專利名稱：：食源性致病菌的檢測方法
技術領域：
：本發明涉及一種細菌的分子鑒定，尤其是涉及一種利用探針編碼檢測食源性致病菌的方法，它是通過單一反應對多個食源性致病菌進行鑒定的實時PCR方法。
背景技術：
：傳統的細菌鑒定主要依靠細菌培養、血清學、生物化學及細菌形態學等方法進行分類鑒定([6]、GraciasKSandMcKillipJL.Areviewofconventionaldetectionandenumerationmethodsforpathogenicbacteriainfood[J].CanJMicrobiol,2004,50(ll):883-890)。傳統的方法雖然可靠，但是往往需要幾天甚至幾周的時間才能獲得結果；而且細菌的表型會受環境的影響，從而給鑒定帶來困難；此夕卜，當細菌處于"VBNC"狀態時，傳統方法就難以檢測([7]、OliverJD.Theviablebutnonculturablestateinbacteria[J].JMicrobiol,2005，43SpecNo:93-100)。分子生物學手段，尤其是PCR技術以其快速、靈敏、特異等優點在食源性致病菌中廣泛應用([l]、MalomyB，TassiosPT，RadstromP,etal.StandardizationofdiagnosticPCRforthedetectionoffoodbomepathogens[J].IntJFoodMicrobiol,2003,83(l):39-48;[8]、deBoerEandBeumerRR.Methodologyfordetectionandtypingoffoodbomemicroorganisms[J].IntJFoodMicrobiol,1999,50(1-2):119-130;[9]、FungDYC.Rapidmethodsandautomationinmicrobiology[J].ComprehensiveReviewsinFoodScienceandFoodSafety,2002，1:3-22)，成為傳統檢測方法重要的補充手段。在各種PCR手段中，實時PCR將擴增和檢測合二為一，具有快速、特異、靈敏和可定量等優點，在病原微生物檢測領域有廣泛的應用([IO]、扈慶華，鄭薇薇，石曉路，等.雙重實時PCR快速同時檢測霍亂弧菌和副溶血弧菌[J].中華微生物學和免疫學雜志，2004,24(12):1004-1007;[ll]、NogvaHK,RudiK，NaterstadK,etal.Applicationof5'-nucleasePCRforquantitativedetectionofListeriamonocytogenesinpurecultures,water,skimmilk,andunpasteurizedwholemilk[J].ApplEnvironMicrobiol,2000,66(10):4266-4271;[12]、ChenW，MartinezGandMulchandaniA.Molecularbeacons:areal-timepolymerasechainreactionassayfordetectingSalmonella[J].AnalBiochem,2000,280(1):166-172;[13]、FukushimaH,TsunomoriYandSekiR.Duplexreal-timeSYBRgreenPCRassaysfordetectionof17speciesoffood-orwaterborne'pathogensinstools[J].JClinMicrobiol,2003，41(11):5134-5146;[14]PalomaresC,TorresMJ，TorresA,etal.RapiddetectionandidentificationofStaphylococcusaureusfrombloodculturespecimensusingreal-timefluorescencePCR[J].DiagnMicrobiolInfectDis，2003,45(3):183-189)。但多數檢測方法使用單個熒光探針，只能檢測一種靶序列。開發多目標多任務的實時PCR能進一步提高檢測通量和效率，在這方面不斷有研究者提出新的方法。利用不同熒光標記的探針，可同時對多個靶序列進行檢測，如Vet等人([15]VetJA,Maj他iaAR,MarrasSA,etal.Multiplexdetectionoffourpathogenicretrovirusesusingmolecularbeacons[J].ProcNatlAcadSci,1999,96(11):6394-6399)利用四色實時PCR對HTLV1、HTLV2、HIV-1和HIV-2四種致病性逆轉錄病毒進行同時檢測。但由于受到可檢測的熒光種類的限制，實時PCR難以在一次反應中同時檢測更多的靶序列。新上市的五色實時PCR儀能同時檢測5種不同熒光染料，若使用5種不同的熒光標記探針則至多只能檢測5種靶序列。Lee等([16]LeeLQLivakKJ,MullahB,etal.Seven-color,homogeneousdetectionofsixPCRproducts[J].Biotechniques，1999，27(2):342-349.)利用熒光光度計同步掃描7種熒光染料，也只能同時檢測6種靶序列。此外，利用PCR擴增產物的熔點差異，在實時PCR擴增結束后進行熔點曲線分析，可實現多個靶序列的同時檢測([17]Elenitoba-JohnsonKS,BoWingSD,WittwerCT,etal.MultiplexPCRbymulticolorfluorimetryandfluorescencemeltingcurveanalysis[J].NatMed，2001,7(2):249-253;[18]HerrmannDobrowolskiSFandWittwerCT.Rapidbeta-globingenotypingbymultiplexingprobemeltingtemperatureandcolor[J].ClinChem，2000,46(3):425-428)。但由于PCR產物的熔點范圍狹窄，熔點曲線分析方法很難容下5個以上產物的同時分析，而且容易受到引物二聚體等非特異擴增的干擾，使結果難以判斷。
發明內容本發明的目的在于針對現有的食源性致病菌檢測方法中存在的不足，提供一種在四色實時PCR儀上可實現對15種模板的基因分型的食源性致病菌的檢測方法。本發明的技術方案是利用多色組合探針編碼技術，采取一種熒光信號組合對應一種序列的模式，通過廣譜PCR擴增食源性致病菌的16SrRNA和23SrRNA基因的保守區域，利用雙鏈置換探針([29]LiQ,LuanQGuoQ,etal.Anewclassofhomogeneousnucleicacidprobesbasedonspecificdisplacementhybridization[J].NucleicAcidsRes,2002，30(2):E5)針對擴增產物的差異序列進行檢測，從而實現了在單管中對9類常見食源性致病菌的基因分型，可在四色實時PCR儀上實現對15種模板的基因分型。本發明包括以下步驟1)DNA提取將培養后的菌株標本提取DNA。2)通用引物的設計及PCR產物的測序根據食源性致病菌的16SrRNA和23SrRNA基因的保守區域設計3對通用引物，各引物結合位置如下所示5.ce"^灘樣芽孢桿菌人Z.wo"oc"ogewe^單增李斯特菌人iVote^spp.