用于培養豬孤雌激活胚及體外受精胚胎的體外培養液的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種豬體外胚胎培養液。本發明所提供的豬體外胚胎培養液，是在NCSU-23胚胎培養液中加入終濃度為0.05～5.00μg/mL的川芎嗪后得到的培養液。本發明所提供的豬體外胚胎培養液中加入了中藥單體成分——川芎嗪，實驗證明，利用該培養液對豬孤雌激活胚和體外受精胚胎進行體外培養，可有效提高胚胎發育效率及囊胚內細胞團及其總細胞數量。本發明為其他生物技術、醫學研究以及畜牧業發展奠定基礎，同時為闡明豬早期胚胎發育機制提供一定的理論基礎。
【專利說明】用于培養豬孤雌激活胚及體外受精胚胎的體外培養液
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種豬體外胚胎培養液，特別涉及一種用于培養豬孤雌激活胚及體外受精胚胎的體外培養液。
【背景技術】
[0002]動物胚胎的體外培養是胚胎生物技術中的重要環節。在體外培養條件下，早期胚胎往往不能完成從受精卵到囊胚的發育全過程，而停頓在某個特定發育時期，這一現象被稱為胚胎體外發育阻斷(in vitro block of embryonic development),因而嚴重影響早期胚胎體外發育質量，如豬體外囊胚發育率一般僅為20%左右，內細胞團數量在3個左右，導致后代的出生率下降，極大地阻礙了豬在農業、生物工程和醫學中的研究應用。
[0003]動物胚胎的體外培養與三方面的因素有關，即胚胎種類、培養條件和培養液的成分，其中培養液成分的改進是體外培養的技術的基礎和關鍵環節所在，直接影響到體外培養效果和體外生產胚胎的質量。
[0004]能量代謝是胚胎在體外發育過程中的基本生命活動，能量物質是胚胎培養液中的重要成分。丙酮酸、乳酸、葡萄糖、谷氨酰胺等作為能源物質，其作用機理，不同動物有差異。尤其是葡萄糖對早期胚胎培養的作用已證實對小鼠、倉鼠的受精卵有顯著的抑制作用，是胚胎克服發育阻斷的障礙。豬也有類似的現象，2-細胞和4-細胞的豬體外發育胚胎對葡萄糖的需求低于桑椹胚和囊胚期的胚胎。
[0005]氨基酸和維生素是胚胎發育所必需的。氨基酸是蛋白質合成的前提，同時也參與能量代謝，故大多數培養液中含有氨基酸。維生素作為碳水化合物和氨基酸代謝過程中必不可少的成分，能促進細胞對葡萄糖的攝取和乳糖的合成，從而影響胚胎的代謝和發育。在輸卵管和子宮液中有20~25種哺乳動物所需要的必需和非必需氨基酸，其中牛磺酸、天門冬氨酸、甘氨酸和谷氨酸的含量很高。谷氨酰胺可作為小鼠、倉鼠、豬胚胎發育的重要能源物質，對致密化后期的胚胎發育有利，促進胚胎向囊胚發育和胚泡的形成，并增加滋養層細胞的數量和囊胚的孵化能力。
[0006]無機鹽離子是培養液中不可缺少的組成部分，它不僅是培養液滲透壓的主要維持者，而且其本身也直接或間接的參與胚胎代謝過程。哺乳動物輸卵管液以高濃度的K+為特征。由于胚胎能在較寬的離子濃度范圍正常培養，因此尋找培養基的最佳離子組成比較繁雜。在眾多無機鹽離子中，Mg2+是許多酶，特別是糖酵解和三羧酸循環中許多酶的輔酶，在能量代謝中可能起到重要作用；Ca2+對維持細胞膜的穩定性、通透性以及細胞之間的連接有重要的作用，對桑椹胚的緊縮及囊胚的形成和擴展起至關重要的作用。
