專利名稱：一種利用傳代雞胚成纖維細胞制備傳染性法氏囊病毒活疫苗的方法
技術領域：
本發明為一種利用傳代雞胚成纖維細胞制備傳染性法氏囊病毒活疫苗的方法，屬于生物疫苗領域。
背景技術：
雞傳染性法氏囊病(Infeetious Bursal Disease, IBD)是由傳染性法氏囊病毒(Infeetious Bursal Disease Virus, IBDV)引起的一種高度接觸性傳染病,是目前危害世界養禽業的主要傳染病之一，主要侵害雛雞和青年雞的法氏囊器官，該病的危害不僅直接造成雞只死亡、增加淘汰率、影響增重，更重要的是破壞法氏囊中的B淋巴細胞，導致免疫抑制，使病雞更易感其它疫病，對疫苗接種的免疫應答下降或喪失。由于IBD在外界環境中較為穩定，采取消毒和隔離措施來控制本病不易達到目的。本病至今仍無有效的治療方法，預防該病最行之有效的辦法就是疫苗的接種。目前，市售的法氏囊疫苗絕大多數為雞胚組織苗，相對于細胞苗而言，其具有成本高、產品質量批間差較大、且容易產生雞源性潛在疾病的感染等缺點。2011年初，哈藥集團生物疫苗有限公司分離了一株法氏囊病毒(命名為:H11株)，其具有在雞胚成纖維細胞上增值的特性，基于此，本研究針對該毒種良好的細胞噬性，從接種材料、培養液改良、培養環境維護、凍干保護劑組分等方面，對現有的生產方法進行了改良，獨創了新的傳代細胞培養方法，按照本發明方法制備得到的活 疫苗具有耐熱性能好，病毒滴度高，穩定性好，適合進行大規模疫苗生產的特點，故而，申請人提出對優化過接種材料、培養液改良、培養環境維護、凍干保護劑組分等條件的新生產方法進行專利保護。
發明內容
本發明的目的為提供一種利用傳代雞胚成纖維細胞(CEF)制備傳染性法氏囊病毒(IBDV)活疫苗的方法。按照本發明方法制備得到的活疫苗相較于雞胚組織苗，病毒含量、產品合格率和免疫攻毒保護率都有顯著的提高，疫苗的耐熱性能顯著，并且半成品陽性雜檢率和單位體積的生產成本都有明顯的降低。本發明的一種利用傳代雞胚成纖維細胞制備傳染性法氏囊病毒活疫苗的方法，其特征在于包括以下步驟:(1)生產用毒種制備①毒種繁殖將毒種用滅菌生理鹽水作IO3 IO4倍稀釋后，接種單層雞胚成纖維細胞；棄掉細胞培養液，按培養液體積的1/10接毒，37°C吸附I小時，加入培養液，并向其添加1%體積的10%還原型谷胱甘肽溶液；37°C，5%C02條件下，培養3 4天，待80%細胞出現特異性病變時收獲病毒液；于_20°C冰柜中反復凍融3次，收獲于滅菌容器內，_20°C保存；②毒種鑒定
符合生產用種子標準；③毒種保存在-20°c以下保存，不超過9個月；④毒種繼代不超過3代；(2)傳代細胞的制備取9 10日齡SPF雞胚，制備雞胚成纖維細胞，37°C培養，待細胞長成單層后，用質量分數為0.2%的胰酶溶液進行消化，加入原體積2倍的含10%初生牛血清的DMEM，吹打均勻，再取原體積細胞液至另外細胞培養瓶中培養，直至長成單層，傳代培養，傳代次數不超過5代；(3)傳染性法氏囊病毒病毒液的制備①接種棄掉細胞培養液，取生產用種毒，用滅菌生理鹽水作IO3 IO4倍稀釋，按培養液體積的1/10接種傳代培養后的單層雞胚成纖維細胞；37°C吸附I小時，加入培養液，并向其中添加1%體積的10%還原型谷胱甘肽溶液，輕輕混勻，37°C培養；②培養病毒接種24小時后，每6小時向培養液中加入總體積0.2%的0.5moI/LNaHCO3,培養3 