(變形桿菌)，Kc/zo/erae濯亂弧菌入S加ptococciwjsyogewey(化膿性鏈球菌入S.awe^(金黃色葡萄球菌9的上游引物(B1-F)序列位于16SRNA的320339處，序列為5、-CACACTGG(A/G)ACTGAGACACG-3、,下游弓ItKBl-R)位于16SRNA的515532處，序列為5、-CTGCTGGCACG(G/T)AGTTAG-3、；pathogenicco"徵病性大腸桿菌J及幼扭〃as卯.(志賀菌)上游引物(B3-F)位置位于16SRNA的850868處,序列為5'-TCATCTCCGGGGGTAGAGC-3、,下游引物(B3-R)位于16SRNA的10311049處,序列為5、-TGGGCCTTCCCACATCGTT-3、；K;7ara/aewo/聲/cws(副溶血弧菌)上游引物(B2-F)位于置位于16SRNA的950972處,序列為5、-GGTGGAGCATGTGGTTTAATTCG-3、,下游引物(B2-R)位于16SRNA的10891110處，序列為5、-CGGGACTTAACCCAACAT(T/C)TCA-3、.其中Bl-F/R、B2-F/R和B3-F/R擴增片段長度分別為213bp、161bp和200bp;為了確保探針結合區序列的保守性，對各類代表性菌株的PCR產物進行測序，通過DNA測序獲得相關序列。3)熒光雙鏈置換探針的設計將通過DNA測序獲得的相關序列結合GenBank中相關的序列，利用引物設計軟件ClustalX(1.8)和Blastn確定3對通用引物擴增區內各目標菌的標簽序列，即探針的特異序列，探針的特異序列如表1，然后根據探針的特異序列設計熒光雙鏈置換探針，熒光雙鏈置換探針序列如表2。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表2<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>4)多色探針編碼體系設計采用單色或雙色編碼的探針檢測相應的目標菌，通過熒光標記的熒光信號組合，實現在單管中對9類常見食源性致病菌的區分和檢測，熒光標記和具體的編碼設計方案如表3;表3<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>其中蠟樣芽孢桿菌(5.cwet^)、致病性大腸桿菌和志賀菌(pathogenic￡.co/z'&幼/ge〃aspp.)、單增李斯特菌a.附owcytoge"M)及沙門菌(&/wo"e〃aspp.)采用單色編碼的探針進行檢測，這幾種菌株標記的特異熒光信號依次分別為FAM、HEX、ROX和CY5;副溶血弧菌(K;ara^e附o/j^c2^)、變形桿菌(iVofe^spp.)、霍亂弧菌(Kc/w/erae)、化膿性鏈球菌(5./^0取《^)和金黃色葡萄球菌(S.m/w^)則采用雙色編碼的探針進行檢測，這幾種菌株標記的特異熒光信號依次分別為FAM+HEX、FAM+ROX、FAM+CY5、HEX+ROX和ROX+CY5，根據實時PCR反應中采集的熒光信號的組合類型或編碼，即可直接判斷所檢測模板的種類。5)變溫雜交反應為了模擬實時PCR反應中的探針雜交過程，考察探針置換雜交的特異性，同時確定實時PCR反應的最佳檢測溫度，合成與檢測探針匹配的靶序列及部分干擾序列見表4;合成的雜交序列比熒光鏈在兩端多出若干個堿基；表4<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表中，a"*-w"表示該序列與特異的探針序列完全互補，而代號為，m(l/2/3)"的，為互補序列的干擾序列..黑體帶下劃線的堿基為干擾序列中與互補序列不同的堿基。6)單重實時PCR體系的構建單重實時PCR含一對引物和一對熒光雙鏈置換探針，能對一類食源性致病菌進行檢測。7)多重多色實時PCR體系的構建多重多色實時PCR體系含3對通用引物和14對熒光雙鏈置換探針，能在一個PCR管中對9類食源性致病菌中任意一類的區分和檢測。8)多重多色實時PCR體系的驗證驗證采用129個菌株樣本，129個菌株樣本包括9種標準菌株和從臨床病人或食物中獲得的樣本，以驗證所建立體系的特異性，所述9種標準菌株為及"w^灘樣芽孢桿菌人Z.wo"oc,ge"es萍增李斯特菌」，Pra/冊spp.(變形桿菌),K"由/erae濯舌L弧菌」，S/re/tococcMS;;;ogewe^化膿性鏈球菌,S.awe^f金黃色葡萄球菌卩，pathogenicco/Z徵病性大腸桿菌」，5Wge〃aspp.(志賀菌)禾卩K_para/zae/wo/_y//o/51(畐ij、溶血弧菌)。在步驟1)中，所述菌株可通過以下培養液培養，金黃色葡萄球菌可采用7.5%NaCl肉湯等培養，霍亂弧菌和副溶血弧菌可采用堿性蛋白胨水等培養，化膿性鏈球菌可采用葡萄糖肉浸液肉湯等培養，其它細菌一般可通過營養肉湯或營養瓊脂等培養。所述將培養后的菌株標本提取DNA可采用水煮裂解法，具體步驟如下取過夜培養的1ml菌液離心獲得菌體，或從營養瓊脂平板上獲得菌苔，用lOO(id無菌水懸浮菌體，10(TC加熱10min，冷卻至室溫，13000xg離心8min，取上清作為PCR擴增的模板。在步驟2)中，所述食源性致病菌包括致病性大腸桿菌和志賀菌(pathogeniccoh'&S7/ge〃flspp.)、沙、門菌(Sfl/mo"g〃aspp.)、單增李斯特菌(Z.mo"oc聲ogewe50、蠟樣芽孢桿菌(5.cerez^)、金黃色葡萄球菌(S.m/ww)、霍亂弧菌(K.c/w/erae)、副溶血弧菌(K戸ra/uj^附o/WcMS)、變形桿菌(尸ra加51spp.)和化膿性鏈球菌(S/r印ZococoAS/3yoge"e50等。所述對各類代表性菌株的PCR產物進行測序可用PCR采用25pl反應體系，內含1xbuffer(50mMKCl，10mMTris-HCl，pH8.6)'1.5mMMgCl2,0.4pM各通用引物，0.2mMdNTP，1.0U7V^酶，1nlDNA模板。PCR程序為94。C3min;94。C15s，58°C20s，72°C15s(共35個循環)。PCR產物經過1.5。/a瓊脂糖凝膠電泳分離后，割膠回收，最后通過電泳估算DNA含量(與已知濃度的DNAmarker比對亮度)。測序反應采用10nl體系，內含4plDTCSQuickStartMasterMix,1^測序引物(5pM)，0.5-4^1DNA模板(含量在5-8ng之間)，雙蒸水補足10pl。反應程序為96°C20s，50°C20s，60°C4min(共30個循環)。結束后在10|il反應體系中加入1^3MNaAC(pH5.2)，1pilOOmMEDTA(pH8.0)及0.5piGlycogen(20mg/mL)終止反應。然后通過乙醇沉淀、70%冰乙醇洗滌和室溫晾干等步驟對測序產物進行純化，最后在每個樣品管中加入30^甲酰胺溶解產物，利用CEQ8000遺傳分析系統進行DNA測序。在步驟3)中，3對通用引物和熒光雙鏈置換探針的設計均通過ClustalX(1.8)、PrimerPremierv5.00、01igov6.31禾卩TmUtilityvl.3等軟件輔助完成。通用引物和熒光雙鏈置換探針由上海生工生物工程技術服務有限公司和寶生物工程(大連)有限公司合成。雙鏈置換探針配置如下標記熒光基團的長鏈和標記淬滅基團的短鏈按1:1.2(以OD26o計算)的比例混勻，避光保存([29]LiQ，LuanQGuoQ,etal.Anewclassofhomogeneousnucleicacidprobesbasedonspecificdisplacementhybridization[J].NucleicAcidsRes,2002,30(2):E5)。