三種食源性致病菌多重快速檢測法及檢測引物組和試劑盒的制作方法

專利名稱：三種食源性致病菌多重快速檢測法及檢測引物組和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬微生物檢測領域，涉及一種沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌三重快速檢測方法及其檢測引物組和檢測試劑盒。
背景技術：
食品安全是世界各國關注的重大問題，而其中食源性致病菌是影響食品安全的主要原因之一。沙門氏菌(Salmonella spp)是公共衛生領域的重要致病菌，據統計在世界各國發生的細菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首，我國內陸地區所發生的細菌性食物中毒中也以沙門氏菌為首要原因。除引發食物中毒外，該屬的細菌還可以導致胃腸炎、傷寒和副傷寒等疾病。金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus)隸屬于葡萄球菌屬，是人類化膿感染中最常見的病原菌，同時，金黃色葡萄球菌腸毒素是個世界性衛生難題，我國每年發生的此類中毒事件也非常多。單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一種具有耐熱(60°C)、耐低溫G°C)、耐鹽、耐干燥等性質的食源性致病菌，1986年，WHO和 FDA將其列為20世紀90年代食品四大致病菌之一 ；2000年，被WHO化列為重點監測的食源性致病菌之一。根據現行國家食品安全監管體系，沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌均屬重點關注的食源性致病菌。常規檢測采用傳統培養方法，且每個致病菌需應用獨立的檢測方法單獨進行檢測，工作量大，檢測周期長，且受到檢測人員專業、經驗等多種因素限制， 容易出現誤判。隨著分子生物學方法在食品微生物檢測中的逐步應用，致病菌的檢測效率也逐步提升。但目前所采用的普通PCR方法和熒光PCR方法雖可提高檢測效率，但對儀器設備要求較高，對檢測人員的專業背景和檢測能力也有一定要求，因此無法大范圍的推廣使用。LAMP方法是一種新型的恒溫核酸擴增技術，該技術主要利用4種不同的特異性引物識別靶DNA上6個特定區域，并利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(BstDNA)，在恒溫條件下快速擴增核酸，保證了擴增的高特異性和高效率。由于LAMP獨特的核酸擴增機制， 它的產物是由多重復靶序列的莖一環狀DNA和花椰菜狀DNA所組成的混合物，在瓊脂糖凝膠電泳上會呈現出LAMP反應典型的階梯狀條帶；同時，核酸大量生成時，從dNIPs中析出的焦磷酸根離子與反應體系中的Mg2+結合，產生肉眼可見的擴增反應副產物-白色焦磷酸鎂沉淀；另外，由于擴增產物大量生成，加入熒光染料(如Syber Green I、溴化乙錠、Gel Red 等)后，可在紫外燈下觀察到明顯熒光。因此LAMP擴增結果不但觀察方式多樣，且結果鑒定簡便，非常適合高通量的快速檢測。鑒于LAMP技術有眾多優勢，現已被逐漸應用于病原微生物的檢測。如分支桿菌屬、阪崎腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等。但目前已有的方法只能在一個系統中針對某一種致病菌進行檢測，在需要快速篩查多個致病菌時，需分別對其進行檢測，仍有較大工作量。多重恒溫核酸檢測技術能在同一反應體系中，同一反應條件下，實現多個目的菌的快速篩查，具有廣闊的應用前景。經國內外文獻查詢，尚未見有LAMP應用于沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌多重快速檢測的相關報道。

發明內容
本發明的目的是提供一種三種食源性致病菌多重快速檢測法及檢測引物組和試劑盒，從而克服目前已有的方法只能在一個系統中針對某一種致病菌進行檢測、而不能同時對同一系統中是否同時存在多種致病菌進行判斷的缺陷。為實現上述目的，本發明所采取的技術方案是本發明沙門氏菌的快速檢測引物組的外引物的上游引物具有如SEQ No. 1所示的序列，其外引物的下游引物具有如SEQ No. 2所示的序列；其內引物的上游引物具有如SEQ No. 3所示的序列，其內引物的下游引物具有如SEQ No. 4所示的序列。本發明金黃色葡萄球菌的快速檢測引物組的外引物的上游引物具有如SEQ No. 5 所示的序列，其外引物的下游引物具有如SEQ No. 6所示的序列；其內引物的上游引物具有如SEQNo. 7所示的序列，其內引物的下游引物具有如SEQ No. 8所示的序列。本發明單增李斯特菌的快速檢測引物組的外引物的上游引物具有如SEQ No. 9所示的序列，其外引物的下游引物具有如SEQ No. 10所示的序列；其內引物的上游引物具有如SEQNo. 11所示的序列，其內引物的下游引物具有如SEQ No. 12所示的序列。