Pik3c2g在結直腸癌化療療效判斷和檢測試劑盒中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及分子生物學和腫瘤學領域，公開了一種與結直腸癌相關的生物標志物的應用，該標志物為PIK3C2G，具體地講，該標志物的DNA相對拷貝數變化與結直腸癌發生和患者化療之后的生存期呈負相關。本發明還涉及結直腸癌中檢測PIK3C2G的引物對、試劑盒和方法，檢測PIK3C2G的試劑盒中包含檢測PIK3C2G的引物對以及用于檢測內參基因GAPDH的引物對，上游引物堿基序列如SEQ?ID?NO:1所示；通過上述引物對通過PCR擴增可用于檢測PIK3C2G拷貝數變化，使通過PIK3C2G來檢測結直腸癌和判斷結直腸癌FOLFOX化療療效成為了可能。
【專利說明】PIK3C2G在結直腸癌化療療效判斷和檢測試劑盒中的應用
[【技術領域】][0001]本發明屬于分子生物學和腫瘤生物學領域，涉及一種結直腸癌基因標志物及其應用，同時，涉及結直腸癌中檢測PIK3C2G的引物對、試劑盒和方法。
[【背景技術】]
[0002]結直腸癌是最為常見的惡性腫瘤之一，中國地區的發病率上升趨勢十分明顯，位居全部惡性腫瘤第三位，嚴重威脅人類健康。
[0003]隨著分子分析方法的發展，各種新的診治方法和新的藥物不斷涌現，結直腸癌的治療效果有明顯改善。然而，雖然傳統的臨床病理因素可以為結直腸癌患者提供一定的療效信息，但這些風險因素對結直腸癌預后影響的程度不能很好地被量化和整合。對于患者個體，現行的腫瘤分期仍然嚴重依賴傳統的組織病理學和臨床檢查，對療效的評價準確性并不高。為此，臨床研究急需能夠簡便準確地進行預后及療效預測的方法，為結直腸癌患者術后用藥提供重要參考。
[0004]憐月旨酸肌醇-3激酶(phosphatidyl inositol 3-kinase, PI3K)家族是一類蛋白激酶，參與多種細胞內的調控機制(Franke TF, Kaplan DR, Cantley LC (1997)PI3K: downstream AKTion blocks apoptosis.Cell88:435-437)。PI3K 特異性地催化憐脂酰肌醇(phosphatidylinositol, PI)環上的3位羥基磷酸化,產生的相應的肌醇脂物質，如3，4- 二磷酸磷脂酰肌醇[PI (3，4)P2]和3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇[PI (3，4，5)P3]作為第二信使結合并激活多種靶蛋白，形成一個信號級聯復合物，從而調節細胞的增殖、分化、存活和遷移等(Katso R, Okkenhaug K, Ahmadi K, White S, Timms J, etal.(2001)Cellular function of phosphoinositide3_kinases:1mplications fordevelopment, homeostasis, and cancer.Annu Rev Cell Dev Bioll7:615_675)oPI3K家方矣根據底物與催化亞基不同分為I型、II型和III型。其中，I型以PI (phosphatidylinositol)、PIP(Phosphatidylinositol4-phosphate)及 PIP2(Phosphatidylinositol4,5-bis-phosphate)為底物，II 型以 PI 及 PIP 為底物，III型 PI3K 以 PI 為底物(DjordjevicS，Driscoll PC(2002)Structural insight into substrate specificity and regulatorymechanisms of phosphoinositide3-kinases.Trends Biochem Sci27:426-432)。I 型PI3K可進一步分為兩個亞類，由調節亞基p85和催化亞基pi 10 α/β/δ之一組成的異二聚體為IA型，調節亞基plOl和催化亞基pllO Y組成的異二聚體為IB型，二者在細胞中具有不同的活化機制及作用。I型和III型的催化亞基與調節亞基形成異二聚體，II型不形成異二聚體，具有獨特的C2結構域。
[0005]許多在人類腫瘤中的研究表明，I型的ΡΙ3Κ常發生過度表達，增強ΡΙ3Κ催化活性，同時增加其蛋白合成的量，促進細胞癌變，與成癌轉化有關。在結直腸癌中，超過25% 的 PIK3CA 基因表達量增高(Samuels Y, Wang Z, Bardelli A, Silliman N, Ptak J, etal.(2004)High frequency of mutations of the PIK3CA gene in human cancers.Science304:554),表明IA型的PIK3CA在腫瘤發生發展中起重要作用(Vivanco I, SawyersCL (2002)The phosphatidyl inositol3-Kinase AKT pathway in human cancer.Nat RevCancer2:489-501)。II型的PI3K在結構上與I型相似，其缺失p85/pl01且額外擁有PX和C2結構域，與I型主要分布在細胞質內不同，II型的PI3K則主要分布在膜結構上(FryMJ(2001)Phosphoinositide3_kinase signalling in breast cancer:how big a rolemight it play Breast Cancer Res3:304-312)。