每個反應管內所含的探針濃度均指熒光標記鏈和淬滅鏈的總濃度。在步驟5)中，變溫雜交反應采用25pi反應體系，內含lxbuffer(67mMTris-HCl，16.6mM(NH4)2S04，85pg/mLBSA，pH8.0)，2.0mMMgCl2，0.4探針和1.2雜交序列。反應程序為94°C3min;94°C10s，85°C-40°C(每循環一次溫度下降1°C)15s(46個循環)。使用Rotor-Gene3000實時PCR儀在每次雜交時采集熒光數據。在步驟6)中，單重實時PCR體系的構建采用25ial反應體系，內含lxbuffer(67mMTris-HCl，16.6mM(NH4)2S04，85pg/mlBSA，pH8.0)，2.0mMMgCl2，0.4一引物，0.4探針，0.2mMdNTP，1.0UTa《酶，lplDNA模板；PCR程序為94°C3min;94°C15s，55.。C20s(檢測FAM、HEX、ROX和CY5四種熒光信號)，72。C15s(共40個循環)。在步驟7)中，最終構建的多重多色實時PCR體系為25^1，內含lxbuffer(67mMTris-HCl，16.6mM(NH4)2S04，85pg/mLBSA，pH8.0)，3.0mMMgCl2，0.5|aMB1誦F/R，0.3B2-F/R，0.4B3-F/R，各個探針終濃度0.2|xM-0.4不等，0.2mMdNTP，1.0UTag酶，1piDNA模板。反應程序為94°C3min;94°C10s，45°C5s，檢測FAM、HEX、ROX和CY5四種熒光信號，55°C20s，72°C15s,40個循環。在步驟8)中，所述多重多色實時PCR體系檢測129株菌株由廈門市疾病預防控制中心、深圳市疾病預防控制中心和深圳市羅湖區疾病預防控制中心從歷年食物中毒事件中分離并保藏的。與現有的食源性致病菌的檢測方法相比，本發明具有以下突出的優點1.引物的設計是根據9類食源性致病菌的16SrRNA和23SrRNA基因的保守區域設計的3對通用引物。2.熒光雙鏈置換探針的設計，主要是在DNA測序獲得大量相關序列后結合GenBank中相關的序列，確定通用引物擴增區內各目標菌的標簽序列，然后根據這些序列用軟件設計引物和探針序列，探針采用單色或雙色熒光進行標記，每種標記方式對應一種菌種，從而實現單一反應對9種菌同時檢測的目的。3.熒光雙鏈置換探針的配制，標記熒光基團的長鏈和標記淬滅基團的短鏈以OD260計算按1:1.2的比例保存使用。4.多色探針編碼體系采用單色和雙色編碼的探針檢測相應的目標菌，通過特定的熒光信號組合，單信號或雙信號對應一種目標菌，從而實現了在單管中對9類常見食源性致病菌的區分和檢測；其中蠟樣芽孢桿菌、致病性大腸桿菌和志賀菌、單增李斯特菌及沙門菌采用單色編碼的探針進行檢測，各自的特異熒光信號分別為FAM>HEX、ROX和CY5;副溶血弧菌、變形桿菌、霍亂弧菌、化膿性鏈球菌和金黃色葡萄球菌則采用雙色編碼的探針進行檢測，各自的特異熒光信號分別為FAM+HEX、FAM+ROX、FAM+CY5、HEX+ROX和ROX+CY5。5.PCR反應中的探針雜交過程，考察探針置換雜交的特異性，同時確定實時PCR反應的最佳檢測溫度，本發明合成與檢測探針互補的靶序列及部分干擾序列，合成的雜交序列比熒光鏈在兩端多出若干個堿基；所述的變溫雜交反應是指在置換探針及干擾序列同時存在時，二者與靶序列競爭雜交，特異性探針在與靶序列雜交時具有極好的特異性。本反應采用25pl反應體系，內含lxbuffer,包括67mMTris-HCl，16.6mM(NH4)2S04，85ng/mLBSA，pH8.0，2.0mMMgCl2，0.4探針和1.2pM雜交序列；反應程序為94°C3min;94°C10s，85°C-40°C，每循環一次溫度下降rC，經過15s，46個循環。6.最佳檢測溫度為50°C60°C。7.構建的多重多色實時PCR體系，該體系為25pl，內含lxbuffer,包括67mMTris-HCl，16.6mM(NH4)2S04，85(ig/mLBSA，pH8.0;3.0mMMgCl2，0.5pMBl-F/R，0.3pMB2國F/R，0.4B3-F/R，各個探針終濃度0.2不等，0.2mMdNTP，1.0U7b《酶，1piDNA模板；反應程序為94°C3min;94°C10s，45°C5s，檢測FAM、HEX、ROX和CY5四種熒光信號，55°C20s，72。C15s，40個循環，該體系含三對通用引物，14對熒光雙鏈置換探針，能在一個PCR管中對9類食源性致病菌中任意一類的區分和檢測。圖1為多重實時PCR原理圖。用以標記的4種熒光基團分別為FAM(黃色),HEX(粉紅)，ROX(紫色)，CY5(綠色).紅色框所標出的位置為引物所在的位置.菌種縮寫分別代表如下Be,及cewws灘樣芽孢桿菌」；Lm,Z/Wen'awowoc;^ogewe^單增李斯特菌)；Pro,spp.(變形桿菌)；Vc,W6n'oc/o/era^霍舌L弧菌力Sp,5!fre/^ococcus/5yoge"g5f化膿性鏈球菌」；Sa，Sto//^/ococa^m/wt/5f金黃色葡萄球菌)；Vp,W6n'o/ara/zafewo/^/ci^("畐!j溶血弧菌力ES,pathogenicco//c&幼/gWtospp.(致病性大腸桿菌和志賀菌)；Sal,spp.(變形桿菌)。"1","0"代表相應熒光信號的陽性,陰性結果。圖2為多重引物PCR擴增產物的凝膠電泳圖。(A)Bl-F/R;(B)BB2-F/R;(C)B3-F/R。M:pUC19DNA分子大小標準；C:空白對照；泳道1-泳道9:9種菌種的PCR產物。圖3為置換探針熱變性曲線。灰色實線為溶液中無匹配靶序列時的溶解曲線；黑色實線為溶液中有匹配靶序列時的溶解曲線；虛線為溶液中干擾序列存在時的溶解曲線。橫坐標為反應溫度，縱坐標為熒光強度。圖4為雙鏈置換探針系統檢測單菌種的典型結果。信號標識如下所示FAM(-△-);HEX(-▲-);ROX(-o-);CY5(--)。橫坐標為PCR的循環數，縱坐標為熒光強度。具體實施例方式以下實施例將結合附圖對本發明作進一步的說明。實施例中采用的菌株來自廈門市疾病預防控制中心、深圳市疾病預防控制中心和深圳市羅湖區疾病預防控制中心。采用的儀器設備參見表5。表5儀器名稱(規格)生產廠商熒光定量PCR儀(MX3000P)美國Stratagene公司熒光定量PCR儀(Rotor-Gene3000)澳大利亞CorbettResearch公司遺傳分析系統(CEQ8000)美國BeckmanCoulter公司小型臺式高速離心機(centriftige5415D)德國Eppendorf公司臺式高速(冷凍)離心機(centrifUge5804R)德國Eppendorf公司普通PCR儀(T3)德國Biometra公司超微量分光光度計(NanodropND-1000)美國Nanodrop公司凝膠成像系統(TanonGIS-2016)上海天能科技有限公司測序試劑盒(GenomeLabTMDyeTerminatorCycleSequencingwithQuickStartKit)購自美國BeckmanCoulter公司，膠回收試劑盒(OMEGAE.Z.N.Z.GelExtractionKit)購自美國OMEGA公司，營養肉湯、營養瓊脂、堿性蛋白胨水和葡萄糖肉浸液肉湯購自北京陸橋技術有限責任公司。以下給出檢測食源性致病菌的具體方法。