本發明使用檢測引物組對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌進行多重快速檢測的方法是將沙門氏菌的檢測引物組、金黃色葡萄球菌的檢測引物組和單增李斯特菌的檢測引物組與待測樣品的DNA進行LAMP反應，在反應結束后對反應液進行陰陽性判定，以確定所述樣品中是否含有沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌中的其中一種或幾種；在所述沙門氏菌的檢測引物組中，外引物的上游引物具有如SEQ No. 1所示的序列， 外引物的下游引物具有如SEQ No. 2所示的序列，內引物的上游引物具有如SEQ No. 3所示的序列，內引物的下游引物具有如SEQ No. 4所示的序列；在所述金黃色葡萄球菌的檢測引物組中，外引物的上游引物具有如SEQ No. 5所示的序列，外引物的下游引物具有如SEQ No. 6所示的序列，內引物的上游引物具有如SEQ No. 7所示的序列，內引物的下游引物具有如SEQ No. 8所示的序列；在所述單增李斯特菌的檢測引物組中，外引物的上游引物具有如 SEQNo. 9所示的序列，外引物的下游引物具有如SEQ No. 10所示的序列，內引物的上游引物具有如SEQ No. 11所示的序列，內引物的下游引物具有如SEQ No. 12所示的序列。進一步地，本發明所述LAMP反應按以下第一種方案或第二種方案進行第一種方案所述LAMP反應的反應溫度為59. 5-62. 5°C，反應時間為70_1 IOmin ；第二種方案所述LAMP反應包含以下步驟(1)先在 59. 5-62. 5°C下反應 70_110min ；(2)后在 80°C下反應 6_12min。進一步地，本發明在進行所述LAMP反應的反應液中，所述沙門氏菌的檢測引物組中的外引物的上游引物和下游引物的濃度均為0. 001-0. 003 μ M，內引物的上游引物和下游引物的濃度均為0. 35-0. 45 μ M ；所述金黃色葡萄球菌的檢測引物組中的外引物的上游引物和下游引物的濃度均為0. 001-0. 003 μ Μ，內引物的上游引物和下游引物的濃度均為 0. 25-0. 35 μ M ；所述單增李斯特菌的檢測引物組中的外引物的上游引物和下游引物的濃度均為0. 001-0. 003 μ Μ,內引物的上游引物和下游引物的濃度均為0. 25-0. 35 μ M ；并且，進行所述LAMP反應的反應液中還包含有濃度為0. 6-0. 7M的甜菜堿、濃度為4. 4-5. 2mM的 MgSO4UO% (體積)的10 XBstDNA聚合酶緩沖液、濃度為0. 4-0. 6U/μ L的BstDNA聚合酶、 以及濃度各為0. 6-1. OmM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸。本發明的一種快速檢測試劑盒包括沙門氏菌的檢測引物組、金黃色葡萄球菌的檢測引物組、單增李斯特菌的檢測引物組、三種陽性對照品、BstDNA聚合酶、IOXBstDNA聚合酶緩沖液、MgSO4溶液、甜菜堿溶液、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、 三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸和無菌超純水；所述沙門氏菌的檢測引物組中的外引物的上游引物具有如SEQ No. 1所示的序列，外引物的下游引物具有如 SEQ No. 2所示的序列，內引物的上游引物具有如SEQ No. 3所示的序列，內引物的下游引物具有如SEQ No. 4所示的序列；所述金黃色葡萄球菌的檢測引物組中的外引物的上游引物具有如SEQ No. 5所示的序列，外引物的下游引物具有如SEQ No. 6所示的序列，內引物的上游引物具有如SEQ No. 7所示的序列，內引物的下游引物具有如SEQ No. 8所示的序列；所述單增李斯特菌的檢測引物組中的外引物的上游引物具有如SEQ No. 9所示的序列，外引物的下游引物具有如SEQ No. 10所示的序列，內引物的上游引物具有如SEQ No. 11所示的序列， 內引物的下游引物具有如SEQ No. 12所示的序列；所述三種陽性對照品分別為沙門氏菌、 金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的標準菌株的基因組DNA。本發明的另一種快速檢測試劑盒包含2XLAMP預混液和三種陽性對照品，所述三種陽性對照品分別為沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的標準菌株的基因組DNA， 在所述2XLAMP預混液中包含有沙門氏菌的檢測引物組、金黃色葡萄球菌的檢測引物組、 單增李斯特菌的檢測引物組、濃度為1. 2-1. 4Μ的甜菜堿、濃度為0. 8-1. 2U/y L的BstDNA 聚合酶、2 XBstDNA聚合酶緩沖液、濃度為8. 8-10. 4mM的MgSO4溶液、無菌超純水、以及濃度各為1. 2-2. OmM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸；所述沙門氏菌的檢測引物組中的外引物的上游引物具有如SEQ No. 1所示的序列，外引物的下游引物具有如SEQ No. 2所示的序列，內引物的上游引物具有如SEQ No. 3所示的序列，內引物的下游引物具有如SEQ No.4所示的序列； 所述金黃色葡萄球菌的檢測引物組中的外引物的上游引物具有如SEQ No. 5所示的序列，外引物的下游引物具有如SEQ No. 6所示的序列，內引物的上游引物具有如SEQ No. 7所示的序列，內引物的下游引物具有如SEQ No. 8所示的序列；所述單增李斯特菌的檢測引物組中的外引物的上游引物具有如SEQ No.9所示的序列，外引物的下游引物具有如SEQ No. 10所示的序列，內引物的上游引物具有如SEQ No. 11所示的序列，內引物的下游引物具有如SEQ No. 12所示的序列；所述沙門氏菌的檢測引物組中的外引物的上游引物和下游引物的濃度均為0. 002-0. 006 μ Μ,內引物的上游引物和下游引物的濃度均為0. 