[0007] 血清是天然培養基中最有效和最常用的培養成分，它含有許多維持細胞生長繁殖和保持細胞生物學性狀不可缺少的未知成分。血清的已知成分主要有蛋白質、氨基酸、葡萄糖、激素、生長因子等。胚胎培養時,一般加入牛血清、羊血清、兔血清等,及牛血清白蛋白(BSA)0血清加入有利于胚胎發育，但因廠家、批次不同，培養效果相差甚遠。血清來源不同效果不同，牛血清有胎牛血清(FCS)(來源少，價格高)、新生犢牛血清(NCS)(剛產下未哺乳的小牛)、小牛血清(CS)(哺乳后的小牛，含有更復雜的成分)、發情牛血清(OCS)、閹公牛血清(SS)。因此，選擇血清也是培養的關鍵。
[0008]在胚胎發育過程中研究較多的生長因子主要為胰島素樣生長因子(IGF-1、IGF-1I)和表皮生長因子(EGF)。IGF-1, IGF-1I及其受體基因在早期胚胎中均有表達，IGF-1在輸卵管及子宮分泌物中存在，IGF-1可以通過改變凋亡相關基因減輕豬孤雌胚體外發育中早期胚胎凋亡的發生。NCSU-23培養液中有或無BSA時添加10或100ng/ml IGF-1并沒有明顯改善孤雌胚的發育率；然而，在有BSA存在時，IGF-1卻增加了囊胚細胞數。EGF是血清和卵泡液中都存在的生長因子，無血清培養液中加入EGF能促進牛胚胎的發育，增加蛋白質的合成和囊胚的孵化率，但不增加囊胚中的細胞數量，有的研究則認為EGF的作用僅表現在促進孵化，也有研究發現EGF也能增加囊胚細胞數量。豬克隆胚胎和體外受精胚在成熟的卵母細胞、桑椹胚和囊胚均有EGF mRNA的表達。而且，EGF的表達量在2-細胞后有減少的趨勢，因此可以推測2-細胞后添加EGF有可能促進胚胎發育；同時發現EGFR僅在2-細胞、桑椹胚和囊胚階段表達，而在4-8細胞內未見表達。可推測，在胚胎不同發育階段，EGF通過與其受體的相互作用而對胚胎發育產生直接或間接的影響
[0009]除上述的常規添加成分外，一些學者也曾嘗試過在豬培養液中添加一些其他成分，以提高胚胎卵裂率和囊胚率等。如培養基中加入適當濃度的EDTA-Na2、20g/L馬尾藻類多糖、亞硒酸鈉等。
[0010]綜上所述，隨著研究者們對胚胎早期發育的環境需求及自身代謝特性認識的不斷深入，體外胚胎的的發育率和質量有了相應的提高，但仍無法從根本上解決培養系統存在的缺陷，囊胚發育率及其細胞數量較少等問題未能得到很好的改善。
[0011]近年來，中草藥以其低毒副作用、無抗藥性、相對安全、不良反應少等特點被廣泛的應用于醫藥、飼料、化妝、食物等領域，其新的作用和機理也不斷的被發現。多方面的研究，顯示出其具有從整體上、多靶點、全方位改善機體生理狀況的藥理特點。而早期胚胎的發育和細胞的增殖與其適宜的微環境密切相關，因此，根據胚胎不同發育階段的營養需要和代謝特點，建立適宜早期胚胎體外生長發育的培養體系，以尋找新的途徑和方法改善早期胚胎體外培養的微環境，從而提高體外胚胎發育質量顯得尤為重要。
【發明內容】
[0012]本發明的目的是提供一種豬體外胚胎培養液。
[0013]本發明所提供的豬體外胚胎培養液，具體為在NCSU-23胚胎培養液中加入終濃度為 0.05 ~5.00 μ g/mL (如 0.05 ~0.50 μ g/mL 或 0.50 ~5.00 μ g/mL,具體如 0.05 μ g/mL、0.50 μ g/mL或5.00 μ g/mL)的川芎嗪后得到的培養液。
[0014]所述NCSU-23胚胎培養液，具體為將NCSU-23基礎培養液、D-葡萄糖、L-谷氨酰胺、牛磺酸、亞牛磺酸、L-半胱氨酸、青霉素、硫酸鏈霉素，以及牛血清白蛋白按照IL:1.1g:0.146g:0.876g:0.546g:0.069g:100000IU:70000IU:4g 的配比混合而成，pH7.2。
[0015]在本發明中，所述NCSU-23基礎培養液的溶劑為水，溶質及其濃度具體如下=NaCl