1)菌株培養金黃色葡萄球菌采用7.5%NaCl肉湯培養，霍亂弧菌和副溶血弧菌采用堿性蛋白胨水培養，化膿性鏈球菌采用葡萄糖肉浸液肉湯培養，其它細菌一般通過營養肉湯或營養瓊脂培養。2)DNA提取菌株標本采用水煮裂解法提取DNA。具體步驟如下取過夜培養的lml菌液離心獲得菌體，或從營養瓊脂平板上獲得菌苔。用100n玩菌水懸浮菌體，10(TC加熱10min，冷卻至室溫，13000xg離心8min，取上清作為PCR擴增的模板。3)通用引物的設計及PCR產物的測序根據9類食源性致病菌的16SrRNA和23SrRNA基因的保守區域設計三對通用引物，各引物結合位置示意圖參見圖1，5."w^贈樣芽孢桿菌人丄.m朋oc^ogewe^單增李斯特菌人Pra&^spp.(變形桿菌)，Kc/zo/eraef霍亂弧菌」，S加/7tococcm^ogewe^化膿性鏈球菌」，S."wm^金黃色葡萄球it)的上游引物(B1-F)序列位于16SRNA的320-339處,下游引物(B1-R)位于16SRNA的515-532處;pathogenic五.co/z'徵病性大腸桿菌)及幼/getospp.(志賀菌)上游引物(B3-F)位置位于16SRNA的850-868處，下游引物(B3-R)位于16SRNA的1031-1049處；r.para/wewo/Wcm(副溶血弧菌)上游引物(B2-F)位于置位于16SRNA的950-972處,下游引物(B2-R)位于16SRNA的1089-1110處。其中Bl-F/R、B2-F/R和B3-F/R擴增片段長度分別為213bp、161bp和200bp。序列參見表6。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>為了確保探針結合區序列的保守性，對各類代表性菌株的PCR產物進行測序。測序用PCR采用25nl反應體系，內含1xbuffer(50mMKC1，10mMTris-HCl，pH8.6)，1.5mMMgCl2，0.4pM各通用引物，0.2mMdNTP，1.0Urfl《酶，ljilDNA模板。PCR程序為94°C3min;94°C15s，58。C20s，72°C15s(共35個循環)。PCR產物經過1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離后，割膠回收，最后通過電泳估算DNA含量(與己知濃度的DNAmarker比對亮度)。測序反應采用10pl體系，內含4nlDTCSQuickStartMasterMix,1^測序引物(5pM)，0.5-4^1DNA模板(含量在5-8ng之伺)，雙蒸水補足10pl。反應程序為96°C20s，50°C20s，60°C4min(共30個循環)。結束后在10反應體系中加入13MNaAC(pH5.2)，1pllOOmMEDTA(pH8.0)及0.5piGlycogen(20mg/mL)終止反應。然后通過乙醇沉淀、70%冰乙醇洗滌和室溫晾干等步驟對測序產物進行純化，最后在每個樣品管中加入30^甲酰胺溶解產物，利用CEQ8000遺傳分析系統進行DNA測序。4)熒光雙鏈置換探針的設計通過DNA測序獲得大量相關序列，并結合GenBank中相關的序列，利用ClustalX(1.8)和Blastn確定通用引物擴增區內各目標菌的標簽序列(特異序列)，然后根據這些序列設計熒光雙鏈置換探針。引物和探針的設計均通過ClustalX(1.8)、PrimerPremierv5.00、Oligov6.31和TmUtilityvl.3等軟件輔助完成。所有的引物和探針序列具體見表3-l。引物和探針的結合位置見示意圖3-1。其中B1-F/R、B2-F/R和B3-F/R擴增片段長度分別為213bp、161bp和200bp。引物和探針由上海生工生物工程技術服務有限公司和寶生物工程(大連)有限公司合成。雙鏈置換探針配置如下標記熒光基團的長鏈和標記淬滅基團的短鏈按1:1.2(以OD260計算)的比例混勻，避光保存(參見文獻[29]LiQ，LuanQGuoQ,etal.Anewclassofhomogeneousnucleicacidprobesbasedonspecificdisplacementhybridization[J].NucleicAcidsRes，2002，30(2):E5)。5)多色探針編碼體系的設計采用單色或雙色編碼的探針檢測相應的目標菌，通過特定的熒光信號組合(單信號或雙信號)對應一種目標菌，從而實現了在單管中對9類常見食源性致病菌的區分和檢測。其中蠟樣芽孢桿菌(丑cemw)、致病性大腸桿菌和志賀菌(pathogenic￡.co//&幼/ge/Zaspp.)、單增李斯特菌a.附o"oc^ogewe;y)及沙門菌(Sa/mo"e//aspp.)采用單色編碼的探針進行檢測，各自的特異熒光信號分別為FAM、HEX、ROX和CY5;副溶血弧菌/ara/aewoi[yria^)、變形桿菌(iVo/e^spp.)、霍亂弧菌(Kc/w/eme)、化膿性鏈球菌(S.;^ogew")和金黃色葡萄球菌(S.fl"m^)則采用雙色編碼的探針進行檢測，各自的特異熒光信號分別為FAM+HEX、FAM+ROX、FAM+CY5、HEX+ROX和ROX+CY5。具體的編碼設計方案如表3所示。正是由于熒光信號組合與目標菌的一一對應關系，只要根據實時PCR反應中采集的熒光信號的組合類型(或編碼)，即可直接判斷所檢測模板的種類。6)變溫雜交反應為了模擬實時PCR反應中的探針雜交過程，考察探針置換雜交的特異性，同時確定實時PCR反應的最佳檢測溫度，并合成與檢測探針匹配的靶序列及部分干擾序列，序列見表4。合成的雜交序列比熒光鏈在兩端多出若干個堿基。在表4中，a"*-w"表示該序列與特異的探針序列完全互補，而代號為"、m(1/2/3)"的,為互補序列的干擾序列..黑體帶下劃線的堿基為干擾序列中與互補序列不同的堿基。變溫雜交反應采用25pl反應體系，內含lxbuffer(67mMTris-HCl，16.6mM(NH4)2S04，85pg/mLBSA，pH8.0)，2.0mMMgCl2，0.4pM探針和1.2pM雜交序列。反應程序為94°C3min;94°Cl0s，85°C-40°C(每循環一次溫度下降1°C)15s(46個循環)。使用Rotor-Gene3000實時PCR儀在每次雜交時采集熒光數據。7)單重實時PCR體系的構建采用25pl反應體系，內含lxbuffer(67mMTris-HCl，16.6mM(NH4)2S04，85pg/mlBSA，pH8.0)，2.0mMMgCl2，0.4nM引物，0.4nM探針，0.2mMdNTP，1.0UTag酶，lplDNA模板。PCR程序為94。C3min;94°C15s，55°C20s(檢測FAM、HEX、ROX和CY5四種熒光信號)，72°C15s(共40個循環)。8)多重多色實時PCR體系的構建通過組合單重實時PCR體系，并經過一系列優化步驟，最終建立了多重多色實時PCR體系。該體系含三對通用引物，14對熒光雙鏈置換探針，能在一個PCR管中對9類食源性致病菌中任意一類的區分和檢測。最終確立的多重多色實時PCR體系為25nl，內含lxbuffer(67mMTris-HCl，16.6mM(NH4)2S04，85pg/mLBSA，pH8.0)'3.0mMMgCl2，0.5pMBl-F/R，0.3B2-F/R，0.4B3-F/R，各個探針終濃度0.2nM不等，0.2mMdNTP，1.0U7^《酶，1^dDNA模板。反應程序為94。C3min;94°C10s，45°C5s(檢測FAM、HEX、ROX和CY5四種熒光信號)，55。C20s，72。C15s(共40個循環)。