7-0. 9 μ M ；所述金黃色葡萄球菌的檢測引物組中的外引物的上游引物和下游引物的濃度均為0. 002-0. 006 μ Μ,內引物的上游引物和下游引物的濃度均為0. 5-0. 7 μ M ；所述單增李斯特菌的檢測引物組中的外引物的上游引物和下游引物的濃度均為0. 002-0. 006 μ Μ,內引物的上游引物和下游引物的濃度均為0. 5-0. 7 μ M0與現有技術相比，本發明的有益效果是(1)本發明是根據已公開的沙門氏菌侵襲蛋白A(invA)基因序列、金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶(nuc)基因序列、單增李斯特菌溶血素蛋白(hly)基因序列，分析設計得到本發明的三重LAMP檢測引物組。本發明的三重LAMP檢測引物組特異性強，同一所檢樣品的增菌液的DNA提取液中只要含有沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌這三種致病菌的基因組DNA，即能同時準確檢測出來。(2)利用本發明的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的快速檢測引物組， 能在同一反應體系中和同一反應溫度條件下，實現同時對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的快速檢測，同一所檢樣品的增菌液的DNA提取液中只要含有沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌基因組DNA中的一種或幾種，即可快速、準確判斷地檢測出來， 從而克服現有技術只能在一個系統中針對某一種致病菌進行檢測、而不能同時對同一系統中是否同時存在多種致病菌進行判斷的缺陷，大大提高檢測效率。(3)本發明的快速檢測方法由于利用本發明的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的快速檢測引物組，并對LAMP反應體系和反應條件進行優化，因而能快速高效擴增沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的基因組DNA目的片段，整個LAMP擴增過程最快可在70分鐘內完成，擴增產物得率高，對上述三種致病菌的檢測簡便、準確。(4)在本發明的快速檢測方法中，LAMP擴增反應可在恒定溫度下完成，且允許的溫度波動范圍較大(士 1.5°C )，因此對溫控的儀器設備要求不高，水浴器或板式加熱器均可滿足要求。(5)本發明的快速檢測方法靈敏度高，沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的陽性擴增結果均僅需Ifg/ μ L目的菌基因組DNA。(6)本發明的快速檢測方法對檢測結果的判定方法對實驗室的實際條件的要求低、適應性較強，且判定方法簡便，可采用觀察電泳條帶、觀察離心沉淀或觀察熒光等不同方式判定結果。(7)與常規的平板培養法相比，本發明的快速檢測方法可大大縮短檢測周期，減少檢測環節，從而降低因檢測環節過多或人員技術水平和經驗的差異造成的誤判的幾率，使檢測結果更為準確可靠，并可為食品安全突發事件的處置提供重要的技術支持。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明做進一步闡述，但并不對本發明做任何限定。實施例1 對本發明三重LAMP快速檢測方法的LAMP反應體系中的最佳Mg2+濃度的確定。本實施例的具體確定方法為1.樣品DNA的提取11將沙門氏菌和金黃色葡萄球菌標準菌株各自分別接種于營養肉湯，單增李斯特菌接種于腦心浸液肉湯，36°C 士 1°C培養18小時。1.2應用QIAGEN細菌基因組DNA提取試劑盒分別提取上述培養產物中的細菌 DNA。2. LAMP 反應2. 1分別人工合成用于沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌檢測的引物組。 其中，用于沙門氏菌檢測的引物組中的外引物的上游引物具有如SEQ No. 1所示的序列，外引物的下游引物具有如SEQ No. 2所示的序列，內引物的上游引物具有如SEQ No. 3所示的序列，內引物的下游引物具有如SEQ No. 4所示的序列；用于金黃色葡萄球菌檢測的引物組中的外引物的上游引物具有如SEQ No. 5所示的序列，外引物的下游引物具有如SEQ No. 6 所示的序列，內引物的上游引物具有如SEQ No. 7所示的序列，內引物的下游引物具有如 SEQ No. 8所示的序列；用于單增李斯特菌檢測的引物組中的外引物的上游引物具有如SEQ No. 9所示的序列，外引物的下游引物具有如SEQ No. 10所示的序列，內引物的上游引物具有如SEQNo. 11所示的序列，內引物的下游引物具有如SEQ No. 12所示的序列。2. 2LAMP 反應體系2. 2. 1沙門氏菌的LAMP反應體系應用不同的Mg2+濃度分別建立7組沙門氏菌的LAMP反應體系，具體如下各組反應體系的體積為25 μ L，分別包括本實施例2. 1部分所合成的濃度均為 0. 002 μ M的沙門氏菌檢測的外引物的上游引物和下游引物、濃度為0.4μ M的沙門氏菌檢測的內引物的上游引物和下游引物、濃度均為0. 002 μ M的金黃色葡萄球菌檢測的外引物的上游引物和下游引物、濃度為0. 3 μ M的金黃色葡萄球菌檢測的內引物的上游引物和下游引物、濃度均為0. 002 μ M的單增李斯特菌檢測的外引物的上游引物和下游引物、濃度為0. 3μ M的單增李斯特菌檢測的內引物的上游引物和下游引物，濃度為0. 