來自芽孢桿菌的新型甲醇脫氫酶的制作方法
【專利摘要】本發明涉及核酸分子，其編碼具有醇脫氫酶活性、特別是甲醇脫氫酶活性的多肽，其包含或具有選自下組的核苷酸序列：（i)如SEQIDNOs:1(mdh2-MGA3)、3(mdh3-MGA3)或5(mdh2-PBl)中任一項示出的核苷酸序列；（ii)與SEQIDN0s:l、3或5中任一項示出的核苷酸序列具有至少90%序列同一性，更特別是至少91、92、93、94、95、96、97、98或99%的序列同一性的核苷酸序列；（iii)與核苷酸序列SEQIDN0s:l、3或5中的任一條簡并的核苷酸序列;(iv)為SEQIDN0s:l、3或5中的任一項核苷酸序列一部分的或與序列SEQIDN0s:l、3或5簡并的核苷酸序列的一部分的核苷酸序列；(v)編碼SEQIDN0s:2(Mdh2-MGA3)、4(Mdh3-MGA3)或6(Mdh2-PB1)中任一項示出的氨基酸序列的多肽的全部或部分的核苷酸序列；(vi)編碼多肽的全部或部分的核苷酸序列，所述多肽具有與SEQIDN0s:2、4或6中任一項示出的氨基酸序列具有至少90%序列同一性，更特別是至少91、92、93、94、95、96、97、98或99%的序列同一性的氨基酸序列；或者核酸分子，其包含與（i)到（vi)中任一項核苷酸序列互補的核苷酸序列。還提供了包含這種核酸分子和由其編碼的多肽的重組構建體、載體和宿主細胞。這種分子可以有利地用于宿主細胞的基因修飾，以例如引入或修飾甲醇脫氫酶活性。
【專利說明】來自芽孢桿菌的新型甲醇脫氫酶
[0001] 本發明涉及在甲基營養菌中鑒定的以前未知的甲醇脫氫酶（MDH)，特別是涉及在 甲醇芽孢桿菌（Bacillus methanolicus)MGA3和甲醇芽孢桿菌PBl中鑒定的新的MDH編碼 基因。生化性質不同的這些甲醇芽孢桿菌菌株中存在多個MDH同種型，本發明基于該意料 之外的發現。編碼先前未知的MDH同種型的新基因可以用在宿主微生物的基因工程化中， 例如在使用甲醇和/或其它Cl化合物作為生長底物的背景中。因此，新的基因/酶可用于 引入或修飾，如啟用/增強宿主微生物中的MDH活性。
[0002] 甲基營養微生物可以利用一碳（Cl)來源，例如甲烷和甲醇作為能量和生物量生 成的唯一來源，且甲基營養菌中存在各種不同的酶和Cl代謝途徑。將在溫度高達60°C的甲 醇上具有生長能力的革蘭氏陽性桿菌分離并歸類為甲醇芽孢桿菌。甲醇芽孢桿菌是所謂的 受限甲基營養菌，這意味著它可以利用少數多碳來源用于能量和生長。這些生物體的科學 興趣已經主要集中在它們作為在升高的溫度下從甲醇工業生產氨基酸、尤其是L-賴氨酸 和L-谷氨酸鹽的細胞工廠的潛能，但已經提出其作為生產其他有用產品包括維生素、細胞 色素、輔酶和重組蛋白的宿主的潛在用途。
[0003] 甲醇芽孢桿菌MGA3 (ATCC53907)最初是從Minnesota的土樣分 離（Schendel，Bremmon et al. (1990)Appl Environ Microbiol (應用環境微 生物學）56 (4) :963-970)，它已被用作這種細菌的代謝工程的主要模型菌株 (Brautaset, Jakobsen et al. (2007) Appl Microbiol Biotechnol (應用環境微生物 學）74(1):22-34 ;Jakobsen，Brautaset et al. (2009)Appl Environ Microbiol(應 用環境微生物學）75(3):652-661 ;Brautaset, Jakobsen et al. (2010)Appl Microbiol Biotechnol 87(3) :951-964)。甲醇芽孢桿菌有幾個獨特的特點，包括 用于甲醇氧化的NAD-依賴性甲醇脫氫酶（MDH) (de Vries, Arfman et al. (1992) J Bacteriol 174(16):5346-5353 ;Arfman，Hektor et al. (1997)Eur J Biochem(歐 洲生物化學）244(2) :426-433 ;Hektor, Kloosterman et al. (2002) J Biol Chem 277(49) :46966-46973)。甲醇脫氫酶（MDH)的活性為甲基營養菌生長的關鍵屬性，并且參 與甲醇發酵的第一步驟，即甲醇氧化為甲醛。甲醛是甲醇代謝的中間產物，因此該細胞毒 性代謝物的解毒非常重要。甲醛可以通過RuMP途徑被同化。已經提出將甲醛直接轉化成 CO2的另外一種線性異化途徑。異化途徑被認為對甲醇上生長的細胞的總能量生成是重要 的。與RuMP途徑一起，異化的途徑還可以在調節細胞內甲醛低于毒性水平方面發揮作用。 因此，高效的甲醇氧化和伴隨的甲醛同化對于生長和能量流進初級代謝和生成所需的產物 是至關重要的。此外，所有這一切必須小心地平衡，以確保甲醇有效轉化同時避免細胞內甲 醛的毒性累積。在這方面，MDH在細菌甲基營養菌中起著至關重要的作用。
[0004] 細菌的MDHs根據它們的反應機理和使用的輔因子（S)可以分為幾組。研究最多 的是兩個亞基的吡咯喹啉醌（PQQ)依賴性醌蛋白MDHs，其廣泛存在于革蘭氏陰性甲基營 養菌中。革蘭氏陽性甲基營養菌通常編碼NAD(P) +-依賴性甲醇脫氫酶，并且除來自以上 討論的菌株MGA3的MDH外，已經在甲醇芽孢桿菌菌株Cl的另一菌株中鑒定出NAD +-依賴 性MDH(Vonck, Arfman et al(1991)J Biol Chem 266(6) :3949-3954 ;de Vries, Arfman et al. (1992) J Bacteriol 174 (16): 5346-5353)。甲醇芽孢桿菌MDH與含鐵醇脫氫酶顯示主 序列相似性，并因此被歸類為NAD-依賴性醇脫氫酶的第三家族。這種酶是由10個相同的 亞基組成，每個亞基包含一個緊密的但非共價結合的NAD (H)分子，除Zn2+離子和1-2個Mg2+ 離子外。
