專利名稱：：運用復合熒光pcr技術檢測食源性致病弧菌的方法
技術領域：
：本發明涉及細菌檢驗技術，具體地說是運用熒光PCR反應來檢測致病弧菌，特別是食源性致病弧菌的技術。
背景技術：
：食品中常見的致病菌是引起食物中毒的主要原因之一，可導致多種疾病發生，嚴重威脅著人們的健康，其中弧菌是危害較為嚴重的食源菌。快速、準確的檢測食品中的致病菌是有效預防和控制病原菌感染的前提條件。隨著分子生物學的發展，食品檢驗檢疫工作中的細菌鑒定方法已經從傳統的簡單生化實驗水平上向分子生物學的方法如PCR、探針雜交等技術發展，但是分子生物學的檢測方法在短期內仍然難以代替傳統的生化鑒定，目前分子生物學方法主要用于大量樣品的初篩。需要檢測的食源性弧菌主要包括以下幾種副溶血弧菌、霍亂弧菌、創傷弧菌。
發明內容針對上述目標菌，本發明克服了現有技術中的缺點，提供一種運用復合熒光PCR技術快速低成本的檢測副溶血弧菌、霍亂弧菌和創傷弧菌的方法。該方法包括應用該方法檢測食源性病原微生物的所使用的引物組和與之配套的PCR反應條件。其中引物、探針的全部序列如下引物引物序列一5，CAACAATAAATTGTTGTTTTGTCAGCT弓I物序列二5'GGGCTATAGCTCAGCTGGGAGA引物序列三5，GAAAGATAAACACCAACAACACATT弓I物序列四5'CGATTAGCTCCACCACTGACTTC弓I物序列五5，CGAAGTCAGTGGTGGAGCTAATC引物序列六5'TGGTTTAGAAAGTTTAGAGTATCTTAGTGT本發明提供了更加快速和低成本通過熒光PCR方法檢測食源性致病弧菌的方法。本發明是通過以下技術方案實現的(1)設計特異性寡核苷酸引物用于熒光染料嵌合熒光PCR技術檢測(2)整合各引物使之不相互干擾。(3)以引物序列組，擴增待測樣品模板，進行目的基因的特異性擴增(4)擴增過程中使用熒光PCR儀進行實時熒光光強度測量并在PCR反應結束后進行所合成DNA片段的熔解曲線的測定，并將數據傳輸至電腦通過配套軟件進行分析可以觀察到各種病原微生物的特異性熔解曲線的峰值。本發明用特異性的引物組擴增金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特氏菌、15種腸桿菌和5種弧菌的基因組均產生熒光信號，并生成相應的熔解曲線峰值，均未發現假陽性和假陰性的結果。本發明中熒光PCR反應體系中各組分構成比例如下成分濃度加樣量PCR體系預混合物2倍12.5fiL熒光嵌合法所用引物序列一1Ofimol/L0.3jiL熒光嵌合法所用引物序列二10阿ol/L熒光嵌合法所用引物序列三10拜ol/L0.6^L熒光嵌合法所用引物序列四10拜oI/L0.3|iL熒光嵌合法所用引物序列五10阿ol/L0.3jtL熒光嵌合法所用引物序列六10pmol/L0單DNA樣品雙蒸水總體積25nL熒光PCR擴增程序及測定擴增片段的熔解溫度程序為(1)95*0IO分鐘；(2)95"15秒；(3)65"C30秒；(4)回到第2步，重復40次；(5)95*C2分(6)梯度升溫601C至95*C每秒上升0.2"0。熒光PCR結果在擴增過程中使用熒光PCR儀進行實時熒光光強度測量，并在PCR擴增程序結束后進行梯度升溫測定擴增片段的熔解溫度.將數據傳輸至電腦通過配套軟件進行分析可以觀察到進行特異性擴增產生的熒光，得到對副溶血弧菌的特異性片段所特有的熔解曲線雙峰值(主峰85"Ci(U"C和次峰761C±0.31C);創傷弧菌的特異性片段所特有的熔解曲線雙峰值(主峰761Cia3^C和次峰8化±0.30;霍亂弧菌的特異性片段所特有的熔解曲線三峰值(主峰74*C±0.3"、第一次峰77t:士0.3r和第二次峰84"0±0.3")。如果得到對副溶血弧菌的特異性片段所特有的熔解曲線雙峰值(主峰85TC士0.3"C和次峰761C±0.3*C):則證明待測樣品中含有副溶血弧菌，如果得到對創傷弧菌的特異性片段所特有的熔解曲線雙峰值(主峰76"±0.3"和次峰84"±0.3")則證明待測樣品中含有創傷弧菌如果得到對霍亂弧菌的特異性片段所特有的熔解曲線三峰值(主峰74X^t(U"C、第一次峰77"±0.3"和第二次峰84"±0.3")則說明待測樣品中含有霍亂弧菌。