9)多重多色實時PCR體系檢測129株菌株對129株菌株(包括標準菌株和從臨床病人或食物中獲得的分離株)進行檢測以驗證所建立體系的特異性。檢測的分離株是由廈門市疾病預防控制中心、深圳市疾病預防控制中心和深圳市羅湖區疾病預防控制中心從歷年食物中毒事件中分離并保藏的。以下對上述結果作進一步的討論。1.熒光雙鏈置換探針的分型原理。熒光雙鏈置換探針由兩條互補配對的脫氧核糖核酸鏈組成，其中一條為長鏈(5'端標記熒光基團，3'端進行封閉修飾以阻止延伸)，另一條為短鏈(3'端標記淬滅基團)，長短鏈相差若干堿基。根據熒光共振能量轉移的原理，在沒有靶序列存在的情況下，置換探針保持穩定的雙鏈互補結構，熒光基團與淬滅基團緊密靠近，熒光基團的熒光被淬滅，此時檢測不到熒光。當靶序列存在時，在PCR的退火階段，長鏈優先與靶序列雜交結合(即發生置換雜交)，熒光基團與淬滅基團由于兩條鏈的分離而分開，熒光基團的熒光無法被淬滅基團淬滅，此時就可以檢測到熒光信號。由于置換探針自身處于相對穩定的雙鏈結構，存在著與靶序列雜交的競爭作用，因此在與靶序列雜交時具有極好的特異性，具有識別單堿基突變的能力，而且其特異性可以通過調節探針的長度和兩條鏈相差的堿基數(參見文獻[29])來實現。在本實施例中，根據序列區分度的不同要求，通過調節探針的長度和兩條鏈相差的堿基數，不僅實現了對差異較大序列間的區分，而且也成功實現了對相近序列的分辨。2.PCR產物的測序。所設計的通用引物對于使用的模板均能擴增得到目的產物，大小與預期相符，典型結果參見圖2。通過對5株致病性大腸桿菌，9株志賀氏菌，2株金黃色葡萄球菌，2株單增李斯特菌，2株霍亂弧菌，3株副溶血弧菌，4株溶血性鏈球菌，9株蠟樣芽孢桿菌，ll株變形桿菌，12株沙門氏菌的相關PCR產物進行測序，驗證了擬設計探針的結合區域的保守性，進一步驗證所選擇標簽序列的特異性，為下一步實驗奠定基礎。3.熒光雙鏈置換探針的變溫雜交反應。參見圖3，置換探針在較高的溫度下，兩條鏈彼此分開，探針發出熒光，此時體系中無論靶序列是否存在，都具有高而穩定的熒光值。當溫度下降到一定程度時，探針可與完全匹配的靶序列發生置換雜交，體系有高而穩定的熒光值；如果沒有完全匹配的靶序列存在，則熒光置換探針將維持自身雙鏈結構，體系熒光值劇減，熒光強度與空白管相當。從實驗結果可以看出，這些置換探針的檢測溫度在506(TC范圍之間較為合理。部分干擾序列在低溫雜交顯示可能會產生非特異性信號，這些信息為實際檢測體系的構建指明了方向。對于序列相同僅標記不同的探針，圖3中只給出其中一種探針的變溫雜交反應情況。總之，變溫雜交反應模擬了在實際檢測體系中置換探針與PCR產物雜交的情況，其中反映的熒光信號的釋放總量、雜交效率、特異性等大量信息充分反映了探針的性能，從而可以有效地指導實際檢測體系的構建和優化。4.單重單色熒光PCR體系的構建。按上述方法，單重單色實時PCR在相同反應條件下，成功實現了對9類目標菌的單獨檢測，從而為下一步組建多重多色熒光PCR體系奠定堅實的基礎。5.多重多色熒光PCR體系的構建。從單重單色熒光PCR體系到多重多色熒光PCR體系，主要包括兩大方面的挑戰①多重引物間容易引起非特異擴增；②探針的大量共存會造成熒光本底的上升，彼此間干擾也會加劇。因此優化的重點主要集中在優化多重引物的擴增和優化探針的雜交效率及特異性，具體涉及引物濃度和比例、Mg&濃度、探針濃度和比例、PCR程序、PCR緩沖液種類等方面。為了提高探針的雜交效率，采用熒光檢測步驟與引物退火相分離的方法，在低溫(45°C)檢測熒光，而在正常溫度(55°C)進行引物退火，實驗結果表明這種方法具有良好的效果。最終構建的體系檢測相應目標菌的典型結果如圖4所示。6.多重多色熒光PCR體系檢測129株菌株利用上述建立的多重多色熒光PCR體系檢測129株分離株及標準株，結果顯示對于所檢測的9類常見的食源性致病菌，該體系均能進行準確區分和檢測。所有檢測菌株的匯總結果見表7。表7菌種檢測的菌株數實時PCR結果BcEsLmSalVpproVcSpSa10￡coff0157:H7EIECEPECdianheogenic五.coA幼^//。柳.M^rtocftoileraeOl附Wo。139102122339在表7中，a+，陽性;-，陰性。縮寫分別代表如下Be,5.cew^灘樣芽孢桿菌力Lm,"她r/awowoc少togewes("單增李斯特菌大Pro,Prafewsspp.(變形桿菌)；Vc，J%Woc/w/erae濯亂弧菌」；Sp,5!f邵tococa^/少oge"esf化膿性鏈球菌力Sa,S鄉A^/ococciASa,"5/金黃色葡萄球斷；Vp,糊Woj3aratoewo(y"'c2^(li丄溶血弧菌)；ES,pathogenicco//c&S^ge//"spp.(致病性大腸桿菌和志賀菌)；Sal,5W附匿〃aspp.(變形桿菌)。由上述結果分析可見，本發明根據細菌16SrRNA和23SrRNA基因序列，設計3對通用引物，根據通用引物擴增區各致病菌的標簽序列設計置換探針，通過多色組合探針編碼技術實現了在一個PCR體系中對9類食源性致病菌的區分，即致病性大腸桿菌或志賀氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、霍亂弧菌、副溶血弧菌、蠟樣芽孢桿菌、變形桿菌和溶血性鏈球菌等。rRNA基因包括長約2.9kb的23SrRNA、1.5kb的16SrRNA、0.12kb的5SrRNA基因，進化速度十分緩慢，具有"分子進化鐘"的特點(見文獻[30]WoeseCR.Bacterialevolution[J].MicrobiolRev,1987，51(2):221-271;[3l]MillarBC,XuJandMooreJE.Riskassessmentmodelsandcontaminationmanagement:implicationsforbroad-rangeribosomalDNAPCRasadiagnostictoolinmedicalbacteriology[J].JClinMicrobiol,2002,40(5):1575-1580)，是目前細菌的系統發育分類與鑒定的最常用的靶基因。16SrRNA基因序列分析己成為細菌種屬鑒定和系統分類的"金標準，，(參見文獻[32]ClarridgeJE.Impactof16SrRNAgenesequenceanalysisforidentificationofbacteriaonclinicalmicrobiologyandinfectiousdiseases[J].ClinMicrobiolRev,2004,17(4):840-862)。rRNA基因序列既具有保守性，又有一定的變異性，保守性反映生物物種的親緣關系，變異性則揭示生物物種的特征核酸序列(參見文獻[31]MillarBC,XuJandMooreJE.Riskassessmentmodelsandcontaminationmanagement:implicationsforbroad-rangeribosomalDNAPCRasadiagnostictoolinmedicalbacteriology[J].JClinMicrobiol,2002，40(5):1575-1580))，是種屬鑒定的分子基礎。由于16SrRNA和23SrRNA基因序列具有高度保守性，長度基本恒定，對于相近種或同一種內不同菌株之間的鑒別分辨力較差，如同屬腸桿菌科的志賀菌屬和大腸桿菌屬擁有極高的序列相似性，根據rRNA基因序列無法將兩者區分(參見文獻[20]Zuco1F,AmmannRA，BergerC,etal.Real-timequantitativebroad-rangePCRassayfordetectionofthe16SrRNAgenefollowedbysequencingforspeciesidentification[J].JClinMicrobiol,2006,44(8):2750-2759)，在本實施例中就將致病性大腸桿菌和志賀菌歸為同一類進行檢測。