[0005] 已發現甲基營養菌中的甲醇芽孢桿菌是質粒依賴性并參與質粒和染色體基因的 一致募集。在甲醇芽孢桿菌MGA3中已經鑒定了攜帶mdh和五個RuMP途徑基因的天然質粒 pBM19 ;pBM19的固化導致在甲醇上生長的能力喪失。在導致本發明的研究中，且以前沒有 報道，在生理上非常不同的替代模型菌株PBl (NCMB13113)中顯示一個相應的類似質粒， 其被命名為PBM20。
[0006] 已顯示NAD依賴性MDH酶可由被分類為nudix水解酶家族中的激活蛋白Act催化 激活。
[0007] 甲醇氧化是試圖在宿主微生物中工程化甲基營養菌的主要瓶頸。事實上，即使在 宿主生物體是天然甲基營養菌如甲醇芽孢桿菌的上下文中，MDH活性或表達的修飾對于改 善所需產物的的生長和/或產率是有益的。因此持續需求MDH酶，特別是新型mdh基因，其 可用于生物體的遺傳工程化，特別是編碼相對于本領域的MDH酶具有改變的或者改進的性 質的新型酶的基因，例如提高的活性或穩定性，或可以以任何方式有利于用于所需宿主的 遺傳修飾。
[0008] 為更好地理解甲基營養菌宿主細胞甲醇芽孢桿菌的生理學，本發明人對MGA3和 可替代的野生型菌株PBl的基因組進行了測序。出人意料的是，在此測序的過程中，已經發 現這兩種菌株具有多個同種型MDH ;在這兩種菌株中鑒定出編碼三種獨立的NAD依賴性MDH 蛋白的三個基因。因此，在甲醇芽孢桿菌MGA3中，除了先前報道的編碼質粒的mdh-MGA3基 因，還鑒定出兩個新的基因，這里被稱為mdh2-MGA3和mdh3-MGA3。有趣的是，這些新的mdh 基因位于染色體上。在甲醇芽孢桿菌PBl中，也已鑒定出三個新的基因，這里稱為mdh-PBl、 mdhl-PBl和mdh2-PBl，第一個位于質粒（質粒pBM20)且后兩個位于染色體。所有這些基 因已經被體外重組表達、純化和進行生化表征。雖然顯示一些相似之處，但很顯然，這些不 同的MDH酶具有不同的特性，包括它們的活性。基于這些研究特別是序列分析，已經鑒定出 兩種不同的MDH亞家族（sub-family)。
[0009] 第一亞家族包括之前描述的菌株MGA3 (mdh-MGA3)的質粒源性mdh基因，以及來 自菌株PBl的兩個基因 mdh-PBl和mdhl-PBl (mdh-PBl是質粒來源的且mdhl-PBl位于染 色體），并在此確定為"mdh/mdhl型家族"。第二亞家族包括新型染色體基因 mdh2-MGA3、 mdh3-MGA3和mdh2-PBl，且在本文確定為"mdh2/mdh3型家族"。正是后一亞族構成了本發 明的主題。
[0010] 該mdh2/mdh3型家族的成員相互之間在DNA水平上（參見圖1)和所編碼的蛋白 質的氨基酸序列水平上具有至少90%的序列同一性（參見圖2)。特別是，mdh2-MGA3(SEQ 10勵.1)和111(1113-]\^43(3￡9 10勵.3)的編碼序列共享96%的0嫩序列同一1丨生，并且編碼 的多肽 Mdh2-MGA3(SEQ ID NO. 2)和 Mdh3-MGA3(SEQ ID NO. 4)共享 96% 的氨基酸同一性 (參見圖28)。編碼的]?(1112-?81多肽（5￡〇10勵.6)與編碼的]\1(1112-]\?^3多肽（5￡〇10 勵.2)91%相同，且其與編碼的]\^13-]\?^3多肽（5￡〇10勵.4)92%相同的（參見圖28)。
[0011] 另一方面，兩個不同的亞家族成員間在60-66%的區域的序列同一'丨生非常低。例 如，111(1112-]\?^3編碼序列（3￡〇10勵.1)與111(111-]\?^3編碼序列（3￡〇10勵.7)65%相同，并 且編碼的]^112-]\?^3多肽（3￡〇10勵.2)與編碼的]\1(111-]\?^3多肽（3￡〇10勵.8)61%相 同。mdh3-MGA3 基因 （SEQ ID NO. 3)的編碼序列與 mdh-MGA3(SEQ ID NO. 7)66% 相同，并且 編碼的]?(1113多肽（5￡〇10勵.4)與]\1(111-]\?^3(5￡〇10勵.8)62%相同。
[0012] 如上面所指出的，生化特性的研究已經揭示了 mdh2/mdh3型家族的MDH酶和mdh/ mdhl 型家族的那些之間的差異。例如，Mdh3-MGA3(SEQ ID NO. 4)和Mdh2-PB1(SEQ ID NO. 6) 具有改善的熱穩定性。也觀察了底物特異性和不同醇底物活性水平的差異。這開辟了在不 同的醇（例如，乙醇或丙醇）而不只是甲醇的氧化中使用這些酶的可能性。
[0013] 還進行研究以在不同的非甲基營養菌宿主中異源表達基因。這些研究建立了本 發明的新mdh2/mdh3型家族序列在大量不同的宿主細胞遺傳工程化中的效用，以引入MDH 活性，從而使甲醇得到利用。在涉及不同宿主的情況下，建議本發明具有廣泛的適用性，并 在本文所述的研究中，使用了兩種在生物技術表征和生理表征方面非常不同的細菌宿主菌 株，即革蘭陰性大腸埃希氏菌和革蘭氏陽性枯草芽孢桿菌，并且當修飾以表達本發明的新 的MDH酶時，特別是來自甲醇芽孢桿菌MGA3和甲醇芽孢桿菌PB 1的mdh2/mdh3型家族的酶， 每一種菌株都表現出提高的MDH活性。