與現有技術相比，本發明的有益效果是基于熒光PCR的鑒定方法適用于直接從患者含菌體液、食品和體液培養物等臨床樣品中擴增靶基因，從而細菌，而且使用本方法只需要一次一管熒光PCR反應就能夠檢測出副溶血弧菌、創傷弧菌和霍亂弧菌是否存在，能夠節約檢測成本和時間。熒光PCR方法具有檢測準確、特異性強、靈敏度高的特點，可以快速、準確地鑒定特異的目標細菌。它用PCR的方法擴增細菌靶基因，避免了反復培養，節約時間；PCR鑒定方法不受培養條件和細菌生理狀態的影響，較生理生化鑒定方法更為準確。圖1某待測帶魚樣品中復合熒光PCR技術檢測待測樣品DNA，SYBRGreen熒光信號強度。圖2某待測帶魚樣品中復合熒光PCR技術檢測待測樣品DNA,擴增產物熔解溫度峰值。圖3某待測魚丸樣品中復合熒光PCR技術檢測待測樣品DNA,SYBRGreen熒光信號強度。圖4某待測魚丸樣品中復合熒光PCR技術檢測待測樣品DNA，擴增產物熔解溫度峰值。圖5某待測海帶樣品中復合熒光PCR技術檢測待測樣品DNA,SYBRGreen熒光信號強度。圖6某待測海帶樣品中復合熒光PCR技術檢測待測樣品DNA,擴增產物熔解溫度峰值。具體實施例方式下面結合附圖與具體實施方式對本發明作進一步詳細描述。實施例l樣本某處出口帶魚。用常規生理、生化方法檢測出副溶血弧菌疑似菌落，然后進行如下復合熒光PCR技術檢測食源性致病菌的檢測1.樣品處理(1)取100克待檢樣品，粉碎。(2)溶解于1升營養肉湯中37"培養8小時。2.DNA抽提取營養肉湯lmL在冰浴中靜置5分鐘，然后在室溫下12000轉/分鐘，離心5分鐘，棄上清液，加入100nL溶菌酶溶液，371C保溫10分鐘，補加TE緩沖液50(HiL,振蕩混勻。加同體積Tris飽和鼢(pH8.0),強烈振蕩，12000轉/分鐘離心3分鐘，取上清液，重復酚抽提。取上清液，加入0.1倍體積的乙酸鈉(2mol/L)，混勻，再加等體積的冰乙醇，混勻后低溫靜置30分鐘，12000轉/分鐘，離心5分鐘，棄上清，加70%冷乙醉洗滌一次，室溫下12000轉/分鐘，離心5分鐘，棄上清，加入50jiLTE溶液，置-20TC保存。3.PCR擴增PCR反應體系中各組分構成比例如下成分濃度加樣量PCR體系預混合物2倍12早熒光嵌合法所用引物序列一10拜ol/L0.3jiL熒光嵌合法所用引物序列二10拜ol/L0早熒光嵌合法所用引物序列三1(Hunol/L0.6pL熒光嵌合法所用引物序列四10拜1/L0.3jiL熒光嵌合法所用引物序列五10阿ol/L0.3jiL熒光嵌合法所用引物序列六10,ol/L0.6^LDNA樣品14雙蒸水總體積25fiL熒光PCR擴增程序及測定擴增片段的熔解溫度程序為(1)95"CIO分鐘；(2)95"C15秒；(3)65"C30秒(4)回到第2步，重復40次；(5)95*02分；(6)梯度升溫60"至951C每秒上升0.2匸。PCR共進行2管PCR實驗，其中DNA樣品所加入的分別為本待測樣品DNA:無樣品的陰性對照。4.被檢測樣品熒光PCR圖譜觀察熒光PCR過程中可以觀察到本待測樣品產生了明顯的SYBRGreen熒光，結果如圖1。陰性對照在PCR過程中沒有產生SYBRGreen熒光結果，在通過觀測擴增產物熔解溫度的熒光曲線，可以發現副溶血弧菌的特征雙峰值(主峰85<0±0.3<0和次峰7610±0.3<0)如圖2。圖1中的曲線所代表的SYBRGreen熒光強度信號是樣品中DNA擴增結果。圖2中的曲線所代表的熔解溫度峰值是樣品中副溶血弧菌的特征峰值(主峰85^Cia3"C和次峰76"±0.310)。實驗表明樣品中含有副溶血弧菌。3天后，通過常規微生物培養和生化檢測證明，所檢驗的目的菌落為副溶血弧菌，將其中一個菌株命名為CIQV6。熒光PCR檢驗結果與生化檢測結果一致。實施例2樣本某處出口魚丸。用常規生理、生化方法檢測出創傷弧菌疑似菌落，然后進行如下復合熒光PCR技術檢測食源性致病弧菌的檢測1.樣品處理(1)取100克待檢樣品，粉碎。(2)溶解于1升營養肉湯中371C培養8小時。2.DNA抽提取營養肉湯lmL在冰浴中靜置5分鐘，然后在室溫下12000轉/分鐘，離心5分鐘，棄上清液，加入100jiL溶菌酶溶液，37*0保溫10分鐘，補加TE緩沖液500nL,振蕩混勻。