一株不動桿菌屬解磷促生細菌y40及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于農業微生物領域，提供一株不動桿菌屬解磷促生細菌Y40及其應用。
【背景技術】
[0002] 磷是植物生長必不可少的營養元素，我國耕地缺磷現象普遍，土壤中無效磷形態 占到95 %，植物幾乎不能直接吸收利用。土壤中難溶性磷可分為有機磷和無機磷，其中難溶 性有機磷占土壤全磷的20% -50%。過磷酸鈣等磷肥的有效磷含量偏低，而且施用后磷肥 當季利用率為5% -25%，剩余大部分磷與土壤中的Ca2+、Fe3+以及Al 3+等結合形成難溶性 磷酸鹽，因此，如何提高磷利用率是一個急需解決的問題。植物根際的解磷菌數量不足以和 其他微生物競爭，難以發揮其活性。固氮、解磷、解鉀菌株是微生物肥料的主要菌株，因此， 有必要從植物根際自然條件下篩選高效解磷菌株，制成微生物菌劑回接到土壤中，確保該 類微生物能夠有效定殖于植物根際，以促進植物生長。一些研宄者提出一個方案：通過開發 高效解磷微生物肥料，減少化學肥料的使用來提高土壤中有效磷的含量。同時，一些研宄者 經過試驗證實解磷菌與有機肥料在一起能發揮更好的解磷作用。因此，本發明正好把二者 很好地結合起來。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供一株具有解磷作用的不動桿菌屬 解磷促生細菌。
[0004] 本發明的另一目的是提供該細菌的應用。
[0005] 本發明的又一目的是提供該細菌制備的生物肥料及其應用。
[0006] 本發明的目的可通過以下技術方案實現：
[0007] 一株乙酸鈣不動桿菌Y40,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心，保藏日期為2014年12月25日，保藏編號為CGMCC NO. 10241。
[0008] 菌株Y40在LB平板上的菌落呈乳白色，皺褶，邊緣不整齊，具有一定的黏性，易挑 起。在顯微鏡下所觀察到的營養體細胞，革蘭氏染色陰性，菌體著色均勻，呈球桿狀，兩端鈍 平，呈不規則形狀。淀粉水解反應，V. P反應，接觸酶反應，利用檸檬酸鹽反應，甲基紅反應， 明膠液化反應均呈陽性，葡萄糖，阿拉伯糖，葡萄糖酸鹽，癸酸，己二酸，蘋果酸，苯乙酸利用 均呈陽性。7% NaCl生長。菌株16S rDNA序列構建的系統發育樹分析表明，菌株Y40位 于Acinetobacter calcoaceticus分支上，結合生理生化試驗將Y40鑒定為不動桿菌屬細 菌。
[0009] 本發明所述的乙酸鈣不動桿菌Y40在促溶解土壤中難溶性磷和/或進植物生長中 的應用。
[0010] 本發明所述的乙酸鈣不動桿菌Y40在制備促溶解土壤中難溶性磷和/或進植物生 長的生物肥料中的應用。
[0011] 由本發明所述的乙酸鈣不動桿菌Y40制備的解磷促生生物肥料。
[0012] 所述的解磷促生生物肥料優選主要通過以下方法制備：將保藏號為CGMCC NO. 10241的不動桿菌屬細菌Y40接種到LB培養液中，進行液體發酵生產，發酵生產的條件 為：pH值自然，發酵溫度范圍30~35°C，攪拌速度為170~200轉/分鐘，發酵時間為40h， 使發酵液中含菌量多IX 101°個/mL。
[0013] 所述的解磷促生生物肥料進一步優選得到發酵液后將其按照常規方法制備為其 他的生物肥料常用劑型，優選制備為粉劑、顆粒劑或懸浮劑。
[0014] 本發明所述的解磷促生生物肥料在促溶解土壤中難溶性磷和/或進植物生長中 的應用。
[0015] 所述的應用，優選將所述的發酵液8000~10000r/min離心5~IOmin后，采用等 體積0.9% (g/100ml)的生理鹽水重懸菌體，然后直接加至植物根際。以降低成本為基準， 添加量優選按照3% (ml/100g)進行。
[0016] 有益效果
[0017] 本發明主要利用Y40菌株能夠根際有益，高效定殖于植物根際，發揮解磷作用，將 土壤中難溶性磷轉化為植物可以吸收利用的可溶性磷，從而促進作物生長。專利產品應用 后，促生效果好，適合蔬菜作物產區大面積使用。