[0014] 值得注意的是，本文中所呈現的結果表明，不同的特定的酶在不同的宿主中 可以呈現提高的活性。例如，為了在宿主大腸桿菌中表達MDH活性，甲醇芽孢桿菌 Mdh2-MGA3(SEQ ID NO. 1)給出了最好的結果。MDH酶的選擇還可以依賴于表達的環境和宿 主細胞的確切性質和/或培養條件，例如，哪一個特定的act基因共表達。因此，本發明的新 型酶及其編碼序列有利地提供了 MDH酶和編碼的核酸分子的新的和擴大的集合，用于醇包 括甲醇的氧化，特別是用于宿主細胞的遺傳修飾（例如，用于生產重組宿主細胞），例如在 宿主細胞中引入或修飾醇脫氫酶活性，特別是MDH的活性，或將甲基營養菌引入宿主細胞。 如下面進一步描述的，編碼本發明的新酶的核酸分子可以單獨使用或組合使用。
[0015] 因此，在第一方面，本發明提供了核酸分子，特別是分離的核酸分子，其編碼具有 醇脫氫酶活性、特別是甲醇脫氫酶活性的多肽（或蛋白質），其包含或具有（例如由以下組 成）選自下組的核苷酸序列：
[0016] (i)如 SEQ ID N0s:l(mdh2-MGA3)、3(mdh3-MGA3)或 5(mdh2-PBl)中任一項所示的 核苷酸序列；
[0017] (ii)與如SEQ ID NOs: 1、3或5中任一項所示的核苷酸序列具有至少90%序列同 一性，更特別是至少91、92、93、94、95、96、97、98或99%的序列同一性的核苷酸序列；
[0018] (iii)與核苷酸序列SEQ ID NOs: 1、3或5中的任一條簡并的核苷酸序列；
[0019] (iv)為SEQ ID NOs: 1、3或5中任一項核苷酸序列的一部分或與SEQ ID NOs: 1、3 或5的序列簡并的核苷酸序列的一部分的核苷酸序列；
[0020] (V)編碼所有或部分多肽的核苷酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID NOs: 2 (Mdh2-MGA3)、4 (Mdh3-MGA3)或 6 (Mdh2-PB1)所示；以及
[0021] (vi)編碼多肽的全部或部分的核苷酸序列，所述多肽具有與SEQ ID N0s:2、4或 6中任一項示出的氨基酸序列具有至少90%序列同一性，更特別是至少91、92、93、94、95、 96、97、98或99 %的序列同一性的氨基酸序列；
[0022] 或者核酸分子，其包含與（i)到（vi)中任一項核苷酸序列互補的核苷酸序列。
[0023] 在另一方面，本發明提供了具有醇脫氫酶活性、特別是甲醇脫氫酶的活性的多肽， 其包含或具有（例如由以下組成）選自下組中的氨基酸序列：
[0024] ⑴如SEQ ID NOs :2,4或6中任一項所述的氨基酸序列的全部或部分；以及
[0025] (ii)與SEQ ID NOs :2、4或6中任一項所示的氨基酸序列具有至少90%序列同一 性，優選至少91、92、93、94、95、96、97、98或99%序列同一性的氨基酸序列的全部或部分。
[0026] 本發明的核酸分子有利地允許在宿主生物體引入醇脫氫酶特別是MDH活性或對 其進行修飾。這可以通過修飾生物體來實現，以表達本發明的一種或多種核酸分子。如上 面所指出的，所述核酸分子可以由甲醇芽孢桿菌菌株、特別是MGA3和PBl菌株的mdh基因 獲得或者衍生。在一個具體的實施方案中，編碼不同的MDH酶（例如，不同的同工酶或來自 不同菌株的酶，或不同的多肽變體等）的核酸分子或由編碼不同的MDH酶的核酸分子衍生 的核酸分子可以組合使用。因此可以共表達兩種或以上不同的核酸分子。
[0027] 因此，本發明提供了通過在所述生物體中表達本發明的一個或多個核酸分子用于 在宿主生物體中引入或修飾MDH活性的方法。特別的是，所述核酸分子可以是與宿主生物 體異源的或者非天然的。它可以在天然或非天然啟動子的控制下表達。
[0028] 因此，在又一個方面，本發明提供了用于在宿主生物體中引入或修飾醇脫氫酶活 性特別是MDH活性的方法，所述方法包括向所述生物體引入如上文所定義的本發明的核酸 分子，以及在表達所述核酸分子的條件下生長（或培養）所述生物體。
[0029] 從這個方面可知，本發明也可以看作提供了用于產生具有醇脫氫酶活性、特別是 MDH活性的多肽的方法，所述方法包括向宿主生物體中引入如上定義的本發明的核酸分子； 以及在產生所述多肽的條件下生長（或培養）所述生物體。宿主生物體可以是天然（例如， 野生型）不具有MDH活性的有機體（即沒有或不具有內源性MDH)，并因此在這樣一個實施 方案中，本發明提供了向宿主中引入MDH活性。或者，在這樣一個實施方案中，可以修飾宿 主以引入將甲醇轉化為甲醛的能力，或者，換句話說，修飾宿主以允許利用Cl-碳源、特別 是利用甲醇的初始步驟。
[0030] 在一個可選的實施方案中，宿主生物體可以具有或擁有內源性MDH酶，因此，本發 明的方法可以涉及通過引入編碼另外或其他的MDH酶的核酸分子以在宿主中修飾MDH活 性，MDH酶例如可以與宿主是異源的。還包括通過在所述生物體（即，其中引入的核酸分子 編碼內源性MDH酶）中引入編碼天然MDH酶的核酸分子來過表達MDH活性。
[0031] 可以使用任何期望的碳源作為底物培養或生長經修飾的宿主生物體，底物包括但 不限于甲醇或高級醇。因此在一個實施方案中，本發明的方法可以包括培養或生長含有編 碼如本文所定義的外源引入的MDH的一個或多個核酸分子的宿主生物體。
[0032] 在另一個方面，本發明提供經過修飾以引入如上文所定義的本發明的核酸分子的 宿主生物體。
[0033] 特別是，在本發明的這一方面，引入的核酸分子包含與宿主有機體異源的核苷酸 序列。異源序列可以是編碼醇脫氫酶（例如MDH)多肽的核苷酸序列，或者它可以是異源表 達調控序列或一些其它序列（例如載體或標記序列）。在內源性表達醇脫氫酶的宿主生物 體的情況下，通過含有編碼醇脫氫酶多肽的核酸分子的另一副本可以將經修飾的宿主與未 修飾的宿主生物體區分。換句話說，它可以比未修飾的宿主包含編碼核苷酸序列的更多個 拷貝。