6.354g/L、KCl 0.356g/L、K2HPO4 0.162g/L、CaCl2.2H20 0.250g/L、MgSO4.7H20 0.293g/L、NaHCO3 2.106g/L、青霉素 108333IU/L、硫酸鏈霉素 50000IU/L，pH7.2。
[0016]本發明是再一個目的是提供一種培養豬體外胚胎的方法。[0017]本發明所提供的培養豬體外胚胎的方法，是將豬體外胚胎置于如上所述的豬體外胚胎培養液中進行培養。
[0018]在本發明中，所述豬體外胚胎具體可為豬孤雌激活胚，也可為豬體外受精胚胎。
[0019]無論是對于以上所述的豬體外胚胎培養液，還是對于以上所述的培養豬體外胚胎的方法:當所述豬體外胚胎為豬孤雌激活胚時，所述豬體外胚胎培養液中所述川芎嗪的終濃度以0.05~0.50 μ g/mL (如0.05 μ g/mL)效果較好；當所述豬體外胚胎為豬體外受精胚胎時，所述豬體外胚胎培養液中所述川芎嗪的終濃度以5.00 μ g/mL效果較好。
[0020]在培養所述豬體外胚胎的方法中，將所述豬體外胚胎置于所述豬體外胚胎培養液中培養具體為:每個50 μ L的所述豬體外胚胎培養液的液滴中培養15~20枚所述豬體外胚胎，同時覆蓋礦物油。 [0021]進一步，其培養的條件為:39°C，5%C02，95%空氣，100%飽和濕度。在培養所述豬體外胚胎時可在符合上述條件的CO2培養箱中進行。
[0022]將所述豬體外胚胎置于所述豬體外胚胎培養液中培養的過程中，需間隔48h換液一次。
[0023]本發明所提供的豬體外胚胎培養液中加入了中藥單體成分——川芎嗪(Ligustrazine, Lig),實驗證明，利用該培養液對豬孤雌激活胚和體外受精胚胎進行體外培養，可有效提高胚胎發育效率及囊胚內細胞團及其總細胞數量。本發明為其他生物技術、醫學研究以及畜牧業發展奠定基礎，同時為闡明豬早期胚胎發育機制提供一定的理論基礎。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024]圖1為對照組和Ligl組的豬孤雌激活胚在胚胎培養至168h (第7天)的囊胚細胞數和囊胚細胞凋亡情況鑒定結果。其中，A、A’和A”為對照組；B、B’和B”為Ligl組；A和B為各組別囊胚(自然光)；A’和B’表示相應各組別總細胞數(藍色)；A”和B”表示各組別胚胎細胞凋亡征象(紅色)。
[0025]圖2為對照組和Lig3組的豬體外受精胚胎在胚胎培養至168h (第7天)的囊胚細胞數和囊胚細胞凋亡情況鑒定結果。其中，A、A’和A”為對照組；B、B’和B”為Lig3組；A和B為各組別囊胚(自然光)；A’和B’表示相應各組別總細胞數(藍色)；A”和B”表示各組別胚胎細胞凋亡征象(紅色)(X400)。
【具體實施方式】
[0026]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0027]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0028]川芎嗪:中國藥品生物制品檢定所，編號:110811-200305。
[0029]NCSU-23 基礎培養液:準確稱取 NaCl (Sigma, S5886)0.6354g、KCl (Sigma,P5405)0.0356g,K2HPO4 (Sigma, P5655) 0.0162g,CaCl2.2Η20 (Sigma, C7902) 0.0250g、MgS04.7Η20(Sigma,M2773) 0.0293g,NaHCO3 (Sigma, S5761) 0.2106g、青霉素(Sigma，P3032) 10833IU、硫酸鏈霉素(Sigma，S1277) 5000IU，用超純水溶解并定容至lOOmL，待前一種藥物完全溶解后再加入后一種藥物，充分混勻，pH7.2。