4天，待80%細胞出現特異性病變時收獲病毒液；③病毒液收獲將裝有病毒液的培養瓶，放入_20°C冰柜中反復凍融3次，收獲于滅菌容器內，在-15°C以下保存，應不超過I個月；(4)半成品檢驗①無菌檢驗每組病毒液分別取樣，應無菌生長；②病毒含量測定每0.2ml病毒含量應為105_ 5EID50,方可配苗；(5)配苗及分裝①凍干保護劑的制備A液:明膠5g、蔗糖5g、糊精5g、胰蛋白胨2g，去離子水定容至100ml，116°C，高壓滅菌30min, 15°C保存,不超過7天；B液:維生素C0.lg、山梨醇2g、谷氨酸鈉1.5g，去離子水定容至100ml，0.22μπι濾膜過濾除菌，4°C保存，不超過3天；②分裝將保護劑A液、B液按1:1體積混合均勻，將檢驗合格的細胞病毒液，按1:1體積比加入保護劑中，定量分裝；(6)凍干分裝后迅速進行冷凍真空干燥。優選的，所述毒種為傳染性法氏囊病毒雞胚成纖維細胞適應株，所述的適應株命名為Hll株，分類命名為傳染性法氏囊病毒，保藏編號為CGMCC N0.6910，保藏日期為2012年11月29日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址位于北京市朝陽區北辰西路I號院。進一步的，本發明還提出了根據本發明所述的方法制備得到的傳染性法氏囊病毒活疫苗。及所述的傳染性法氏囊病毒活疫苗在制備預防雞傳染性法氏囊病藥物中的應用。通過比較試驗發現，本發明利用傳代雞胚成纖維細胞生產疫苗的新方法比利用雞胚生產疫苗的老方法具有以下優點:1.改進的細胞培養方法,病毒含量高于雞胚培養和普通原代CEF培養方法。2.病毒制造原料為傳代雞胚成纖維細胞，使產品質量均一，生產成本顯著降低。3.添加了還原性谷胱甘肽的改良型細胞培養液,使得病毒在增殖速度和產量上都優于目前雞胚培養方法和普通原代CEF培養方法。4.病毒培養過程添加NaHCO3,為病毒的增殖提供穩定的pH環境，延長了病毒增殖曲線高峰區的時間。
5.全過程不添加任何抗生素。6.優化的耐熱凍干保護劑組分，使成品保存條件為2 8°C保存。7.細胞苗的免疫效力不低于利用雞胚生產的傳染性法氏囊活疫苗。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。材料和試劑:毒株:傳染性法氏囊病毒雞胚成纖維細胞適應株Hl I株，保藏編號為CGMCCN0.6910，保藏日期為2012年11月29日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址位于北京市朝陽區北辰西路I號院。材料:9 10日齡SPF雞胚為哈藥集團生物疫苗有限公司SPF雞場種蛋在本研發中心孵化、雞胚原代成纖維細胞由哈藥集團生物疫苗有限公司研發中心制備、0.22 μ m濾膜購自PALL公司。試劑:還原型谷胱甘肽購自Sigma、胰酶購自Gibco、明膠購自Sigma、鹿糖購自國藥化學試劑有限公司、糊精購自上海酶聯生化試劑有限公司、胰蛋白胨購自Amresco、維生素C購自SIGMA、山梨醇購自Amresco、谷氨酸鈉購自MBCHEM實施例1利用傳代雞胚成纖維細胞生產IBDV Hll活疫苗(I)生產用毒種制備①毒種繁殖將毒種Hll株(保藏編號為CGMCC N0.6910)用滅菌生理鹽水作IO3 IO4倍稀釋后，接種單層雞胚成纖維細胞；棄掉細胞培養液，按培養液體積的1/10接毒，37°c吸附I小時，加入培養液，并向其添加1%體積的10%還原型谷胱甘肽溶液；37°C，5%C02條件下，培養3 