[0034] 如上面提到的，可以從甲醇芽孢桿菌、特別是MGA3和PBl的菌株獲得（例如分離 或克隆）編碼本發明的新型MDH酶的核酸分子。因此，MDH酶可以是來自MGA3的Mdh2或 Mdh3(分別是SEQ ID N0s:2或4)，或來自PBl的Mdh2(SEQ ID N0:6)。然而，除了如上所 示的特定的天然（"野生型"）序列之外，還包括這些序列的變體，其與天然序列具有至少 90%的核苷酸序列同一性且其保留醇脫氫酶活性、特別是MDH活性。此類變體可包括天然 變體，例如自然環境中菌株天然產生的或獲自甲醇芽孢桿菌菌株的不同變體，并且其編碼 與SEQ ID NOs. 2、4或6的MDH多肽功能上等同的MDH多肽。可選地，變體可以是合成的或 人工變體，例如通過修飾（如突變）SEQ ID NOs. 2、4或6的氨基酸序列或SEQ ID NOs. 1、3 或5的氨基酸序列而獲得或衍生。可以使用如上所述本發明的兩種或以上不同的核酸分子 的組合。本發明的核酸分子可選地包括兩個或以上不同的核苷酸序列，如本文所定義，其編 碼具有醇脫氫酶活性的多肽或其補體。修飾可以基于相應變體的提高的甲醇脫氫酶活性來 選擇，或者使用分子結構或模型基于蛋白質設計算法預測提高的酶活性來構建。
[0035] 本發明的MDH多肽還可以包括由SEQ ID NOs. 1、3或5的核苷酸序列的片段（部 分）編碼的多肽，或可以包含SEQ ID NOs. 2、4或6的氨基酸序列的片段（或部分）或由其 組成。本發明的核苷酸或氨基酸序列的"部分"可以包括或包含至少50、55、60、65、70、75、 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%或更多個序列的 連續核苷酸或氨基酸。
[0036] 宿主生物體可以是任何合適的宿主生物體，但特別是微生物宿主生物體（即微 生物）。它可以是任何原核有機體，但特別是細菌。可以使用任何革蘭氏陽性或革蘭氏陰 性細菌，但特別提及可以由下列類或屬組成的細菌：埃希氏菌屬（Escherichia)、棒狀桿 菌屬（Corynebacterium)和芽孢桿菌屬。代表性的宿主生物體包括大腸桿菌（E.coli)、 枯草芽孢桿菌（B. subtilis)和谷氨酸棒桿菌（C. glutamicum)。如上所述，也可使用 甲醇芽孢桿菌或其它甲基營養宿主生物體，例如，甲基單胞菌（Methylomonas)、甲基菌 (Methylobacillus)、甲基桿菌（Methylobacterium)、噬甲基菌（Methylophilus)或甲基球 菌（Methylococcus)。然而，本發明并不限于這些生物體并延及任何微生物宿主。
[0037] 谷氨酸棒桿菌是桿狀、非致病性革蘭氏陽性土壤細菌。它在需氧和厭氧條件下生 長，且其是生物素營養缺陷型。谷氨酸棒桿菌能夠在作為碳和能量的單一或組合來源的各 種底物上生長。其中代謝的底物是糖類如葡萄糖、果糖或蔗糖，和有機酸如L-乳酸和醋酸。 此外，谷氨酸棒桿菌能夠在作為唯一碳源的乙醇上生長。它被廣泛用于大規模工業生產氨 基酸L-谷氨酸和L-賴氨酸。最近代謝工程的研究表明，谷氨酸棒桿菌也能生產各種其它商 業上關注的化合物，例如其他L-氨基酸、D-氨基酸、二胺如尸胺或腐胺、有機酸如琥珀酸， 和生物燃料如乙醇或異丁醇。
[0038] 根據本發明，本發明的一個或多個核酸分子可以在宿主生物體表達，特別是包括 至少一個異源核酸分子（即包含與宿主異源的核苷酸序列的核酸分子），并且特別是包含 編碼MDH多肽的異源序列。因此，可以修飾宿主生物體以表達核酸分子的一個或多個拷貝， 或者可修飾其以表達本發明的許多不同核酸分子的一個或多個拷貝。
[0039] 因此，經修飾（或"工程化"）而表達本發明的MDH的微生物會包含如本文定義的外 源引入的編碼MDH的核酸分子。換句話說，該生物體可以用此種編碼MDH的核酸分子轉化， 并可以被認為是轉基因的或重組的有機體。如上所述，所述核酸分子可以編碼與宿主同源 的或異源的（即天然或非天然的）MDH酶。因此，可以引入與宿主是天然的基因的其他（或 更多）拷貝。引入的核酸分子可以包括從天然基因或從不同的來源衍生的核苷酸序列。
[0040] MDH可以與其他酶聯合表達以允許生物體的新功能。
[0041] 本文所用的"表達"是指核苷酸序列轉錄為mRNA以及隨后所述mRNA翻譯成多肽 產物。
[0042] 如本文所指，"過表達"是指核苷酸序列的表達相比或相對于其中沒有被根據本發 明的未修飾的生物體中產生的表達水平提高的表達。表達可以在多肽產物（例如MDH酶） 產生的量方面予以考慮，其可以由本領域已知的任何常規方法來確定。例如，可以通過測定 蛋白質活性（即表達的MDH多肽的活性）來確定表達。可選地，可以測定所產生的蛋白質 的量以確定表達水平，例如蛋白質印跡或其他抗體檢測系統，或者實際上通過評估或定量 蛋白的任何方法來確定。也可以使用實時PCR。該測定可以是體內或體外測定。
[0043] 可以通過本領域已知的和文獻中描述的步驟通過測定醇脫氫酶活性來確定活性， 例如，如下面的實施例中所述。編碼的蛋白質的MDH活性例如可以催化甲醇轉化為甲醛， 并且在本文中所述活性被定義為每分鐘生產1微摩爾的NADH所需的酶的量，各種醇類可 以用作基質，例如乙醇、甲醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、異丙醇和1，3_丙二醇。如Hektor et al. (2002 ;Chem277 (49) :46966-46973)先前所描述的，可以用分光光度法測定乙醇脫氫酶 活性。