[0030]NCSU-23胚胎培養液:在IOOmL NCSU-23基礎培養液中依次加入D-葡萄糖(Sigma, G6152) 0.1lOOg, L-谷氨酰胺(Sigma，G3126) 0.0146g,牛磺酸(Sigma，T8691)0.0876g、亞牛磺酸(Sigma，Hl384) (λ 0546g、L-半胱氨酸(Sigma，C7352) 0.0069g、青霉素10000IU、硫酸鏈霉素7000IU、牛血清白蛋白(BSA，Sigma, A3311) 0.4g，待前一種藥物完全溶解后再加入后一種藥物，充分混勻，PH7.2。
[0031]實施例1、川芎嗪對豬孤雌激活胚體外發育的影響
[0032]一、含有川芎嗪的豬體外胚胎培養液的配制
[0033]取三份NCSU-23胚胎培養液，分別添加川芎嗪(Lig)，使其終濃度分別達0.05 μ g/mL、0.5 μ g/mL 和 5 μ g/mL。
[0034]二、豬孤雌激活胚的獲得
[0035]1.卵母細胞的采集和成熟培養
[0036]將屠宰場收集的豬卵巢保存在添加雙抗(青霉素和硫酸鏈霉素)的34~37°C生理鹽水中并于Ih內運回實驗室。卵巢經上述生理鹽水沖洗三次后，除盡周圍的脂肪和系膜，用12號針頭抽取卵巢表面上直徑為2~6mm卵泡中的卵丘-卵母細胞復合體(COCs)，在體視顯微鏡下選擇卵丘細胞2層以上、胞質均勻的COCs用TL-1fepes-PVA和在CO2培養箱中平衡2h以上的體外成熟培養液分別洗漆3次后進行體外成熟培養。培養用Φ=35ι?πι培養皿(Nunc)。每滴50 μ L的培養液中放入15~20個COCs，覆蓋礦物油。培養條件為39°C，5%的C02，95%空氣，100%飽和濕度。
[0037]其中，TL-Hepe s-PVA和體外成熟培養液的配方如下:
[0038]TL-H印es-PVA 洗卵液:NaCl 3.3311g、KCl 0.1193g、CaCl2.2Η200.1471g、MgCl2.6Η20 (Sigma,Μ2393) 0.0509g,NaH2PO4 (Sigma, S5011) 0.0204g,NaHCO3 0.0840g、山梨醇 1.0930g、H印es (Sigma,H4034) 1.1916g、PVA (Sigma,P8136)0.5g、丙酮酸鈉 0.01lOg以及乳酸鈉(Sigma，16H50495) 0.4245mL,分別用500mL超純水溶解并定容，然后將后者緩緩加入前者中，并不斷的搖動，充分混勻后，加入青霉素54167IU、硫酸鏈霉素25000IU、抽濾除菌，分裝。使用前37°C恒溫箱中保溫4h。
[0039]體外成熟培養液:mTCM199(GIBC0BRL，1069982)中添加0.57mmol/L L-半胱氨酸、3.0SmmoI/T, D-葡萄糖、0.91mmol/L 丙酮酸鈉、10ng/mL EGF (Sigma,Ε9644)、0.l%(w/v)PVA和10%(v/v)卵泡液(PFF)、125000IU/L青霉素、50000IU/L硫酸鏈霉素。培養前22h添加LH(Sigma, L9773) 0.5 μ g/mL,FSH (Sigma,F2293) 0.5μ g/mL，培養后 22h 不添加 FSH、LH。以上各濃度為相應組分在體外成熟培養液中的終濃度。
[0040]2.去除顆粒細胞
[0041]體外成熟培養44h后，將COCs移入含有0.1% (質量百分含量)透明質酸酶的的NCSU-23基礎培養液中用移液槍頭反復吹打，待完全脫去卵丘細胞后，挑選明顯具有第一極體的卵母細胞移入NCSU-23基礎培養液中，洗滌3次。置于37°C的恒溫臺上備用。