16S-23SrRNA基因間區(IntergenicSpacerRegion,ISR)是指位于16SrRNA基因和23SrRNA基因之間的間隔區域。與16SrRNA和23SrRNA基因相比，ISR區域由于沒有特定的功能，進化速率比16SrRNA基因大10多倍，因而具有更高的變異性，表現出長度和序列上的多態性，在細菌種屬分類中具有一定的優勢(參見文獻[27]Perez-LuzS,YanezMAandCatalanV.Identificationofwaterbornebacteriabytheanalysisof16S-23SrRNAintergenic'spacerregion[J].JApplMicrobiol,2004,97(1):191-204;[28]JensenMA，WebsterJAandStrausN.Rapididentificationofbacteriaonthebasisofpolymerasechainreaction-amplifiedribosomalDNAspacerpolymorphisms[J].ApplEnvironMicrobiol,1993，59(4):945-952)。但由于16S-23SrRNA基因間區序列長度有限，無法滿足微生物細化的分類要求。此外也有報道通過5SrRNA基因序列的異源二聚體分析對軍團菌進行分類(參見文獻[33]PinarA,AhkeeS,MillerRD,etal.Useofheteroduplexanalysistoclassifylegionellaeonthebasisof5SrRNAgenes叫uences[J].JClinMicrobiol,1997,35(6):1609-1611)，但5SrRNA基因相對較小(約120個核苷酸)，攜帶的信息較少，應用范圍有限。本實施例綜合分析目標菌的16SrRNA、23SrRNA、5SrRNA基因及16S-23SrRNA基因間區的序列，最終選定16SrRNA和23SrRNA基因作為靶基因，借助擴增片段的差異序列成功區分各目標菌群。另外需要特別注意的問題的是，廣譜PCR的突出優點是普適性，即使用一對引物就能廣泛地擴增目的片段，可以省卻使用多對引物擴增的麻煩，但廣譜PCR較之菌種特異性PCR更容易受污染(參見文獻[20]ZucolF,A腿annRA，BergerC，etal.Real-timequantitativebroad-rangePCRassayfordetectionofthe16SrRNAgenefollowedbysequencingforspeciesidentification[J].JClinMicrobiol,2006,44(8):2750-2759;[31]MillarBC，XuJandMooreJE.Riskassessmentmodelsandcontaminationmanagement:implicationsforbroad-rangeribosomalDNA'PCRasadiagnostictoolinmedicalbacteriology[J].JClinMicrobiol,2002,40(5):1575-1580)。研究發現7b《酶(參見文獻[31]MillarBC,XuJandMooreJE.Riskassessmentmodelsandcontaminationmanagement:implicationsforbroad-rangeribosomalDNAPCRasadiagnostictoolinmedicalbacteriology[J].JClinMicrobiol,2002,40(5):1575-1580;[34]MeierA，PersingDH,FinkenM，etal.EliminationofcontaminatingDNAwithinpolymerasechainreactionreagents:implicationsforageneralapproachtodetectionofunculturedpathogens[J].JClinMicrobiol,1993，31(3):646-652;[35]BottgerEC.FrequentcontaminationofTaqpolymerasewithDNA[J].ClinChem，1990，36(6):1258隱1259;[36]TsengCP,ChengJC,TsengCC，etal.Broad-rangeribosomalRNAreal-timePCRafterremovalofDNAfromreagents:meltingprofilesforclinicallyimportantbacteria[J].ClinChem,2003，49(2):306-309)和PCR反應液(參見文獻[36]TsengCP,ChengJC,TsengCC,etal.Broad-rangeribosomalRNAreal-timePCRafterremovalofDNAfromreagents:meltingprofilesforclinicallyimportantbacteria[J].ClinChem,2003,49(2):306-309))等經常會存在DNA污染，從而阻礙了廣譜PCR的日常應用。對于廣譜PCR的DNA污染問題，已報道有多種方法對PCR反應成分進行處理以減少或消除DNA污染，如紫外線照射(參見文獻[26]HarrisKAandHartleyJC.Developmentofbroad-range16SrDNAPCRforuseintheroutinediagnosticelinicalmicrobiologyservice[J].JMedMicrobiol,2003,52(88):685-691;[37]CorlessCE,GuiverM,BorrowR，etal.Contaminationandsensitivityissueswithareal-timeuniversal16SrRNAPCR[J].JClinMicrobiol,2000，38(5):1747-1752.)、PCR前超濾處理(參見文獻[38]YangS,LinS,KelenGD,etal.QuantitativemultiprobePCRassayforsimultaneousdetectionandidentificationtospecieslevelofbacterialpathogens[J].JClinMicrobiol,2002，40(9):3449-3454)、DNase處理(參見文獻[37]CorlessCE,GuiverM,BorrowR,etal.Contaminationandsensitivityissueswithareal-timeuniversal16S畫APCR[J].JClinMicrobiol,2000,38(5):1747-1752;[39]HeiningerA,BinderM,EllingerA,etal.DNasepretreatmentofmastermixreagentsimprovesthevalidityofuniversal16SrRNAgenePCRresults[J].JClinMicrobiol,2003，41(4):1763-1765)、限制性內切酶處理(參見文獻[37]CorlessCE,GuiverM,BorrowR,etal.Contaminationandsensitivityissueswithareal-timeuniversal16SrRNAPCR[J].JClinMicrobiol,2000,38(5):1747-1752;[40]CarrollNM,AdamsonPandOkhraviN.EliminationofbacterialDNAfromTaqDNApolymerasesbyrestrictionendonucleasedigestion[J].JClinMicrobiol,1999,37(10):3402-3404)、8-MOP處理(參見文獻[34]和[37])等。