[0044] 通過本領域已知的任何方法例如從相對于天然基因更強的或未調節的啟動子表 達或過表達醇脫氫酶多肽，如通過引入包含編碼MDH多肽的核酸序列的核酸分子，例如，天 然基因的拷貝，和/或通過引入編碼MDH的核酸分子的多個拷貝。
[0045] 也可工程化生物體以引入額外的或可替代的調控要素。
[0046] 在一個具體的實施方案中，編碼MDH的核酸分子可以從非天然的或異源的啟動子 表達（即啟動子與編碼MDH的核苷酸序列是異源的，即不是天然MDH基因的啟動子），特別 是非天然或異源的強啟動子。因此，在具體實施方案中，編碼MDH的基因中不使用其天然啟 動子。可以在非天然啟動子的控制下引入編碼MDH的基因。如本文所指，強啟動子是指其表 達的基因在較高水平，或至少高于其天然啟動子影響的水平。術語"強啟動子"是本領域眾 所周知的并廣泛使用的術語，許多強啟動子是本領域已知的，或者可以通過常規實驗來鑒 定。可選地，啟動子是甲醇芽孢桿菌的mdh啟動子。然而，對啟動子的選擇沒有特別限定。
[0047] 另外，可以使用天然啟動子表達MDH基因。本發明包括使用可內源性表達mdh基 因或不內源性表達的微生物。在前者的情況下，可以引入天然基因或其變體或另一 MDH的 天然基因或編碼核酸分子的一個或多個額外的拷貝，并且它們可以在天然或非天然啟動子 的控制下引入。例如可以使用具有天然啟動子的多拷貝載體。在后者的情況下，引入與宿 主是異源的MDH(或編碼其的核酸分子），但它可以在與衍生核酸分子的MDH基因是天然或 非天然的啟動子的控制下。
[0048] 用于引入基因或核酸分子的方法是本領域已知的并且在文獻中有廣泛描述，并且 可以使用任何所需的方法。因此可以使用載體引入基因（核酸分子），它可以是自主復制型 載體或允許基因（核酸分子）整合到宿主基因組（如染色體組）的載體。因此可將表達的 基因（核酸分子）引入到表達載體，然后將表達載體引入到宿主細胞中。用于構建表達載 體并將其引入宿主細胞的方法是本領域公知的。方便的是，可以用質粒載體引入編碼MDH 的基因并可以用該質粒載體如通過電穿孔轉化宿主微生物。方法的選擇取決于所使用的微 生物。用于將核酸和載體引入微生物的方法是眾所周知的并在文獻中有廣泛描述。
[0049] 該核酸分子優選編碼MDH或其具有MDH活性的部分的多肽或蛋白。
[0050] 優選地，如上述（i)至（vi)部分定義的核酸分子編碼多肽或蛋白質，其具有或保 持由SEQ ID N0s:2、4或6中任一項的氨基酸序列限定的MDH多肽的功能或活性。
[0051] 術語"多肽"和"蛋白質"在本文中可互換使用，并且包括任何長度的氨基酸鏈（即 氨基酸的任何聚合物或低聚物）。
[0052] 如上所指，本發明延及如上文所定義的核苷酸序列的部分或功能片段，其中是指 編碼與上述定義的全長蛋白具有相同或基本相同的活性的蛋白質或多肽的部分或片段。確 定由這樣的部分或片段編碼的蛋白質/多肽是否具有與如上定義的全長多肽/蛋白相同或 基本相同的活性（例如催化或酶促活性）的測試包括上面討論的那些。通常核酸分子的部 分或功能性片段相對于全長核酸分子會僅具有小的刪除，例如，小于50、40、30、20或10個 核苷酸的刪除，例如在編碼蛋白質的N-末端的5'端、編碼蛋白質C末端的3'端或在編碼區 域內部，但是如果該片段與如上定義的全長蛋白具有相同或基本相同的活性（例如催化或 酶促活性），也可以進行較大的刪除，例如至少60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、 600 或 700 個核苷酸，或小于 60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600 或 700 個核苷酸 的刪除。可以容易地測試所編碼的多肽或蛋白質的活性，以確定它是否具有與全長多肽或 蛋白相同的活性，例如，如上所述。
[0053] 代表性部分或片段可以包含如SEQ ID NOs: 1、3或5所示的核酸序列的至少50%， 優選至少60、70、75、80、85、90或95 %的連續核苷酸。示例性的部分或片段的大小包括至少 620、700、800、850、900、950、1000、1050、1100 和 1150 個核苷酸。
[0054] 本發明的核酸分子的較短片段可用作探針，例如用于PCR或雜交方案。較短的片 段可以是例如10-30、20-25個核苷酸的長度。這樣的探針可用于鑒定與本發明的核酸分子 具有同源性的其他核酸分子的方案。
[0055] 本文所用的術語"核酸分子"指單鏈或雙鏈的RNA或DNA的聚合物，其任選地包含 合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基。這樣的多核苷酸的實例包括cDNA、基因組DNA和雙 鏈RNA等。優選地，所述核酸分子是DNA。
[0056] 雖然本文提到的核酸序列包括胸腺嘧啶（"t"）的核苷酸，但可以理解，本發明還 涉及其中胸苷被尿苷取代（"u"）的相應序列。
[0057] 如上所述，本發明包括為SEQ ID NOs: 1、3或5核酸分子的變體的核酸分子，尤其 是功能性等同變體。相比于SEQ ID NOs: 1、3或5的核酸分子，"變體"的核酸分子由此可以 有一個或多個核苷酸的改變。例如，該變體可能具有1、2、3、4或5個或更多個核苷酸的添 力口、取代、插入或刪除。
[0058] 在其他方面，本發明提供了具有醇脫氫酶活性、特別是MDH活性的蛋白質（或多 肽），如上文所定義。