65Μ的甜菜堿， 10% (體積)的IOXBstDNA聚合酶緩沖液，濃度為0.5U/y L的BstDNA聚合酶，濃度各為 0. SmM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸(dCTP)，沙門氏菌基因組DNA模板IyL; 并且在以上7組LAMP反應體系中，MgSO4濃度分別為3. 6mM、4. 0mM、4. 4mM、4. 8mM、5. 2mM、 5. 6mM、6. OmM ；以上各組反應體系的剩余體積以無菌超純水補充。2. 2. 2金黃色葡萄球菌的LAMP反應體系應用不同的Mg2+濃度分別建立7組金黃色葡萄球菌的LAMP反應體系，具體如下各組反應體系的體積為25 μ L，分別包括本實施例2. 1部分所合成的濃度均為 0. 002 μ M的沙門氏菌檢測的外引物的上游引物和下游引物、濃度為0.4μ M的所述沙門氏菌檢測的內引物的上游引物和下游引物、濃度均為0. 002 μ M的金黃色葡萄球菌檢測的外引物的上游引物和下游引物、濃度為0.3μ M的金黃色葡萄球菌檢測的內引物的上游引物和下游引物，濃度均為0. 002 μ M的單增李斯特菌檢測的外引物的上游引物和下游引物、濃度為0. 3μ M的單增李斯特菌檢測的內引物的上游引物和下游引物，濃度為0. 65Μ的甜菜堿，10% (體積)的10XBstDNA聚合酶緩沖液，濃度為0.5U/y L的BstDNA聚合酶，濃度各為0. SmM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸(dCTP)，金黃色葡萄球菌基因組DNA 模板ι μ L ；并且在以上7組LAMP反應體系中，MgSO4的濃度分別采用3. 6mM、4. 0mM、4. 4mM、 4. 8mM、5. 2mM、5. 6mM、6. OmM ；以上各組反應體系的剩余體積以無菌超純水補充。2. 2. 3單增李斯特菌的LAMP反應體系分別應用不同的Mg2+濃度分別建立7組金黃色葡萄球菌LAMP反應體系，具體如下各組反應體系的體積為25 μ L，分別包括本實施例2. 1部分所合成的濃度均為 0. 002 μ M的所述沙門氏菌檢測的外引物的上游引物和下游引物、濃度為0. 4μ M的沙門氏菌檢測的內引物的上游引物和下游引物、濃度均為0. 002 μ M的金黃色葡萄球菌檢測的外引物的上游引物和下游引物、濃度為0.3μΜ的金黃色葡萄球菌檢測的內引物的上游引物和下游引物，濃度均為0. 002 μ M的單增李斯特菌檢測的外引物的上游引物和下游引物、濃度為0. 3μ M的單增李斯特菌檢測的內引物的上游引物和下游引物，濃度為0. 65Μ的甜菜堿，10% (體積)的IOXBstDNA聚合酶緩沖液，濃度為0.5U/y L的BstDNA聚合酶，濃度各為0. SmM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸(dCTP)，單增李斯特菌基因組DNA 模板ι μ L ；并且在以上7組LAMP反應體系中，MgSO4的濃度分別為3. 6mM、4. 0mM、4. 4mM、 4. 8mM、5. 2mM、5. 6mM、6. OmM ；以上各反應體系的剩余體積以無菌超純水補充。2. 3LAMP 反應條件應用恒溫水浴器，反應條件為先在61°C下反應90min ；后在80°C下反應6min。2. 4結果觀察將以上沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的各組LAMP反應體系的反應液分別直接進行瓊脂糖凝膠電泳30min，電泳條件為0. 5XTBE、2. 0%瓊脂糖凝膠、150V電壓，自動凝膠成像系統下成像觀察結果。其中，沙門氏菌擴增時，當Mg2+濃度在4.0-5. 6mM 區間時，呈現出明亮的梯狀電泳條帶；金黃色葡萄球菌擴增時，當Mg2+濃度在4. 4-5. 6mM區間時，呈現出明亮的梯狀電泳條帶；單增李斯特菌擴增時，當Mg2+濃度在4. 0-5. 2mM區間時， 呈現出明亮的梯狀電泳條帶。根據以上電泳觀察結果，綜合考慮在對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌這三種目標菌進行檢測過程中呈現明亮的梯狀電泳條帶時的Mg2+濃度范圍，確定本發明三重檢測方法的LAMP反應體系中的最佳Mg2+濃度為4. 4-5. 2mM。實施例2 本發明三重LAMP快速檢測方法的最佳LAMP反應溫度的確定。本實施例的具體確定步驟如下1.樣品DNA的提取1. 1將沙門氏菌和金黃色葡萄球菌標準菌株各自分別接種于營養肉湯，單增李斯特菌接種于腦心浸液肉湯，36°C 士 1°C培養18小時。1. 2應用QIAGEN細菌基因組DNA提取試劑盒分別提取以上培養產物中的細菌 DNA。2. LAMP 反應2. 1分別人工合成用于沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌檢測的引物組， 各引物組引物及其序列與實施例1中的2. 1部分所述一致。2. 2LAMP 反應體系2. 2. 1沙門氏菌的LAMP反應體系應用不同的反應溫度分別建立6組沙門氏菌LAMP反應體系，具體如下各組反應體系的體積為25 μ L，分別包括本實施例2. 1部分所合成的濃度均為 0. 002 μ M的沙門氏菌檢測的外引物的上游引物和下游引物、濃度為0.4μ M的沙門氏菌檢測的內引物的上游引物和下游引物、濃度均為0. 002 μ M的金黃色葡萄球菌檢測的外引物的上游引物和下游引物、濃度為0. 3 μ M的金黃色葡萄球菌檢測的內引物的上游引物和下游引物，濃度均為0. 