[0042]3.成熟卵母細胞的孤雌激活
[0043]將上述成熟卵母細胞移入含20 μ mol/L 1011(離子霉素)(5丨8111&，10634)的從^化23基礎培養液滴中培養40min后，用NCSU-23基礎培養液洗滌3次，移入含2mmol/L6-DMAP(6- 二甲基嘌呤，Sigma, D2629)的NCSU-23基礎培養液中培養5.5h，隨后用NCSU-23基礎培養液清洗3次。獲得豬孤雌激活胚。[0044]三、含有不同劑量川芎嗪的豬體外胚胎培養液對豬孤雌激活胚體外發育的影響
[0045]以未添加川芎嗪(Lig)的NCSU-23胚胎培養液為對照組，以步驟一制備的含有不同劑量川芎嗪(Lig)的豬體外胚胎培養液為試驗組，分別觀察低、中、高(Ligl、Lig2、Lig3)不同劑量的川芎嗪對豬孤雌激活胚體外發育的影響。
[0046]1.胚胎體外培養
[0047]將步驟二獲得的豬孤雌激活胚移入50 μ L胚胎培養液的液滴中培養(對照組:NCSU-23胚胎培養液；試驗組:含有不同劑量川芎嗪(Lig)的豬體外胚胎培養液)，每滴15~20枚胚胎，覆蓋礦物油。培養條件為:39°C，5%C02，95%空氣，100%飽和濕度。間隔48h換液一次。
[0048]2.卵裂率和囊胚率的計算
[0049]在胚胎培養至48h時統計各組的卵裂胚胎數，進而計算卵裂率；在胚胎培養至168h (第7天)時統計各組的囊胚數，進而計算囊胚率。
[0050]3.囊胚細胞數量的統計、囊胚細胞凋亡情況鑒定及凋亡指數計算
[0051]在胚胎培養至168h (第7天)時統計各組的囊胚細胞總數，以及內細胞團細胞數和滋養層細胞數，并對囊胚細胞凋亡情況進行鑒定，計算凋亡指數。[0052]( I)囊胚細胞數量的統計
[0053]將囊胚(第7天)放入含有0.5%(w/v)鏈霉蛋白酶的TL-Hepes-PVA液除去透明帶，在含有0.4% (0.4g/100mL)BSA的TL-1fepes-PVA液中清洗5min，在39°C不含CO2的培養箱中孵育40min (50 μ L TL-Hepes-PVA小滴中添加5.5 μ L兔抗豬全血清(Sigma, P3164)并覆蓋石蠟油)，然后用含有10%(v/v)胎牛血清的TL-1fepes-PVA液結束抗體反應5min。在無石蠟油的TL-1fepes-PVA液中清洗5min，并重復3次，然后在39°C不含CO2的培養箱中孵育90min (50 μ L TL-H印es-PVA液小滴中添加3.5 μ L豚鼠血清(Sigma, S16390)并覆蓋石蠟油)，在豚鼠補體(Sigma, S16390)中孵育的同時用10 μ L的Hoechst33342( Sigma, B2261)和10μ L 的 PI (Sigma，P4170)染色，之后在含有含有 0.4% (0.4g/100mL)BSA 的 TL-1fepes-PVA液中清洗5min，將囊胚轉移到載玻片上，盡量少帶液體，用凡士林在載玻片四角點四個柱，蓋上蓋玻片，再輕輕壓蓋玻片，最后用指甲油封片。在熒光顯微鏡下觀察，并計數囊胚的內細胞團細胞數、滋養層細胞數、總細胞數。
[0054](2)孤雌發育胚細胞凋亡的評價