[0059] 蛋白質或多肽優選是MDH或其具有MDH活性的部分。更特別的是，該部分保留衍 生其的MDH的特性的功能或活性（參照氨基酸序列SEQ ID NOs. 2、4或6所定義的）。
[0060] 蛋白質或多肽可替代地參照編碼其的核酸序列所定義的，并且由此，如上所述，本 發明的蛋白質或多肽可以通過任何本發明的核酸分子編碼。
[0061] 本發明延及全長蛋白質分子的功能部分或片段，其中是指與如上所定義的全長蛋 白質具有相同或基本相同的活性的部分或片段，即它們應被認為是功能等同變體。如本文 其他地方所指出的，可以以簡單的方式用不同的方法測試該特性。通常，這些功能性片段 相對于全長蛋白質分子會僅具有小的刪除，例如小于50、40、30、20或10個氨基酸，雖然如 上所述，但是核酸分子的較大刪除也可能是適合的，例如如高達60、70、80、90、100、150、200 個氨基酸，或至少60、70、80、90、100、150、200個氨基酸。在所有情況下，片段應與如上述所 定義的全長蛋白質具有相同或基本相同的活性，即它們應被認為是功能上等同的變體。這 些刪除可以在N末端、C末端，或者它們可以是內部刪除。
[0062] 代表性部分或片段可以包含如SEQ ID N0s:2、4或6所示的氨基酸序列的至少 50%，優選至少60、70、75、80、85、90或95 %的連續氨基酸。
[0063] 如上定義的本發明的多肽因此包括SEQ ID N0s:2、4或6的變體，例如與所記載的 序列具有序列一定水平同一性的序列。這樣的變體可以是天然存在的變體，如在其他物種 中發現的可比蛋白質或同源物，或者更具體的是其他微生物內發現的變體（其具有如本文 其他地方所定義的編碼的蛋白質的功能特性）。
[0064] 也可以例如通過使用本領域已知的標準分子生物學技術合成地生成如本文所定 義的天然存在的多肽的變體，例如標準誘變技術，如定點突變或隨機突變（例如使用基因 改組或易錯PCR)。這樣的誘變技術可以用于開發具有改進的或不同的催化性質的酶。 [0065] 也可使用如本文所定義的多肽的衍生物。衍生物是指代替天然存在的氨基酸的上 述多肽或其變體，其含有氨基酸的結構類似物。也可以發生衍生或修飾（例如，蛋白質中的 氨基酸的標簽化、糖基化、甲基化），只要該蛋白質的功能沒有受到不利的影響。
[0066] "結構類似物"是指非標準氨基酸。可使用的這種非標準或結構類似物的氨基酸 的實例是D氨基酸、酰胺等排物（如N-甲基酰胺，逆酰胺（retro-inverse amide)、硫代酰 胺、硫酯、磷酸酯、酮亞甲基、羥基亞甲基、氟乙烯基、（E)-乙烯基、亞甲基氨基、硫代亞甲基 (methylenethio)或烷烴）、L-N甲基氨基酸、D- a甲基氨基酸、D-N-甲基氨基酸。
[0067] 可以通過任何方便的方法評估序列同一性。然而，為了確定序列之間的序列同 一'I"生程度，進行序列的多重比對的計算機程序是有用的，例如Clustal W(Thompson et al.，（1994)Nucleic Acids Res?(核酸研究），22:4673-4680)。比較和比對序列對的程 序，如 ALIGN(Myers et al.，（1988)CABI0S, 4:11-17)、FASTA(Pearson et al.，（1988) PNAS, 85:2444-2448 ;Pearson (1990)，Methods Enzymol?(酶學方法），183:63-98)和有缺 陷的 BLAST (Altschul et al.，（1997) Nucleic Acids Res?(核酸研究），25:3389-3402),也 可用于該目的。此外，在歐洲生物信息研究所的大理服務器（Dali server)提供了基于結 構的蛋白質序列比對出〇1111(1993)了.]\1〇1.81〇1.，233:123-38 ;11〇1111(1995)1'代11(18 81〇(*6111. Sci. , 20:478-480 ；Holm(1998)Nucleic Acid Res. , 26:316-9)〇
[0068] 可以使用標準的BLAST參數來確定多重序列比對和同一性百分比計算（使用來自 可用的所有生物的序列、矩陣Blosum 62、成本差距：存在11，延長1)。或者，可使用下列程 序和參數：程序：Align Plus 4,4. 10 版（Sci Ed Central Clone Manager Professional Suite)。DNA比較：全局比較，標準線性評分矩陣，錯配罰分=2,開放空位罰分=4,延長空 位罰分=1。氨基酸比較：全局比較，BL0SUM62評分矩陣。
[0069] 本發明的另一實施方案提供了構建體，例如重組構建體，其包含可操作地連接于 異源表達調控序列的本文所定義的本發明的核酸分子。在上下文中，應當理解的是，表達調 控序列與核酸分子會是異源的（即非天然的），更具體為與編碼醇脫氫酶多肽的核苷酸序 列是異源的。在這點上，當編碼核苷酸序列不是天然存在的序列時，表達調控序列將與衍生 其的核苷酸序列是異源的。如上所述，可使用不同核酸分子的組合。
[0070] 這種表達調控序列通常會是啟動子。因此，構建體將優選包括非天然啟動子，特別 是非天然強啟動子。任選地，所述構建體還可以含有另外的一個或多個基因和/或一個或 多個合適的調控序列。可選的另外的一個或多個基因可以在與本發明的編碼MDH的核酸分 子相同的啟動子的控制下。任選的一個或多個調控序列可以是非天然調控序列（即相對于 編碼核苷酸序列或核苷酸序列是非天然的）。