[0006]II型PI3K家族成員包括PIK3CG和PIK3C2G，有研究發現PIK3CG在結直腸癌樣本和細胞系中發生缺失，過表達這個基因可以抑制腫瘤發生(Sasaki T, Irie-SasakiJ, Horie Y, Bachmaier K, Fata JE, et al.(2000)Colorectal carcinomas in mice lackingthe catalytic subunit of PI (3) Kgamma.Nature406:897-902),提不 PIK3CG 在結直腸癌發生過程中起抑制作用。PIK3C2G目前已有研究發現其在卵巢癌(Lambros MB1Fiegler
H,Jones A，Gorman P, Roylance RR, et al.(2005)Analysis of ovarian cancer celllines using array-based comparative genomic hybridization.J Pathol205:29-40)和膜腺癌(Harada T, Chelala C, Bhakta V, Chaplin T, Caulee K, et al.(2008) Genome-wideDNA copy number analysis in pancreatic cancer using high-density singlenucleotide polymorphism arrays.0ncogene27:1951-1960)中顯著擴增。有趣的是，PIK3C2G在白血病細胞歸巢中表達被Bcr-Abl抑制，提示其表達抑制與細胞遷移有關(YuW，Sun X, Tang H, Tao Y, Dai Z(2010)Inhibition of class II phosphoinositide3_kinasegamma expression by pl85 (Bcr-Abl) contributes to impaired chemotaxis andaberrant homing of leukemic cells.Leuk Lymphoma51:1098-1107),提不 PIK3C2G 具有成為潛在的腫瘤標志物的可能，但是，PIK3C2G在結直腸癌中是否具有生物標志物的可能和具體應用未被研究。
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【發明內容】
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[0007]本發明的首要目的是`確認PIK3C2G相對拷貝數變化是否與結直腸癌F0LF0X化療療效相關，其次，發明一種檢測PIK3C2G的引物對和試劑盒，然后通過PIK3C2G做成檢測結直腸的試劑盒。
[0008]為了實現上述目的，首先發明一種檢測PIK3C2G的引物對:上游引物堿基序列如SEQ ID NO:1所示；下游引物堿基序列如SEQ ID N0:2所示。
[0009]本發明還包括一種檢測PIK3C2G的試劑盒，含有上述的引物對。
[0010]本發明還包括一種檢測結直腸癌的試劑盒，含有上述檢測PIK3C2G的引物對，以及用于檢測內參基因GAPDH的引物對。
[0011]所述的內參基因GAPDH的弓丨物對為:上游引物，如堿基序列SEQ ID NO: 3所示；下游引物，如堿基序列SEQ ID N0:4所示。
[0012]本發明還包括一種檢測PIK3C2G的方法，包括DNA的提取步驟；用檢測PIK3C2G的引物對作為PCR擴增的引物，進行PCR擴增；最后得到擴增產物，并檢測判斷。
[0013]本發明通過研究發現的PIK3C2G與結直腸癌之間的關系(參見實施例)，即PIK3C2G基因相對拷貝數在結直腸癌組織中比非腫瘤對照腸組織高，因此，腫瘤樣本中的PIK3C2G的相對拷貝數可以作為結直腸癌的一個標志物。本發明還發現PIK3C2G的相對拷貝數增高程度與患者服用F0LF0X化療藥物之后的生存期相關。用該引物對設計出的試劑盒能夠用于檢測結直腸癌腫瘤，使通過PIK3C2G檢測結直腸癌和判斷FOLFOX療效成為可倉泛。
[0014]因為FOLFOX化療方案中起主要抗腫瘤的活性物質為5氟尿嘧啶(5FU)和奧沙利鉬，它們的作用方式為誘導DNA損傷從而導致細胞凋亡，因此，本發明涉及PIK3C2G作為評價結直腸癌患者使用誘導DNA損傷的化療藥物之后生存期的指標。
[0015]因為DNA拷貝數降低直接導致基因表達降低，因此，本發明也涉及利用PIK3C2G表達(包括mRNA和蛋白水平)作為評價結直腸癌發生和結直腸癌患者服用化療藥物之后生存期的指標。
[【專利附圖】
【附圖說明】]
[0016]圖1PIK3C2G作為結直腸癌標志物的ROC曲線圖；
[0017]圖2PIK3C2G相對拷貝數與結直腸癌患者經FOLFOX化療后生存期的關系示意圖；