雖然這些處理方法具有一定的成效，但顯然增加了操作步驟，而且會不同程度地影響檢測靈敏度(參見文獻[37])。廣程實時PCR采用閉管檢測、無需電泳，大大減少了污染的機會(參見文獻[20])，另外額外引入的探針會增加檢測的特異性。在本實施例中，NTC(不加模板的對照)在電泳時也會發現微弱的擴增產物帶(可能由r"《酶中殘留痕量的宿主DNA引起的)，但通過實時PCR檢測則不會產生陽性信號。可見，采用基于特異性熒光探針的廣程實時PCR避免了細致繁瑣的前處理步驟，使得檢測步驟更為簡便，結果也更為可靠。本發明充分利用雙鏈置換探針區分差異序列的能力，實現對各目標菌的特異區分和檢測；此外利用MCPC技術，通過基于熒光信號組合的分辨模式，在單管中實現對多至9種模板的區分。但由于靶基因本身特異性的不足，對于近源種的區分能力有限，無法區分rRNA基因序列高度相似的菌種，但是者并不影響其臨床應用價值。權利要求1.食源性致病菌的檢測方法，其特征在于包括以下步驟1)DNA提取將培養后的菌株標本提取DNA；2)通用引物的設計及PCR產物的測序根據食源性致病菌的16SrRNA和23SrRNA基因的保守區域設計3對通用引物，各引物結合位置如下所示B.cereus(蠟樣芽孢桿菌)，L.monocytogenes(單增李斯特菌)，Proteusspp.(變形桿菌)，V.cholerae(霍亂弧菌)，Streptococcuspyogenes(化膿性鏈球菌)，S.aureus(金黃色葡萄球菌)的上游引物(B1-F)序列位于16SRNA的320-339處，序列為5`-CACACTGG(A/G)ACTGAGACACG-3`，下游引物(B1-R)位于16SRNA的515-532處，序列為5`-CTGCTGGCACG(G/T)AGTTAG-3`；pathogenicE.coli(致病性大腸桿菌)及Shigellaspp.(志賀菌)上游引物(B3-F)位置位于16SRNA的850-868處，序列為5`-TCATCTCCGGGGGTAGAGC-3`，下游引物(B3-R)位于16SRNA的1031-1049處，序列為5`-TGGGCCTTCCCACATCGTT-3`；V.parahaemolyticus(副溶血弧菌)上游引物(B2-F)位于置位于16SRNA的950-972處，序列為5`-GGTGGAGCATGTGGTTTAATTCG-3`，下游引物(B2-R)位于16SRNA的1089-1110處，序列為5`-CGGGACTTAACCCAACAT(T/C)TCA-3`．其中B1-F/R、B2-F/R和B3-F/R擴增片段長度分別為213bp、161bp和200bp；為了確保探針結合區序列的保守性，對各類代表性菌株的PCR產物進行測序，通過DNA測序獲得相關序列；3)熒光雙鏈置換探針的設計將通過DNA測序獲得的相關序列結合GenBank中相關的序列，利用引物設計軟件ClustalX(1.8)和Blastn確定3對通用引物擴增區內各目標菌的標簽序列，即探針的特異序列，探針的特異序列如表1表1菌種探針序列B.cereus5′-CACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAG-3′pathogenicE.Coli&Shigella5′-ATGACCCCCTTGCCGAAAC-3′L.monocytogenes5′-GGGACAAGCAGTTACTCTTATCC-3′Salmonellaspp.5′-GCCATCCCGGCTTACCAA-3′V.parahaemolyticus5′-TTCGGGAACTCTGAGACAGG-3′5′-CTTGACATCCAGAGAACTTTCCAG-3′Proteusspp.5′-CTTTACAACCCTAAGGCCTTC-3′V.cholerae5′-CTTAACCACCTTCCTCCCTACTG-3′S.pyogenes5′-AACCTTCTTCACTCACGCG-3′S.aureus5′-TGTGCACATCTTGACGGTACC-3′然后根據探針的特異序列設計熒光雙鏈置換探針，熒光雙鏈置換探針序列如表2表2<tablesid="tabl0001"num="0001">id="icf0001"file="S2008100711050C00021.gif"wi="144"he="157"top="42"left="39"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/></tables>4)多色探針編碼體系設計采用單色或雙色編碼的探針檢測相應的目標菌，通過熒光標記的熒光信號組合，實現在單管中對9類常見食源性致病菌的區分和檢測，熒光標記和具體的編碼設計方案如表3；表3<tablesid="tabl0002"num="0002">id="icf0002"file="S2008100711050C00022.gif"wi="157"he="28"top="248"left="32"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/></tables><tablesid="tabl0003"num="0003">id="icf0003"file="S2008100711050C00031.gif"wi="153"he="76"top="24"left="32"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/></tables>其中蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)、致病性大腸桿菌和志賀菌(pathogenicE.coli&Shigellaspp.)、單增李斯特菌(L.monocytogenes)及沙門菌(Salmonellaspp.)采用單色編碼的探針進行檢測，這幾種菌株標記的特異熒光信號依次分別為FAM、HEX、ROX和CY5；副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、變形桿菌(Proteusspp.)