[0071] 在本發明的上下文中，術語"可操作地連接"是指單個核酸片段上的兩個或多個核 酸分子的連接，從而其中一個的功能受到另一個的影響。例如，當啟動子能夠影響編碼序列 的表達（即編碼序列在啟動子的轉錄控制下）時，啟動子可操作地與編碼序列連接。編碼 序列可以可操作地連接有義或反義方向的調控序列。
[0072] 術語"調控序列"指位于編碼序列上游（5'非編碼序列）、內部或下游（3'非編碼 序列）的核苷酸序列，并且其影響相關編碼序列的轉錄、RNA加工或穩定性、或翻譯。調控 序列可包括啟動子、操縱基因、增強子和翻譯前導序列。本文所用的術語"啟動子"指能夠 控制編碼序列或RNA的表達的核苷酸序列。一般而言，編碼序列位于啟動子序列的3'端。 啟動子可以整個源于天然基因，或者由源于自然界中發現的不同啟動子的不同要素組成， 或甚至包括合成的核苷酸區段。還應當進一步認識到，由于在大多數情況下，尚未完全確定 調控序列的確切邊界，因此不同長度的核酸片段可以具有相同的啟動子活性。
[0073] 本發明的另一個實施方案提供了包含如本文所定義的核酸分子或構建體的載體。
[0074] 更具體地，可以構建包含本發明的編碼MDH的一種或多種核酸分子（或本發明的 構建體）的載體。載體的選擇可取決于宿主微生物、將要用于轉化宿主細胞的方法、用于蛋 白質表達的方法，或者載體的另一目的用途。本領域技術人員清楚地知道，遺傳因子必須存 在于載體中以便成功地轉化、篩選并增殖含有本發明的編碼MDH的核酸分子或構建體的宿 主細胞。本領域技術人員也將認識到不同的獨立轉化事件將導致不同的表達水平和模式， 因而可能需要篩選多個事件以獲得顯示期望的表達水平和模式的細胞。這種篩選可以尤其 通過DNA的Southern分析法、mRNA表達的Northern分析法、蛋白質表達的Western分析 法來完成。
[0075] 本發明還提供了微生物或宿主，其可以是如上討論的任何宿主生物體，如大腸桿 菌、枯草芽孢桿菌和谷氨酸棒桿菌，其含有本發明的一種或多種的核酸分子、構建體或載 體。可以從遺傳上對宿主進行操作從而引入或改變MDH的表達。這可通過在非天然、優選 強啟動子的控制下引入本發明的編碼MDH的核酸的一個或多個拷貝來實現。因而遺傳物質 存在于宿主生物體（即存在外源遺傳物質）中而不存在于天然存在的生物體中。
[0076] -般情況下，使用轉化方法引入外源遺傳物質。轉化通常會涉及還包含能夠鑒定 成功轉化的微生物的基因質粒或其它載體，如用于抗生素耐藥性的基因（例如針對氨芐青 霉素）或一些其它標記物。用于篩選轉化體的其他方法是本領域技術人員已知的，并且其 包括使用光敏感載體即勒克斯基因，這會導致陽性集落在黑暗背景中突出。用于細菌轉化 的其他合適的媒介包括粘粒和噬菌體分子。
[0077] 現參照以下非限制性實施例進一步描述本發明。但是應當理解，這些實施例雖然 說明本發明的實施方案，但僅是以示例性的方式給出。從上面的討論和這些實施例，本領域 技術人員可以確定本發明的必要特征，并且在不背離其精神和范圍的情況下，可以對本發 明進行各種變化或修改，以使其適應各種用途和條件。因此，除了那些本文示出和描述的， 從前面的描述可知，本發明的各種修改對本領域技術人員而言將是顯而易見的。這些修改 也意圖落入所附權利要求書的范圍內。本文所引用的所有文件都通過引用并入本文。
[0078] 在實施例中，參考了下述附圖：
[0079] 胤1 :對甲醇芽孢桿菌 mdh-MGA3、mdh2-MGA3、mdh3-MGA3、mdh-PBl、mdhl-PBl 和 mdh2-PBl的核苷酸序列比對；
[0080] Ml: (A)對編碼的甲醇芽孢桿菌MGA3Mdh、Mdh2和Mdh3以及PBlMdKMdhl和Mdh2 蛋白質的基本序列比對。（B)對mdh2/mdh3亞家族（即甲醇芽孢桿菌MGA3 Mdh2和Mdh3以 及PBl Mdh2蛋白）的基本序列比對。
[0081] M3 :體外測試純化的Mdh (黑色）、Mdh2 (暗灰色）和Mdh3 (淺灰色）對各種醇 (200mM)的催化活性。（A)體外分析來自甲醇芽孢桿菌MGA3的MDHs的底物特異性。除了 戊醇（300mM)和己醇（50mM)之外，使用的醇底物的濃度為500mM。根據以一式三份進行的 兩個實驗的平均值來計算數據。（B)體外分析來自甲醇芽孢桿菌PBl的MDH的底物特異性。 除了戊醇（300mM)和己醇（50mM)之外，使用的醇底物的濃度為500mM。根據以一式三份進 行的兩個實驗的平均值來計算數據。
[0082] Mi:⑷體外測定用于Mdh、Mdh2和Mdh3催化活性的最適溫度。（B)在體外進行 對來自甲醇芽孢桿菌PBl的MDH蛋白催化的最適溫度條件的測定：計算對于500mM乙醇的 比活性；以一式三份進行測定。
[0083] M5 : (A)體外測試MGA3 Mdh、Mdh2和Mdh3的溫度穩定性。酶測定前，在45°C或 60°C時孵育酶。（B)體外測試PBl Mdh、Mdhl和Mdh2的溫度穩定性。酶測定前，在45°C或 60°C時孵育酶。
[0084] M_6 :在Act的存在下測試Mdh、Mdh2和Mdh3的催化活性，并與Act不存在時測定 的活性水平進行比較。（A)體外測試來自甲醇芽孢桿菌MGA3的MDHs的活化。用500mM酒 精和5 ii g/ml的MDH和Act蛋白質以一式三份進行測試。（B)體外測試來自甲醇芽孢桿菌 PBl的MDH的活化。用500mM酒精和5 ii g/ml的MDH和Act蛋白質以一式三份進行測試。
[0085] Ml = (A)克隆策略。（B)act_pHCMC04質粒的物理圖譜。
[0086] S8 :使用乙醇和甲醇作為底物進行體外測試時重組枯草芽孢桿菌菌株的活性。