002 μ M的單增李斯特菌檢測的外引物的上游引物和下游引物、濃度為0. 3μ M的單增李斯特菌檢測的內引物的上游引物和下游引物，濃度為0. 65Μ的甜菜堿，10% (體積)的IOXBstDNA聚合酶緩沖液，濃度為0. 5U/μ L的BstDNA聚合酶，濃度各為 0. SmM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸(dCTP)，濃度為4. SmM的MgSO4,沙門氏菌基因組DNA模板1 μ L，以上各組反應體系的剩余體積以無菌超純水補充。2. 2. 2金黃色葡萄球菌的LAMP反應體系應用不同的反應溫度分別建立6組金黃色葡萄球菌的LAMP反應體系，具體如下各組反應體系體積為25 μ L，分別包括本實施例2. 1部分所合成的濃度均為 0. 002 μ M的沙門氏菌檢測的外引物的上游引物和下游引物、濃度為0.4μ M的沙門氏菌檢測的內引物的上游引物和下游引物、濃度均為0. 002 μ M的金黃色葡萄球菌檢測的外引物的上游引物和下游引物、濃度為0.3μ M的金黃色葡萄球菌檢測的內引物的上游引物和下游引物，濃度均為0. 002 μ M的單增李斯特菌檢測的外引物的上游引物和下游引物、濃度為0. 3μ M的單增李斯特菌檢測的內引物的上游引物和下游引物，濃度為0. 65Μ的甜菜堿， 10% (體積)的IOXBstDNA聚合酶緩沖液，濃度為0. 5U/ μ L的BstDNA聚合酶，濃度各為 0. SmM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸(dCTP)，濃度為4. SmM的MgSO4,金黃色葡萄球菌基因組DNA模板1 μ L，以上各組反應體系的剩余體積以無菌超純水補充。2. 2. 3單增李斯特菌的LAMP反應體系應用不同的反應溫度分別建立6組金黃色葡萄球菌LAMP反應體系，具體如下各組反應體系體積為25 μ L，分別包括本實施例2. 1部分所合成的濃度均為 0. 002 μ M的所述沙門氏菌檢測的外引物的上游引物和下游引物、濃度為0. 4μ M的沙門氏菌檢測的內引物的上游引物和下游引物、濃度均為0. 002 μ M的金黃色葡萄球菌檢測的外引物的上游引物和下游引物、濃度為0.3μΜ的金黃色葡萄球菌檢測的內引物的上游引物和下游引物，濃度均為0. 002 μ M的單增李斯特菌檢測的外引物的上游引物和下游引物、濃度為0. 3μ M的單增李斯特菌檢測的內引物的上游引物和下游引物，濃度為0. 65Μ的甜菜堿，10% (體積)的10XBstDNA聚合酶緩沖液，濃度為0.5U/y L的BstDNA聚合酶，濃度各為0. SmM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸(dCTP)，濃度為4. SmM的MgSO4,單增李斯特菌基因組DNA模板IyL;以上各組反應體系的剩余體積以無菌超純水補充。2. 3LAMP 反應條件應用恒溫水浴器，將本實施例的2. 2部分中所述6組沙門氏菌LAMP反應體系、6組金黃色葡萄球菌LAMP反應體系、6組單增李斯特菌LAMP反應體系各自先在6種不同溫度下分別進行反應，所采用的溫度分別為58. 50C >59. 5°C、61°C、62. 5°C >63. 5°C >64. 5°C，反應時間為90min ；后再分別在80°C下反應6min。2. 4結果觀察將以上沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的各組LAMP反應體系的反應液直接進行瓊脂糖凝膠電泳30min，電泳條件為0. 5XTBE、2. 0%瓊脂糖凝膠、150V電壓， 自動凝膠成像系統下成像觀察結果。其中，沙門氏菌擴增時，當反應溫度在59. 5-63. 5°C區間時，呈現明亮的梯狀電泳條帶；金黃色葡萄球菌擴增時，當反應溫度在59. 5-63. 5°C區間時，呈現明亮的梯狀電泳條帶；單增李斯特菌擴增時，當反應溫度在59. 5-62. 5°C區間時，呈現明亮的梯狀電泳條帶。根據以上電泳觀察結果，綜合考慮在對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌這三種目標菌進行檢測過程中呈現明亮的梯狀電泳條帶時的溫度范圍， 確定本發明三重檢測體系的最佳LAMP反應溫度為59. 5-62. 5°C。實施例3 本發明三重LAMP快速檢測方法對沙門氏菌的檢測靈敏度。本實施例的具體檢測方法為1.樣品DNA的提取1. 1將沙門氏菌標準菌株接種于營養肉湯，36°C 士 1°C培養18小時。1. 2應用QIAGEN細菌基因組DNA提取試劑盒提取以上培養產物中細菌DNA。2. LAMP 反應2. 1分別人工合成用于沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌檢測的引物組， 各引物組引物及其序列與實施例1中的2. 1部分所述一致。2. 2LAMP的反應體系建立9個反應管，各反應管中反應體系的總體積為25 μ L，分別包括本實施例 2. 1部分所合成的濃度均為0. 002 μ M的沙門氏菌檢測的外引物的上游引物和下游引物、濃度為0. 4μ M的沙門氏菌檢測的內引物的上游引物和下游引物、濃度均為0. 002 μ M的金黃色葡萄球菌檢測的外引物的上游引物和下游引物、濃度為0. 3μ M的金黃色葡萄球菌檢測的內引物的上游引物和下游引物，濃度均為0. 002 μ M的單增李斯特菌檢測的外引物的上游引物和下游引物、濃度為0. 3μΜ的單增李斯特菌檢測的內引物的上游引物和下游引物， 濃度為0. 65Μ的甜菜堿，10% (體積)的IOXBstDNA聚合酶緩沖液，濃度為0. 