[0018]圖3 PIK3C2G相對拷貝數評價結直腸癌患者經FOLFOX化療療效示意圖。
[【具體實施方式】]
[0019]腫瘤的發生本質是染色體不穩定導致的基因擴增、缺失和突變。因此，這些發生擴增、缺失和突變的基因具有潛在成為腫瘤標志物的可能。因為這些基因同時在腫瘤發生、耐藥和轉移過程中起重要作用，因此，它們具有成為潛在藥物靶點的作用。[0020]有研究表明PIK3CG在結直腸癌中出現明顯缺失(Sasaki T, Irie-Sasaki J, HorieY,Bachmaier K, Fata JE, et al.(2000)Colorectal carcinomas in mice lacking thecatalytic subunit of PI (3) Kgamma.Nature406:897-902),提不 PIK3CG 家族在結直腸癌家族中起重要作用，具有成為結直腸癌標志物的可能，因此，本發明通過熒光定量PCR技術檢測結直腸癌樣本和對照樣本中PIK3C2G的相對拷貝數差異，并用學生t檢驗判斷對照樣本和結直腸癌樣本中PIK3C2G拷貝數是否具有顯著性差異；然后，對結直腸癌患者進行生存期統計，將病人分為五年以下和五年以上兩組，用學生t檢驗判斷兩組人群PIK3C2G的相對拷貝數是否有顯著性差異。之后用SPSS軟件分析患者生存期和PIK3C2G的相對拷貝數的關系以及用邏輯回歸分析特異性和靈敏性。
[0021]以下為本發明的具體實施例:
[0022]樣本及其隨訪信息的收集
[0023]發明人從2006年開始從瑞金醫院收集了大腸癌患者樣本，經過資料整理和隨訪，從中選取了 92份(35例五年以下生存期，57例五年以上生存期)III期結直腸癌腫瘤石蠟包埋組織樣本。
[0024]石蠟樣本DNA抽提
[0025]從石蠟包埋組織中切下5毫克樣本，放入2毫升離心管中，加入I毫升二甲苯，渦旋震蕩10秒。在14000轉/分鐘轉速下常溫離心2分鐘。棄上清。加入I毫升無水乙醇洗滌沉淀，渦旋震蕩，在14000轉/分鐘轉速下常溫離心2分鐘，棄上清。將離心管置于超凈臺中去除多余乙醇。加入180微升RTL緩沖液(Qiagen)，20微升蛋白酶K，混勻，56°C孵育I小時，90°C孵育I小時。加200微升AL緩沖液，混勻，然后加入200微升無水乙醇，混勻。將混合液加入QIAamp柱子(Qiagen)，8000轉/分鐘常溫離心I分鐘。打開柱子蓋子，加入500微升AWl緩沖液(Qiagen)，8000轉/分鐘常溫離心I分鐘。加入500微升AW2緩沖液(Qiagen)，8000轉/分鐘常溫離心I分鐘。在14000轉/分鐘轉速下常溫離心3分鐘干燥膜。加入50微升ATE緩沖液，在14000轉/分鐘轉速下常溫離心I分鐘收集DNA。
[0026]熒光定量PCR
[0027]設計PCR引物用來擴增 PIK3C2G，序列見 SEQ ID NO:1，SEQ ID NO: 2。使用 2 X SYBRGreen熒光染料配制PCR反應混合液，根據需要上機的樣品數和重復數，計算并配制PCR反應混合液，體系如下:
[0028]
【權利要求】
1.PIK3C2G基因在FOLFOX化療藥物療效判斷藥物或試劑盒中的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其特征在于所述的化療藥物為誘導DNA損傷的化療藥物。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于所述的誘導DNA損傷的化療藥物選自含鉬類和5氟尿嘧啶及其衍生物的化療藥物中的一種或多種。
4.如權利要求1所述的應用，其特征在于PIK3C2G基因為結直腸癌的生物標志物，所述標志物其DNA相對拷貝數增高與結直腸癌發生呈正相關；所述的標志物的DNA相對拷貝數降低與結直腸癌患者進行FOLFOX化療之后的生存期呈負相關，即所述負相關為PIK3C2G相對拷貝數越低，生存期越長；相對拷貝數越高，生存期越短，利用所述的負相關制備所述判斷藥物或試劑盒。
5.如權利要求4所述的應用，其特征在于所述的標志物相對拷貝數降低包括相對拷貝數降低引起的PIK3C2G的mRNA和蛋白水平的降低。
6.一種檢測PIK3C2G的試劑盒，其特征在于，含有檢測PIK3C2G和內參基因GAPDH引物對。
7.如權利要求6所述的檢測結直腸癌的試劑盒，其特征在于所述檢測PIK3C2G的引物對為: 上游引物，如堿基序列SEQ ID NO:1所示； 下游引物，如堿基序列SEQ ID N0:2所示。
8.如權利要求6所述的檢測結直腸癌的試劑盒，其特征在于所述的內參基因GAPDH的引物對為: 上游引物，如堿基序列SEQ ID NO:3所示； 下游引物，如堿基序列SEQ ID N0:4所示。
9.一種檢測PIK3C2G的方法， 包括DNA的提取步驟； 其特征在于，還包括: 用權利要求6所述的試劑盒對所述的DNA進行PCR擴增； 得到擴增產物，并檢測判斷。
【文檔編號】C12Q1/68GK103710451SQ201310731210
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月26日 優先權日:2013年12月26日
【發明者】李華光, 湯二將, 陸星亦, 張騰, 林謀斌 申請人:上海銳賽生物技術有限公司