[0087] M9 =13C-甲醇的加入前（S卩零時間點）和加入后（S卩30和90分鐘的時間點）不 同代謝產物的質量同位素分數Ml的％。三條線表示來自三個獨立生物學重復的結果。A : 谷氨酸棒桿菌 A aid pEKEX3 ;B :表達 Mdh2 (pVWExl-Mdh2)、Hps 和 Phi (pEKEX3 - Hps+Phi) 的谷氨酸棒桿菌A aid菌株。PEP :磷酸烯醇丙酮酸鹽；2/3P :2-和3-磷酸甘油酸鹽；FBP : 果糖二磷酸鹽；R5P :核糖-5-磷酸鹽。
[0088] ai〇 :用13C甲醇或13C甲醛作為底物的代謝標記。（A)表達mdh2和hps phi的 A frmA細胞且13C甲醇作為碳源。（B)表達hps和phi的A frmA細胞且13C甲醒作為碳源。
[0089] Mli :合成操縱子的裝配。將每個連續基因引入Swal/Bgl II限制性位點中。該操 縱子中最后一個基因含有His6標簽。在13C-標記的試驗（見實施例18)中使用AMhxlB-和 AMABGFTPrpe-pHCMC04質粒。RBS :核糖體結合位點。
[0090] ^12 :在枯草芽胞桿菌168中表達SDS-PAGE純化的蛋白。使用的枯草芽孢桿菌 菌株中包含圖11所示的任一項構建體。用HisTrap柱純化蛋白并使用Vivaspin柱濃縮。 用框形表示蛋白條帶。M :分子量標記。
[0091] 圖13 =13C-甲醇加入前（即零時間點）和加入后（即30和90分鐘的時間點）不 同代謝產物的質量同位素分數Ml的％。兩條線表示來自兩個獨立的生物學重復的結果。 (A):枯草芽孢桿菌168pHCMC04 ; (B):枯草芽孢桿菌168AM3AhxlB-pHCMC04 ; (C):枯草芽孢 桿菌168AM3ABGFTPrpe-pHCMC04。PEP :磷酸烯醇丙酮酸鹽；2/3PG :2_和3-磷酸甘油酸鹽； FBP :果糖二磷酸鹽。 實施例
[0092] 表1 :本研究中使用的細菌菌株和質粒
[0093]
【權利要求】
1. 核酸分子，其編碼具有醇脫氫酶活性、特別是甲醇脫氫酶活性的多肽，其包含或具有 選自下組的核苷酸序列： (1)如3￡〇10勵8:1〇11(1112-]\?^3)、3(111(1113-]\?^3)或5(111(1112-?81)中任一項示出的核苷 酸序列； (ii) 與SEQ ID N0s:l、3或5中任一項示出的核苷酸序列具有至少90%序列同一性， 更特別是至少91、92、93、94、95、96、97、98或99%的序列同一性的核苷酸序列； (iii) 與核苷酸序列SEQ ID NOs: 1、3或5中任一序列簡并的核苷酸序列； (iv) 為SEQ ID NOs: 1、3或5中任一條核苷酸序列的一部分或與SEQ ID NOs: 1、3或5 的序列簡并的核苷酸序列的一部分的核苷酸序列； (V)編碼 SEQ ID N0s:2(mdh2-MGA3)、4(mdh3-MGA3)或 6(mdh2-PBl)中任一個示出的氨 基酸序列的多肽的全部或部分的核苷酸序列； (vi)編碼多肽的全部或部分的核苷酸序列，所述多肽具有與SEQ ID N0s:2、4或6中任 一個示出的氨基酸序列具有至少90%序列同一性，更特別是至少91、92、93、94、95、96、97、 98或99%的序列同一性的氨基酸序列； 或者核酸分子，其包含與（i)到（vi)中任一項的核苷酸序列互補的核苷酸序列。
2. 多肽，其具有醇脫氫酶活性、特別是甲醇脫氫酶的活性，并且其包含或具有選自下組 的氨基酸序列： ⑴如SEQ ID NOs: 2、4或6中任一項示出的氨基酸序列的全部或部分；以及 (ii)與SEQ ID N0s:2、4或6中任一項示出的氨基酸序列具有至少90%序列同一性， 更特別是至少91、92、93、94、95、96、97、98或99%的序列同一性的氨基酸序列的多肽的全 部或部分。
3. 包含權利要求1中所定義的核酸分子的構建體。
4. 如權利要求3所述的構建體，其中所述核酸分子可操作地連接于異源表達調控序 列。
5. 包含權利要求1或3中任一項所定義的核酸分子或構建體的載體。
6. 宿主微生物，已經向其中引入了權利要求1、3或4中任一項所述的核酸分子、構建體 或載體。
7. 如權利要求5所述的宿主微生物，其中所述宿主微生物是選自埃希氏菌屬 (Escherichia)、棒狀桿菌屬（Corynebacterium)或芽抱桿菌屬（Bacillus)的細菌。
8. 如權利要求5或6所述的宿主生物體，其中所述宿主生物體是大腸桿菌 (E. coli)、谷氨酸棒桿菌（C. glutamicum)、枯草芽孢桿菌（B. subtilis)或甲醇芽孢桿菌 (B. methanolicus)〇
9. 用于在宿主生物體中引入或修飾醇脫氫酶活性、特別是MDH活性的方法，所述方法 包括向所述生物體引入權利要求1中所定義的本發明的核酸分子，以及在表達所述核酸分 子的條件下，生長（或培養）所述生物體。
【文檔編號】C12N9/00GK104220591SQ201380016124
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2013年1月25日 優先權日:2012年1月25日
【發明者】特呂格弗·布朗特賽特, 唐杰·瑪麗特·杰克坎·海格斯特, 安妮·克羅格, 威海姆·約翰內斯·曲克斯, 馬克·賈恩·雅克布·伯恩哈德·斯, 巴德, 茱莉亞·沃浩特喬納斯·米勒, 帕特里克·基弗伊娃·珀特赫夫, 沃克爾·F·文德斯徹, 倫納特·萊斯梅爾, 史蒂芬妮·海克斯, 珍·查爾斯·珀爾泰斯 申請人:森文特公司, 格羅寧根大學, 蘇黎世聯邦理工學院