5U/μ L的 BstDNA聚合酶，濃度各為0. SmM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸(dCTP)，濃度為4. SmM的MgSO4 ；各反應管還需分別加入沙門氏菌基因組DNA模板液1 μ L，各個反應管內所用 DNA 模板液的濃度分別為 IOng/ μ L、lng/ μ L、IOOpg/ μ L、IOpg/ μ L、lpg/ μ L、IOOfg/ μ LUOfg/μ LUfg/μ L、0. lfg/μ L，以測試該檢測方法對沙門氏菌的檢測靈敏度；以上各反應體系的剩余體積以無菌超純水補充。2. 3LAMP 反應條件應用恒溫水浴器，先在61°C下反應90min，后在80°C下反應6min。2. 4結果觀察將以上各個反應管內的反應液直接進行瓊脂糖凝膠電泳30min，電泳條件為 0. 5XTBE、2. 0%瓊脂糖凝膠、150V電壓，自動凝膠成像系統下成像觀察結果。通過對各個反應管內反應產物的電泳分析，發現當模板DNA液的濃度為IOng/ μ LUng/μ LUOOpg/μ LUOpg/μ LUpg/μ LUOOfg/μ LUOfg/μ L 時，均可擴增出較為明亮的梯狀電泳條帶，而當模板DNA液的濃度降至lfg/μ L時，則不能擴增出梯狀電泳條帶， 說明本發明方法對沙門氏菌DNA的檢測靈敏度為IOfg/ μ L0實施例4 本發明三重LAMP快速檢測方法對金黃色葡萄球菌的檢測靈敏度。本實施例的具體檢測方法為1.樣品DNA的提取1. 1將金黃色葡萄球菌標準菌株接種于營養肉湯，36°C 士 1°C培養18小時。1. 2應用QIAGEN細菌基因組DNA提取試劑盒提取以上培養產物中細菌DNA。
2. LAMP 反應2. 1分別人工合成用于沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌檢測的引物組， 各引物組引物及其序列與實施例1中的2. 1部分所述一致。2. 2LAMP 反應體系建立9個反應管，各反應管反應體系總體積為25 μ L，分別包括本實施例2. 1部分所合成的濃度均為0. 002 μ M的沙門氏菌檢測的外引物的上游引物和下游引物、濃度為 0.4μ M的沙門氏菌檢測的內引物的上游引物和下游引物、濃度均為0. 002 μ M的金黃色葡萄球菌檢測的外引物的上游引物和下游引物、濃度為0. 3μ M的金黃色葡萄球菌檢測的內引物的上游引物和下游引物，濃度均為0. 002 μ M的單增李斯特菌檢測的外引物的上游引物和下游引物、濃度為0. 3μ M的所述單增李斯特菌檢測的內引物的上游引物和下游引物， 濃度為0.65Μ的甜菜堿，10% (體積)的IOXBstDNA聚合酶緩沖液，濃度為0.5υ/μ L的 BstDNA聚合酶，濃度各為0. SmM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸(dCTP)，濃度為4. SmM的MgSO4 ；各反應管還需加入金黃色葡萄球菌基因組DNA模板液1 μ L，各個反應管內所用 DNA 模板液濃度分別為 IOng/ μ L、lng/ μ L、IOOpg/ μ L、IOpg/ μ L、lpg/ μ L、IOOfg/ μ LUOfg/μ LUfg/μ L、0. lfg/μ L，以測試該檢測方法對金黃色葡萄球菌的檢測靈敏度； 以上各反應體系的剩余體積以無菌超純水補充。2. 3LAMP 反應條件應用恒溫水浴器，先在61°C下反應90min，后在80°C下反應6min。2. 4結果觀察將以上各個反應管內的反應液直接進行瓊脂糖凝膠電泳30min，電泳條件為 0. 5XTBE、2. 0%瓊脂糖凝膠、150V電壓，自動凝膠成像系統下成像觀察結果。通過對各個反應管內的反應產物的電泳分析，發現當模板DNA液的濃度為IOng/ μ LUng/μ LUOOpg/μ LUOpg/μ LUpg/μ LUOOfg/μ LUOfg/μ L 時，均可擴增出較為明亮的梯狀電泳條帶，而當模板DNA液的濃度降至Ifg/μ L時，則不能擴增出梯狀電泳條帶。 說明本方法對金黃色葡萄球菌DNA的檢測靈敏度為IOfg/μ L。實施例5 本發明三重LAMP快速檢測方法對單增李斯特菌的檢測靈敏度。本實施例的具體檢測方法為1.樣品DNA的提取1. 1將單增李斯特菌標準菌株接種于腦心浸液肉湯，36°C 士 1°C培養18小時。1. 2應用QIAGEN細菌基因組DNA提取試劑盒提取以上培養產物中的細菌DNA。2. LAMP 反應2. 1分別人工合成用于沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌檢測的引物組， 各引物組引物及其序列與實施例1中的2. 1部分所述一致。2. 2LAMP 反應體系建立9個反應管，各個反應管的反應體系總體積為25yL，分別包括本實施例2. 1 部分所合成的濃度均為0. 002 μ M的所述沙門氏菌檢測的外引物的上游引物和下游引物、 濃度為0.4μ M的沙門氏菌檢測的內引物的上游引物和下游引物、濃度均為0. 002 μ M的金黃色葡萄球菌檢測的外引物的上游引物和下游引物、濃度為0. 3μ M的金黃色葡萄球菌檢測的內引物的上游引物和下游引物，濃度均為0. 002 μ M的單增李斯特菌檢測的外引物的上游引物和下游引物、濃度為0.3μΜ的單增李斯特菌檢測的內引物的上游引物和下游引物，濃度為0. 65Μ的甜菜堿，10% (體積)的IOXBstDNA聚合酶緩沖液，濃度為0. 