4天，待80%細胞出現特異性病變時收獲病毒液；于_20°C冰柜中反復凍融3次，收獲于滅菌容器內，-20°C保存；②毒種鑒定符合生產用種子標準；③毒種保存在_20°C以下保存，不超過9個月；④毒種繼代不超過3代；(2)傳代細胞的制備取9 10日齡SPF雞胚，制備雞胚成纖維細胞，37°C培養，待細胞長成單層后，用質量分數為0.2%的胰酶溶液進行消化，加入原體積2倍的含10%初生牛血清的DMEM，吹打均勻，再取原體積細胞液至另外細胞培養瓶中培養，直至長成單層，即可使用；傳代次數不超過5代；(3)傳染性法氏囊病毒病毒液的制備①接種棄掉細胞培養液，取生產用種毒，用滅菌生理鹽水作IO3 IO4倍稀釋，按培養液體積的1/10接種傳代培養后的單層雞胚成纖維細胞；37°C吸附I小時，加入培養液，并向其中添加1%體積的10%還原型谷胱甘肽溶液，輕輕混勻，37°C培養；②培養病毒接種24小時后，每6小時向培養液中加入總體積0.2%的0.5moI/LNaHCO3,培養3 4天，待80%細胞出現特異性病變時收獲病毒液；③病毒液收獲將裝有病毒液的培養瓶，放入_20°C冰柜中反復凍融3次，收獲于滅菌容器內，在-15°C以下保存，應不超過I個月；(4)半成品檢驗①無菌檢驗每組病毒液分別取樣，應無菌生長；②病毒含量測定每0.2ml病毒含量應為105_ 5EID50,方可配苗；(5)配苗及分裝①凍干保護劑的制備A液:明膠5g、蔗糖5g、糊精5g、胰蛋白胨2g，去離子水定容至100ml，116°C，高壓滅菌30min, 15°C保存,不超過7天；B液:維生素C0.lg、山梨醇2g、谷氨酸鈉1.5g,去離子水定容至100ml,0.22μηι濾膜過濾除菌，4°C保存，不超過3天；②分裝將保護劑A液、B液按1:1體積混合均勻，將檢驗合格的細胞病毒液，按1:1體積比加入保護劑中，定量分裝；(6)凍干
分裝后迅速進行冷凍真空干燥。
試驗例I利用雞胚生產IBDV活疫苗1、生產用毒種制備(I)毒種繁殖將毒種Hll株(保藏編號為CGMCC N0.6910)用滅菌生理鹽水作100 1000倍稀釋后，經絨毛尿囊膜途徑接種10 12日齡SPF雞胚，每胚0.2ml。置37°C孵育，選接種48 120小時死亡雞胚，收取病變胎兒及尿囊膜，裝于無菌容器內，同時吸取部分雞胚液作無菌檢驗。將培養無菌的雞胚、尿囊膜剪碎混合，用普通肉湯或同批尿囊液制成5倍稀釋的乳齊U，離心去渣，上清液加適量的抗生素分裝，_20°C保存。注明收獲日期、毒種代次及裝量。(2)毒種鑒定應符合生產用種子標準。(3)毒種保存在-10°C以下保存，應不超過6個月。(4)毒種繼代應不超過3代。2、制苗材料選擇 選擇發育良好，10 12日齡SPF雞胚作為制苗材料。3、制苗毒液的制備( I)接種取生產用毒種Hll株，用滅菌生理鹽水稀釋50 100倍，每胚經尿囊腔或絨毛尿囊膜接種0.1 0.2ml，封口后，置37°C繼續孵育，不必翻蛋。(2)孵育和觀察接種后，將36小時前死亡的雞胚棄去。36小時后，每隔4 8小時照蛋一次，隨時取出48 168小時死亡雞胚，置2 8°C冷卻。(3)收獲將冷卻4 24小時的雞胚取出，用碘酊消毒氣室部，以無菌手術除去蛋殼，收獲胎兒和尿囊膜，分組置于無菌容器內，置-10°c以下冷凍保存。在收獲的同時，應逐個檢查胎兒病變，須具有傳染性法氏囊病病毒Hll株所引起的特異性病變。4、半成品檢驗(I)無菌檢驗每組雞胚分別取樣，應無菌生長。(2)病毒含量測定每0.2ml病毒含量應為105_ 5EID50,方可配苗。5、配苗及分裝將檢驗合格的雞胚、雞胚尿囊膜磨碎，按適當比例加入5%蔗糖脫脂奶制成乳劑，同時加入適量的抗生素充分混勻，定量分裝。6、凍干分裝后迅速進行冷凍真空干燥。試驗例2利用原代雞胚成纖維細胞生產IBDV Hll活疫苗(I)生產用毒種制備