[0055]孤雌激活第7天的囊胚在TL-1fepes-PVA液中清洗三次，隨后在4%多聚甲醛(Solarbio, P1040)中固定Ih (室溫)，隨后在TL-H印es_PVA液中清洗三次，在添加有0.l%(v/v) TritonX-1OO的2.3% (2.3g/100mL)檸檬酸鈉水溶液中孵育Ih (室溫)。DNA碎片(DNA fragmentation)檢測應用原位細胞凋亡檢測試劑盒(In Situ Cell Death DetectionKit, Roche, Germany)。即采用TUNEL檢測評價細胞凋亡的程度，被固定的胚胎在TUNEL反應混合液中孵育Ih (暗室，38.5°C)并清洗干凈后放入10μ g/mL PI中室溫避光染色5min，滴加抗淬滅劑DABCO后封片，用錫箔紙覆蓋好，準備觀察，使用熒光顯微鏡檢測整個胚胎的凋亡的細胞核和總細胞核。
[0056]凋亡指數=凋亡細胞數/總細胞數
[0057]實驗重復三次。
[0058]四、結果[0059]1.卵裂率和囊胚率的計算
[0060]對照組和試驗組的卵裂率和囊胚率計算結果如表1所示。
[0061]表1川芎嗪對豬孤雌激活胚體外發育效果的影響
[0062]
【權利要求】
1.一種豬體外胚胎培養液，其特征在于:所述豬體外胚胎培養液是在NCSU-23胚胎培養液中加入終濃度為0.05~5.00 μ g/mL的川芎嗪后得到的培養液。
2.根據權利要求1所述的豬體外胚胎培養液，其特征在于:所述NCSU-23胚胎培養液為將NCSU-23基礎培養液、D-葡萄糖、L-谷氨酰胺、牛磺酸、亞牛磺酸、L-半胱氨酸、青霉素、硫酸鏈霉素，以及牛血清白蛋白按照IL:1.1g:0.146g:0.876g:0.546g:0.069g:100000IU:70000IU:4g的配比混合而成。
3.根據權利要求2所述的豬體外胚胎培養液，其特征在于:所述NCSU-23基礎培養液的溶劑為水，溶質及其濃度如下=NaCl 6.354g/L、KCl 0.356g/L、K2HPO4 0.162g/L、CaCl2.2H20 0.250g/L、MgSO4.7H20 0.293g/L、NaHCO3 2.106g/L、青霉素 108333IU/L、硫酸鏈霉素 50000IU/L。
4.一種培養豬體外胚胎的方法，是將豬體外胚胎置于權利要求1-3中任一所述的豬體外胚胎培養液中進行培養。
5.根據權利要求1-3中任一所述的豬體外胚胎培養液，或權利要求4所述的方法，其特征在于:所述豬體外胚胎為豬孤雌激活胚或豬體外受精胚胎。
6.根據權利要求1-5中任一所述的豬體外胚胎培養液或方法，其特征在于:當所述豬體外胚胎為豬孤雌激活胚時，所述豬體外胚胎培養液中所述川芎嗪的終濃度為0.05~0.50 μ g/mL ;當所述豬體外胚胎為豬體外受精胚胎時，所述豬體外胚胎培養液中所述川芎嗪的終濃度為5.00 μ g/mL。
7.根據權利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于:將所述豬體外胚胎置于所述豬體外胚胎培養液中培養為:每 個50 μ L的所述豬體外胚胎培養液的液滴中培養15~20枚所述豬體外胚胎。
8.根據權利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于:將所述豬體外胚胎置于所述豬體外胚胎培養液中培養的條件為:39°C，5%C02,100%飽和濕度。
9.根據權利要求4-8中任一所述的方法，其特征在于:將所述豬體外胚胎置于所述豬體外胚胎培養液中培養，間隔48h換液一次。
【文檔編號】C12N5/073GK103710299SQ201310700566
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月18日 優先權日:2013年12月18日
【發明者】高建明, 史雅然, 趙菊, 李冬冬, 張志剛, 徐捷, 張超 申請人:北京農學院