、霍亂弧菌(V.cholerae)、化膿性鏈球菌(S.pyogenes)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)則采用雙色編碼的探針進行檢測，這幾種菌株標記的特異熒光信號依次分別為FAM+HEX、FAM+ROX、FAM+CY5、HEX+ROX和ROX+CY5，根據實時PCR反應中采集的熒光信號的組合類型或編碼，即可直接判斷所檢測模板的種類；5)變溫雜交反應為了模擬實時PCR反應中的探針雜交過程，考察探針置換雜交的特異性，同時確定實時PCR反應的最佳檢測溫度，合成與檢測探針匹配的靶序列及部分干擾序列見表4；合成的雜交序列比熒光鏈在兩端多出若干個堿基；表4<tablesid="tabl0004"num="0004">id="icf0004"file="S2008100711050C00032.gif"wi="171"he="67"top="206"left="34"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/></tables><tablesid="tabl0005"num="0005">id="icf0005"file="S2008100711050C00041.gif"wi="149"he="25"top="26"left="34"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/></tables>表中，a“*-w”表示該序列與特異的探針序列完全互補，而代號為“*-m(1/2/3)”的，為互補序列的干擾序列..黑體帶下劃線的堿基為干擾序列中與互補序列不同的堿基；6)單重實時PCR體系的構建；7)多重多色實時PCR體系的構建通過組合單重實時PCR體系，構建多重多色實時PCR體系，多重多色實時PCR體系含3對通用引物和14對熒光雙鏈置換探針，能在一個PCR管中對9類食源性致病菌中任意一類的區分和檢測；8)多重多色實時PCR體系的驗證驗證采用129個菌株樣本，129個菌株樣本包括9種標準菌株和從臨床病人或食物中獲得的樣本，以驗證所建立體系的特異性，所述9種標準菌株為B.cereus(蠟樣芽孢桿菌)，L.monocytogenes(單增李斯特菌)，Proteusspp.(變形桿菌)，V.cholerae(霍亂弧菌)，Streptococcuspyogenes(化膿性鏈球菌)，S.aureus(金黃色葡萄球菌)，pathogenicE.coli(致病性大腸桿菌)，Shigellaspp.(志賀菌)和V.parahaemolyticus(副溶血弧菌)。2.如權利要求1所述的食源性致病菌的檢測方法，其特征在于在步驟l)中，所述菌株通過以下培養液培養，金黃色葡萄球菌采用7.5%NaCl肉湯培養；霍亂弧菌和副溶血弧菌采用堿性蛋白胨水培養；化膿性鏈球菌采用葡萄糖肉浸液肉湯培養，其它細菌通過營養肉湯或營養瓊脂培養。3.如權利要求1所述的食源性致病菌的檢測方法，其特征在于在步驟l)中，所述將培養后的菌株標本提取DNA采用水煮裂解法，具體步驟如下取過夜培養的1ml菌液離心獲得菌體，或從營養瓊脂平板上獲得菌苔，用100pl無菌水懸浮菌體，IO(TC加熱10min，冷卻至室溫，13000xg離心8min，取上清作為PCR擴增的模板。4.如權利要求1所述的食源性致病菌的檢測方法，其特征在于在步驟2)中，所述食源性致病菌包括致病性大腸桿菌和志賀菌(pathogenicco/z'&幼/ge〃aspp.)、沙門菌(Sa/附o"e〃aspp.)、單增李斯特菌a.wowoc;;toge"es)、蠟樣芽孢桿菌(5.ce"ws)、金黃色葡萄球菌(S.ot/wm)、霍亂弧菌(F.c/w/erae)、副溶血弧菌(K;ara/^ewo(y"ctw)、變形桿菌(iVo&iwspp.)禾口化膿性鏈球菌(S^邵tococctw;yoge"ey)。5.如權利要求1所述的食源性致病菌的檢測方法，其特征在于在步驟2)中，所述對各類代表性菌株的PCR產物進行測序用PCR釆用25nl反應體系，內含lxbuffer(50mMKC1，lOmMTris-HCl，pH8.6)'1.5mMMgCl2，0.4pM各通用引物，0.2mMdNTP，l.OUr呵酶，lplDNA模板，PCR程序為94。C3min;94°C15s，58。C20s，72°C15s，共35個循環，PCR產物經過1.5n/。瓊脂糖凝膠電泳分離后，割膠回收，最后通過電泳估算DNA含量。6.如權利要求1所述的食源性致病菌的檢測方法，其特征在于在步驟2)中，測序反應采用10|il體系，內含4piDTCSQuickStartMasterMix,1pi測序引物，0.54nlDNA模板，含量在58ng之間，雙蒸水補足10|d，反應程序為96°C20s，50°C20s，60°C4min，共30個循環，結束后在10nl反應體系中加入1pl3MNaAC，pH5.2，1^100mMEDTA，pH8.0，及0.5piGlycogen終止反應，然后通過乙醇沉淀、70%冰乙醇洗滌和室溫晾干步驟對測序產物進行純化，最后在每個樣品管中加入30^甲酰胺溶解產物，利用CEQ8000遺傳分析系統進行DNA測序。7.如權利要求1所述的食源性致病菌的檢測方法，其特征在于在步驟3)中，3對通用引物和熒光雙鏈置換探針的設計均通過ClustalX(1.8)、PrimerPremierv5.00、Oligov6.31和TmUtility化3軟件輔助完成；雙鏈置換探針配置如下標記熒光基團的長鏈和標記淬滅基團的短鏈，以0026()計算按1:1.2的比例混勻，避光保存。8.如權利要求1所述的食源性致病菌的檢測方法，其特征在于在步驟5)中，變溫雜交反應采用25pl反應體系，內含lxbuffer(67mMTris-HCl，16.6mM(NH4)2S04，85嗎/mLBSA，pH8.0)，2.0mMMgCl2，0.4探針和1.2雜交序列。反應程序為94°C3min;94°C10s，8540°C15s，每循環一次溫度下降rC，共46個循環；使用Rotor-Gene3000實時PCR儀在每次雜交時采集熒光數據。9.如權利要求1所述的食源性致病菌的檢測方法，其特征在于在步驟6)中，單重實時PCR體系的構建采用25pl反應體系，內含lxbuffer(67mMTris-HCl，16.6mM(NH4)2S04，85pg/mlBSA,pH8.0)，2.0mMMgCl2，0.4|uM引物，0.4|aM探針，0.2mMdNTP，1.0Ur叫酶，lplDNA模板；PCR程序為94°C3min;94°C15s，55°C20s，檢測FAM、HEX、ROX和CY5四種熒光信號，72°C15s，共40個循環。10.如權利要求1所述的食源性致病菌的檢測方法，其特征在于在步驟7)中，最終構建的多重多色實時PCR體系為25nl，內含lxbuffer(67mMTris-HCl，16.6mM(NH4)2S04，85pg/mLBSA，pH8.0)，3.0mMMgCl2，0.5B1陽F/R，0.3B2-F/R，0.4|aMB3-F/R,各個探針終濃度0.2nM-0.4nM不等，0.2mMdNTP，l.OUr叫酶，1piDNA模板,反應程序為94°C3min;94°C10s，45°C5s,檢測FAM、HEX、ROX和CY5四種熒光信號，55°C20s，72°C15s,40個循環。全文摘要食源性致病菌的檢測方法，涉及一種細菌的分子鑒定，尤其是涉及一種利用探針編碼檢測食源性致病菌的方法，它是通過單一反應對多個食源性致病菌進行鑒定的實時PCR方法。提供一種在四色實時PCR儀上可實現對15種模板的基因分型的食源性致病菌的檢測方法。將培養后的菌株標本提取DNA；通用引物的設計及PCR產物的測序；設計熒光雙鏈置換探針；設計多色探針編碼體系；變溫雜交反應；構建單重實時PCR體系；構建多重多色實時PCR體系；驗證多重多色實時PCR體系。文檔編號C12Q1/68GK101285090SQ20081007110公開日2008年10月15日申請日期2008年5月21日優先權日2008年5月21日發明者張佳峰,李慶閣,牛建軍,鄭琳琳,黃建煒申請人:廈門市疾病預防控制中心