[0018] 該菌株及其效應驗證與其它菌株相比具有如下優點：
[0019] 1)本發明所獲得的解磷菌株Y40為不動桿菌屬高效解磷細菌，分離于植物根際， 因此，應用時，相比于其他菌株能夠更加有效的在植物根際大量定殖，從而高效發揮解磷促 生功能，具有顯而易見的優勢。
[0020] 2)研宄結果表明，本專利分離獲得的解磷菌Y40,在多季盆栽試驗中表現出顯而 易見的穩定促生能力。
【附圖說明】
[0021] 圖1基于菌株Y40的16S rDNA基因序列采用鄰接法建立的系統發育樹
[0022] 圖2第一季番茄促生盆栽效果圖
[0023] 圖3第二季番茄促生盆栽效果圖
[0024] 圖4第一季前子促生盆栽效果圖
[0025] 圖5第二季茄子促生盆栽效果圖
[0026] 圖6解磷菌Y40根際定殖情況圖
[0027] 生物材料保藏信息
[0028] 菌株Y40,分類命名為乙酸媽不動桿菌Acinetobacter calcoaceticus，保藏于 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1 號院3號，中國科學院微生物研宄所，保藏日期為2014年12月25日，保藏編號為CGMCC NO. 10241。
【具體實施方式】
[0029] 實施例1、功能菌株的分離及鑒定
[0030] 剪取5g馬鈴薯根至盛有45mL無菌水的三角瓶中，170rpm振蕩30min制成懸液，然 后依次配備濃度為1〇_3、1〇_4、1〇_5、1〇_6的土壤稀釋液。從10_ 4、1〇_5、1〇_6稀釋液中取0.1 mL溶 液分別涂布于磷酸鈣鹽無機磷培養基和卵黃培養基上（每個濃度在各培養基上重復3次）。 分離解有機磷和無機磷細菌平板分別在30°C下培養2-3d和5-7d后，取出觀察，選擇在固體 培養基平板上產生透明圈的菌落初步認定為解磷細菌，劃線純化后，于4°C冰箱保存留待進 一步研宄。
[0031] 其中所用磷酸鈣鹽無機磷培養基配制方法為，以配制IL培養基為例：葡萄糖10g， (NH4) 2S040. 5g，NaCl 0· 3g，KCl 0· 2g，FeSO4 · 7H20 0· 03g，MnSO4 · H2O 0· 03g，Ca3 (PO4) 25g，卵 黃培養基：葡萄糖 l〇g，（NH4)2SO4O. 5g，NaCl 0· 3g，KCl 0· 2g，FeSO4 ·7Η20 0· 03g，MnSO4 · H2O 0· 03g，蛋黃液10mL，用去離子水定容至1000mL，pH 6. 0-6. 5,瓊脂18_20g，115°C下滅菌 30min。蛋黃液的制備：在超凈工作臺上，先用棉花蘸取適量的酒精把雞蛋的外殼擦干凈，一 般進行三次擦洗。接著用已經用酒精擦洗過的鑷子在雞蛋殼的一端敲開小孔，卵清液流入 滅菌的小錐形瓶中，剩下的卵黃液讓其流入已滅菌的試劑瓶中，再按照蛋黃液：〇. 9%的滅 菌生理鹽水等體積混合后放冰箱中備用。最終分離獲得一株菌株命名為Y40,具有優異的解 磷效果。
[0032] 菌株Y40在LB平板上的菌落呈乳白色，皺褶，邊緣不整齊，具有一定的黏性，易挑 起。在顯微鏡下所觀察到的營養體細胞，革蘭氏染色陰性，菌體著色均勻，呈球桿狀，兩端鈍 平，呈不規則形狀。淀粉水解反應，V. P反應，接觸酶反應，利用檸檬酸鹽反應，甲基紅反應， 明膠液化反應均呈陽性，葡萄糖，阿拉伯糖，葡萄糖酸鹽，癸酸，己二酸，蘋果酸，苯乙酸利用 均呈陽性。7%似(：1生長。菌株163扣嫩序列構建的系統發育樹見圖1。菌株￥40位于 Acinetobacter calcoaceticus分支上，結合生理生化試驗將Y40歸類為Acinetobacter calcoaceticus，將其保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為 CGMCC NO. 10241。
[0033] 實施例2、功能菌灌菌菌懸液的生產
[0034] 將菌株Y40(CGMCC NO. 10241)接種至LB培養液中液體發酵生產，發酵生產的條件 為：pH 6. 0~7. 0,發酵溫度范圍30~35°C，攪拌速度為170~200轉/分鐘，發酵時間為 40h，