加同體積Tris飽和酚(pH8.0)，強烈振蕩，12000轉/分鐘離心3分鐘，取上清液，重復酚抽提。取上清液，加入0.1倍體積的乙酸鈉(2mol/L),混勻，再加等體積的冰乙醇，混勻后低溫靜置30分鐘，12000轉/分鐘，離心5分鐘，棄上清，加70%冷乙醇洗滌一次，室溫下12000轉/分鐘，離心5分鐘，棄上清，加入50nLTE溶液，置-20TC保存。3.PCR擴增PCR反應體系中各組分構成比例如下<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>雙蒸水9.1^L總體積25jiL熒光PCR擴增程序及測定擴增片段的熔解溫度程序為(1)95*0IO分鐘(2)951C15秒；(3)65*C30秒；(4)回到第2步，重復40次(5)95"2分；(6)梯度升溫60"至95X:每秒上升0,2"C。PCR共進行2管PCR實驗，其中DNA樣品所加入的分別為本待測樣品DNA;無樣品的陰性對照。4.被檢測樣品熒光PCR圖譜觀察熒光PCR過程中可以觀察到本待測樣品產生了明顯的SYBRGreen熒光，結果如圖3。陰性對照在PCR過程中沒有產生SYBRGreen熒光結果，在通過觀測擴增產物熔解溫度的熒光曲線，可以發現創傷弧菌(主峰76"±0.3*0和次峰84*0±0.310)如圖4。圖3中的曲線所代表的SYBRGreen熒光強度信號是樣品中DNA擴增結果。圖4中的曲線所代表的熔解溫度峰值是樣品中創傷弧菌的特征峰值(主峰76*0±0.3*0和次峰84"±0.3")"C。實驗表明樣品中含有創傷弧菌。3天后，通過常規微生物培養和生化檢測證明，所檢驗的目的菌落為創傷弧菌，將其中一個菌株命名為CIQVll。熒光PCR檢驗結果與生化檢測結果一致。實施例3樣本某處出口海帶。用常規生理、生化方法檢測出霍亂弧菌疑似菌落，然后進行如下復合熒光PCR技術檢測食源性致病菌的檢測1.樣品處理(1)取100克待檢樣品，粉碎，(2)溶解于1升營養肉湯中37X:培養8小時，2.DNA抽提取營養肉湯lmL在冰浴中靜置5分鐘，然后在室溫下12000轉/分鐘，離心5分鐘，棄上清液，加入l(KHiL溶菌醸溶液，37"保溫10分鐘，補加TE緩沖液5(XHiL,振蕩混勻。加同體積Tris飽和酚(pH8.0),強烈振蕩，12000轉/分鐘離心3分鐘，取上清液，重復酚抽提。取上清液，加入O.l倍體積的乙酸鈉(2mol/L),混勻，再加等體積的冰乙醇，混勻后低溫靜置30分鐘，12000轉/分鐘，離心5分鐘，棄上清，加70%冷乙醇洗滌一次，室溫下12000轉/分鐘，離心5分鐘，棄上清，加入5(HiLTE溶液，置-20X;保存，3.PCR擴增PCR反應體系中各組分構成比例如下-成分濃度加樣量PCR體系預混合物2倍12單熒光嵌合法所用引物序列一0.3jiL熒光嵌合法所用引物序列二1O萍ol/L0早熒光嵌合法所用引物序列三io拜iyL0單熒光嵌合法所用引物序列四1(Hunol/L熒光嵌合法所用引物序列五1O拜ol/L熒光嵌合法所用引物序列六10萍ol/L0單DNA樣品雙蒸水9.叫總體積25熒光PCR擴增程序及測定擴增片段的熔解溫度程序為(1)95"CIO分鐘(2)95"C15秒；(3)65"C30秒(4)回到第2步，重復40次(5)951C2分；(6)梯度升溫601C至每秒上升0.210。PCR共進行2管PCR實驗，其中DNA樣品所加入的分別為本待測樣品DNA:無樣品的陰性對照。4.被檢測樣品熒光PCR圖譜觀察熒光PCR過程中可以觀察到本待測樣品產生了明顯的SYBRGreen熒光，結果如圖5。陰性對照在PCR過程中沒有產生SYBRGreen熒光結果，在通過觀測擴增產物熔解溫度的熒光曲線，可以發現霍亂弧菌的特征峰值(主峰7410±0.3"、第一次峰77TCiO,3lC和第二次峰84tl±0.3r)。圖5中的曲線所代表的SYBRGreen熒光強度信號是樣品中DNA擴增結果.圖6中的曲線所代表的熔解溫度峰值是樣品中霍亂弧菌的特征峰值(主峰74*C±0.31C、第一次峰77"±0.310和第二次峰841C±0.3r〉T。實驗表明樣品中含有霍亂弧菌.5天后，通過常規微生物培養和生化檢測證明，所檢驗的目的菌落為霍亂弧菌，將其中一個菌株命名為CIQV30。