同等濃度稀釋液的同體積培養基，37°c 5%C02的濕化環境中培養72小時。
[0029]4)顯微鏡下觀察細胞生產狀態，然后每孔加入20ul (5mg/ml)MTT溶液。培養4小時。
[0030]5)小心吸盡孔中液體，每孔加入150ul，DMSO,置于WD-9405B型水平搖床輕搖IOmin ；以便紫色結晶充分溶解于DMSO中。
[0031]6)使用Model680酶標儀測定每孔在570nm處的吸光值,記錄數據。
[0032]7)利用sigmaplotlO和excel軟件分析處理數據。
[0033]結果顯示，小肽LTF在小于ImM濃度下能抑制肺癌、肝癌、乳腺癌細胞株的生長，抑制效果濃度與濃度相關，結果見附圖中圖1至3。同時，同等濃度下人正常MCF10A細胞無明顯抑制，結果見圖4。
[0034]本發明的小肽LTF序列具有的對腫瘤細胞的選擇性殺傷能力使其可以直接用于制備癌癥治療的臨床藥物，或者開發為聯合化療的臨床藥物使用，有較好的應用前景。
[0035]實施例3:NF- K B/p65S536D抑制小鼠移植瘤生長實驗用小鼠為4-6周齡的裸鼠。用熒光素酶標記的HCTl 16細胞(IxlO7細胞/注射)與等體積基底膜基質蛋白(Matrigel basement membrane matrix) (BD Biosciences, NJ)混合，皮下注射到4-6周齡的裸鼠(Harlan實驗室，Madison, WI)。形成明顯腫瘤后,動物隨機分組。分別經腹腔內注射小肽LTF (250，500及1000 uM)或生理鹽水，每隔日一次。在不同的時間節點，測量腫瘤體積。其方法是用150mg/kg D-突光素(D-luciferin, Goldbiotechnology, MO)腹腔給藥,用體內生物發光法成像并定量(Caliper lifesciences,MA)。注射小肽LTF (1.0 mM)或生理鹽水的結果如圖5的示，表明所述小肽LTF能夠抑制小鼠乳腺移植瘤生長。`
【權利要求】
1.一種可用于抗癌治療的小肽LTF，其特征在于，所述抗腫瘤小肽LTF為九肽，其所示序列為:SEQ ID N0.1。
2.一種編碼權利要求1所述的小肽LTF的核苷酸。
3.如權利要求2所述的核苷酸，其特征在于，其序列如SEQID N0.2所示。
4.如權利要求1所述的小肽LTF、或權利要求2至3任一項所述的核苷酸在制備腫瘤治療性疫苗中的應用。
5.如權利要求1所述的小肽LTF、或權利要求2至3任一項所述的核苷酸在制備抗腫瘤的藥物中的應用。
6.如權利要求1所述的小肽LTF、或權利要求2至3任一項所述的核苷酸在制備預防癌癥的保健食品中的應用。
7.如權利要求1所述的小肽LTF的制備方法，其特征在于，采用固相合成法制備小肽LTF。
8.如權利要求1所述的小肽LTF的制備方法，其特征在于，采用基因重組方法合成。
9.如權利要求8所述的小肽LTF的制備方法，其特征在于，將權利要求2所述的核苷酸通過載體或直接注射入需要轉入基因的生物體內，再通過翻譯表達獲得所述小肽LTF。
10.如權利要求9所述的小肽LTF的制備方法，其特征在于，將權利要求2所述的核苷酸重組入重組表達載體中，轉化微生物，篩選陽性克隆后，再通過誘導表達獲得所述小肽LTF。
【文檔編號】C12N15/12GK103613644SQ201310669173
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年12月11日 優先權日:2013年12月11日
【發明者】祝躍球 申請人:湖南萊拓福生物科技有限公司