5U/μ L 的BstDNA聚合酶，濃度各為0. SmM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸(dCTP)，濃度為4. SmM的MgSO4 ；此外，各反應管還需加入單增李斯特菌基因組DNA模板液1 μ L，各個反應管內所用DNA模板液的濃度分別為IOng/ μ L、lng/ μ L、IOOpg/ μ L、IOpg/ μ L、lpg/ μ L、 lOOfg/μ LUOfg/μ LUfg/μ L、0. lfg/μ L，以測試本發明檢測方法對單增李斯特菌的檢測靈敏度；以上各個反應管的反應體系的剩余體積以無菌超純水補充。2. 3LAMP 反應條件應用恒溫水浴器，反應條件為先在61°C下反應90min，后在80°C下反應為6min。2. 4結果觀察將以上各個反應管的反應液直接進行瓊脂糖凝膠電泳30min，電泳條件為 0. 5XTBE、2. 0%瓊脂糖凝膠、150V電壓，自動凝膠成像系統下成像觀察結果。通過對各個反應管的反應產物的電泳分析，發現當模板DNA液的濃度為IOng/ μ LUng/μ LUOOpg/μ LUOpg/μ LUpg/μ LUOOfg/μ LUOfg/μ L 時，均可擴增出較為明亮的梯狀電泳條帶，而當模板DNA液的濃度降至Ifg/μ L時，則不能擴增出梯狀電泳條帶， 說明本發明方法對單增李斯特菌DNA的檢測靈敏度為IOfg/μ L。實施例6 本發明三重LAMP快速檢測方法的特異性、準確性分析本實施例具體檢測方法為1.樣品DNA的提取1. 1將沙門氏菌和金黃色葡萄球菌標準菌株分別接種于營養肉湯，單增李斯特菌接種于腦心浸液肉湯，36°C 士 1°C培養18小時。1. 2應用QIAGEN細菌基因組DNA提取試劑盒分別提取以上培養產物中細菌DNA。1.3將三組DNA提取液按等體積比例混合，作為最終LAMP檢測模板。2. LAMP 反應2. 1分別人工合成用于沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌檢測的引物組， 各引物組引物及其序列與實施例1中的2. 1部分所述一致。用于對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的三重LAMP產物進行PCR測序的引物詳見表1。表1.沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌三重LAMP產物測序引物
權利要求
1.一種沙門氏菌的快速檢測引物組，其特征是其外引物的上游引物具有如SEQ No. 1 所示的序列，其外引物的下游引物具有如SEQ No. 2所示的序列；其內引物的上游引物具有如SEQ No. 3所示的序列，其內引物的下游引物具有如SEQ No. 4所示的序列。
2.一種金黃色葡萄球菌的快速檢測引物組，其特征是其外引物的上游引物具有如 SEQ No.5所示的序列，其外引物的下游引物具有如SEQ No.6所示的序列；其內引物的上游引物具有如SEQ No. 7所示的序列，其內引物的下游引物具有如SEQ No. 8所示的序列。
3.一種單增李斯特菌的快速檢測引物組，其特征是其外引物的上游引物具有如SEQ No. 9所示的序列，其外引物的下游引物具有如SEQ No. 10所示的序列；其內引物的上游引物具有如SEQ No. 11所示的序列，其內引物的下游引物具有如SEQ No. 12所示的序列。
4.一種使用檢測引物組對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌進行多重快速檢測的方法，其特征是將沙門氏菌的檢測引物組、金黃色葡萄球菌的檢測引物組和單增李斯特菌的檢測引物組與待測樣品的DNA進行LAMP反應，在反應結束后對反應液進行陰陽性判定，以確定所述樣品中是否含有沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌中的其中一種或幾種；在所述沙門氏菌的檢測引物組中，外引物的上游引物具有如SEQ No. 1所示的序列，外引物的下游引物具有如SEQ No. 2所示的序列，內引物的上游引物具有如SEQ No. 3所示的序列，內引物的下游引物具有如SEQ No. 4所示的序列；在所述金黃色葡萄球菌的檢測引物組中，外引物的上游引物具有如SEQ No. 5所示的序列，外引物的下游引物具有如SEQ No. 6所示的序列，內引物的上游引物具有如SEQ No. 7所示的序列，內引物的下游引物具有如SEQ No. 8所示的序列；在所述單增李斯特菌的檢測引物組中，外引物的上游引物具有如 SEQ No. 9所示的序列，外引物的下游引物具有如SEQ No. 10所示的序列，內引物的上游引物具有如SEQ No. 11所示的序列，內引物的下游引物具有如SEQ No. 12所示的序列。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征是所述LAMP反應按以下第一種方案或第二種方案進行第一種方案所述LAMP反應的反應溫度為59. 5-62. 5°C，反應時間為70_1 IOmin ；第二種方案所述LAMP反應包含以下步驟(1)先在59. 5-62. 5°C下反應 70-1 IOmin ；(2)后在80°C下反應6-12min。