熒光PCR檢驗結果與生化檢測結果一致，序列列表SEQUENCELISTING<110>中華人民共和國天津出入境檢驗檢疫局<120>運用復合熒光PCR技術檢測食源性致病弧菌的方法<130>2007118<160>6<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>27<212>DNA<213>人工合成<220><221>primer—bind<222>(1)..(27)<400>1caacaata助ttgttgttttgtoagct27<210>2<211>22<212>DNA<213>人工合成<220><221>primer一bind<222>(1)"(22)<400>2鵬ctatagctoagct鵬aga<210>3<211>25<212>DNA<213>人工合成<220><221>primer一bind<222>(1)..(25)<400>3gaaagataaacaccaacaacacatt<210>4<211>23<212>DNA<213>人工合成<220><221>primer一bind<222>(1)"(23)<400>4cgattagctccaccactgac加<210>5<211>23<212>DNA<213>人工合成<220><221>jnimer一bind<222>(1)..(23)<400>cgaagtcagtggtggagctaate<210>6<211>30<212>DNA<213>人工合成<220><221>primer—bind<222>(1)"(30)<400>6tggtttagaaagtttagagtatcttagtgt30權利要求1.一種運用復合熒光PCR技術檢測食源性致病弧菌的方法，其特征在于，所使用的引物組序列如下引物引物序列一5’CAACAATAAATTGTTGTTTTGTCAGCT引物序列二5’GGGCTATAGCTCAGCTGGGAGA引物序列三5’GAAAGATAAACACCAACAACACATT引物序列四5’CGATTAGCTCCACCACTGACTTC引物序列五5’CGAAGTCAGTGGTGGAGCTAATC引物序列六5’TGGTTTAGAAAGTTTAGAGTATCTTAGTGT。2.根據權利要求1所述的一種運用復合熒光PCR技術檢測食源性致病弧菌的方法,其特征在于，PCR反應體系1中各組分構成比例如下成分PCR體系預混合物引物序列一引物序列二.引物序列三引物序列四引物序列五引物序列六DNA樣品雙蒸水總體積3.根據權利要求1所述的-濃度2倍10pmol/L10^mol/L10|xmol/L10拜ol/L加樣量12單0.3fiL0.6fiL0.3fiL0單9.1425，-種運用復合熒光PCR技術檢測食源性致病弧菌的方法,其特征在于，熒光PCR擴增程序及測定擴增片段的熔解溫度程序為(1)951CIO分鐘(2)95"15秒(3)651C30秒(4)回到第(2)步，重復40次(5)95"2分(6)梯度升溫60*C至95"C每秒上升0.210,4.權利要求1所述的一種運用復合熒光PCR技術在檢測食源性致病弧菌方面的應用。全文摘要本發明公開了一種運用復合熒光PCR技術檢測食源性致病弧菌的方法，屬于細菌檢驗
技術領域：
，主要的技術方案是設計了引物組序列。致病弧菌是食品中常見的致病菌，感染弧菌后影響十分嚴重。快速、準確的檢測食品中的致病弧菌是有效預防和控制病原菌感染的重要條件。需要檢測的食源性致病弧菌主要包括以下幾種副溶血弧菌、霍亂弧菌、創傷弧菌。針對上述目標菌，本發明克服了現有技術中的缺點，提供一種運用復合熒光PCR技術快速低成本的檢測副溶血弧菌、霍亂弧菌、創傷弧菌的方法。該方法可以使用一管PCR反應，能夠初篩出上述幾種病原微生物。文檔編號C12Q1/04GK101113473SQ200710057580公開日2008年1月30日申請日期2007年6月7日優先權日2007年6月7日發明者佳于,寅劉,葉露萌,唐丹舟,張宏偉,李永君,鄭文杰,魏亞東,黃熙泰申請人:天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心;南開大學