6.根據權利要求4或5所述的方法，其特征是在進行所述LAMP反應的反應液中，所述沙門氏菌的檢測引物組中的外引物的上游引物和下游引物的濃度均為0. 001-0. 003 μ M, 內引物的上游引物和下游引物的濃度均為0. 35-0. 45 μ M ；所述金黃色葡萄球菌的檢測引物組中的外引物的上游引物和下游引物的濃度均為0. 001-0. 003 μ Μ,內引物的上游引物和下游引物的濃度均為0. 25-0. 35 μ M ；所述單增李斯特菌的檢測引物組中的外引物的上游引物和下游引物的濃度均為0. 001-0. 003 μ Μ，內引物的上游引物和下游引物的濃度均為 0. 25-0. 35 μ M ；并且，進行所述LAMP反應的反應液中還包含有濃度為0. 6-0. 7 M的甜菜堿、 濃度為4. 4-5. 2mM的MgSO4UO % (體積)的IOXfeiDNA聚合酶緩沖液、濃度為0. 4-0. 6U/ μ L的feiDNA聚合酶、以及濃度各為0. 6-1. OmM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸。
7.一種快速檢測試劑盒，其特征在于包括沙門氏菌的檢測引物組、金黃色葡萄球菌的檢測引物組、單增李斯特菌的檢測引物組、三種陽性對照品、feiDNA聚合酶、IOXfeiDNA聚合酶緩沖液、MgSO4溶液、甜菜堿溶液、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸和無菌超純水；所述沙門氏菌的檢測引物組中的外引物的上游引物具有如SEQ No. 1所示的序列，外引物的下游引物具有如 SEQ No. 2所示的序列，內引物的上游引物具有如SEQ No. 3所示的序列，內引物的下游引物具有如SEQ No. 4所示的序列；所述金黃色葡萄球菌的檢測引物組中的外引物的上游引物具有如SEQ No. 5所示的序列，外引物的下游引物具有如SEQ No. 6所示的序列，內引物的上游引物具有如SEQ No. 7所示的序列，內引物的下游引物具有如SEQ No. 8所示的序列；所述單增李斯特菌的檢測引物組中的外引物的上游引物具有如SEQ No. 9所示的序列，外引物的下游引物具有如SEQ No. 10所示的序列，內引物的上游引物具有如SEQ No. 11所示的序列， 內引物的下游引物具有如SEQ No. 12所示的序列；所述三種陽性對照品分別為沙門氏菌、 金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的標準菌株的基因組DNA。
8. 一種快速檢測試劑盒，其特征在于包含2XLAMP預混液和三種陽性對照品，所述三種陽性對照品分別為沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的標準菌株的基因組DNA， 在所述2XLAMP預混液中包含有沙門氏菌的檢測引物組、金黃色葡萄球菌的檢測引物組、 單增李斯特菌的檢測引物組、濃度為1. 2-1. 4 M的甜菜堿、濃度為0. 8-1. 2U/y L的feiDNA 聚合酶、2XfeiDNA聚合酶緩沖液、濃度為8. 8-10. 4mM的MgSO4溶液、無菌超純水、以及濃度各為1. 2-2. OmM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸；所述沙門氏菌的檢測引物組中的外引物的上游引物具有如SEQ No. 1所示的序列，外引物的下游引物具有如SEQ No. 2所示的序列，內引物的上游引物具有如SEQ No. 3所示的序列，內引物的下游引物具有如SEQ No.4所示的序列； 所述金黃色葡萄球菌的檢測引物組中的外引物的上游引物具有如SEQ No. 5所示的序列，外引物的下游引物具有如SEQ No. 6所示的序列，內引物的上游引物具有如SEQ No. 7所示的序列，內引物的下游引物具有如SEQ No. 8所示的序列；所述單增李斯特菌的檢測引物組中的外引物的上游引物具有如SEQ No.9所示的序列，外引物的下游引物具有如SEQ No. 10所示的序列，內引物的上游引物具有如SEQ No. 11所示的序列，內引物的下游引物具有如SEQ No. 12所示的序列；所述沙門氏菌的檢測引物組中的外引物的上游引物和下游引物的濃度均為0. 002-0. 006 μ Μ,內引物的上游引物和下游引物的濃度均為0. 7-0. 9 μ M ；所述金黃色葡萄球菌的檢測引物組中的外引物的上游引物和下游引物的濃度均為0. 002-0. 006 μ Μ,內引物的上游引物和下游引物的濃度均為0. 5-0. 7 μ M ；所述單增李斯特菌的檢測引物組中的外引物的上游引物和下游引物的濃度均為0. 002-0. 006 μ Μ,內引物的上游引物和下游引物的濃度均為0. 5-0. 7 μ M0
全文摘要
本發明公開一種三種食源性致病菌多重快速檢測法及檢測引物組和試劑盒。其中，沙門氏菌的快速檢測引物組的外引物的上游和下游引物及內引物的上游和下游引物相應地具有如SEQNo.1、SEQNo.2、SEQNo.3和SEQNo.4所示序列；金黃色葡萄球菌的快速檢測引物組的外引物的上游和下游引物及內引物的上游和下游引物相應地具有如SEQNo.5、SEQNo.6、SEQNo.7和SEQNo.8所示序列；單增李斯特菌的快速檢測引物組的外引物的上游和下游引物及內引物的上游和下游引物相應地具有如SEQNo.9、SEQNo.10、SEQNo.11和SEQNo.12所示的序列。本發明克服現有技術不能同時判斷同一系統中是否同時存在多種致病菌的缺陷，能夠快速準確地檢測出同一所檢樣品中是否含有沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌中的一種或幾種。
文檔編號C12N15/11GK102329882SQ201110314039
公開日2012年1月25日 申請日期2011年10月15日 優先權日2011年10月15日
發明者姜侃, 張東雷, 汪新, 金燕飛, 陳小珍, 黃建鋒 申請人:浙江省質量技術監督檢測研究院