①毒種繁殖將毒種Hll株(保藏編號為CGMCC N0.6910)用滅菌生理鹽水作IO3 IO4倍稀釋后，接種單層雞胚成纖維細胞；棄掉細胞培養液，按培養液體積的1/10接毒，37°c吸附I小時，加入培養液，并向其添加1%體積的10%還原型谷胱甘肽溶液；37°C，5%C02條件下，培養3 4天，待80%細胞出現特異性病變時收獲病毒液；于_20°C冰柜中反復凍融3次，收獲于滅菌容器內，_20°C保存；②毒種鑒定符合生產用種子標準；③毒種保存在_20°C以下保存，不超過9個月；④毒種繼代不超過3代；(2)制苗材料制備取9 10日齡SPF雞胚，制備雞胚成纖維細胞，37°C培養，待細胞長成單層后，SP可使用；(3)傳染性法氏囊病毒病毒液的制備①接種
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棄掉細胞培養液，取生產用種毒，用滅菌生理鹽水作IO3 IO4倍稀釋，按培養液體積的1/10接種單層原代雞胚成纖維細胞；37°C吸附I小時，加入培養液，并向其中添加1%體積的10%還原型谷胱甘肽溶液，輕輕混勻，37°C培養；②培養病毒接種24小時后，每6小時向培養液中加入總體積0.2%的0.5moI/LNaHCO3,培養3 4天，待80%細胞出現特異性病變時收獲病毒液；③病毒液收獲將裝有病毒液的培養瓶，放入_20°C冰柜中反復凍融3次，收獲于滅菌容器內，在-15°C以下保存，應不超過I個月；(4)半成品檢驗①無菌檢驗每組病毒液分別取樣，應無菌生長；②病毒含量測定每0.2ml病毒含量應為105_ 5EID50,方可配苗；(5)配苗及分裝①凍干保護劑的制備A液:明膠5g、蔗糖5g、糊精5g、胰蛋白胨2g，去離子水定容至100ml，116°C，高壓滅菌30min, 15°C保存,不超過7天；B液:維生素C0.lg、山梨醇2g、谷氨酸鈉1.5g,去離子水定容至100ml,0.22μηι濾膜過濾除菌，4°C保存，不超過3天；②分裝將保護劑A液、B液按1:1體積混合均勻，將檢驗合格的細胞病毒液，按1:1體積比加入保護劑中，定量分裝；(6)凍干分裝后迅速進行冷凍真空干燥。試驗例3通過本發明傳代細胞培養獲得的細胞毒與雞胚培養獲得的組織毒和普通原代CEF培養獲得的細胞毒相比較，現將其中一些指標的比較結果總結如下:表I兩種種毒雞胚毒力的比較
權利要求
1.一種利用傳代雞胚成纖維細胞制備傳染性法氏囊病毒活疫苗的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)生產用毒種制備 ①毒種繁殖 將傳染性法氏囊病毒毒種用滅菌生理鹽水作IO3 IO4倍稀釋后，接種單層雞胚成纖維細胞；棄掉細胞培養液，按培養液體積的1/10接毒，37°C吸附I小時，加入培養液，并向其添加1%體積的10%還原型谷胱甘肽溶液；37°C，5%C02條件下，培養3 4天，待80%細胞出現特異性病變時收獲病毒液；于_20°C冰柜中反復凍融3次，收獲于滅菌容器內，_20°C保存； ②毒種鑒定 符合生產用種子標準； ③毒種保存 在-20°C以下保存，不超過9個月； ④毒種繼代 不超過3代； (2)傳代細胞的制備 取9 10日齡SPF雞胚，制備雞胚成纖維細胞，37°C培養，待細胞長成單層后，用質量分數為0.2%的胰酶溶液進行消化，加入原體積2倍的含10%初生牛血清的DMEM，吹打均勻，再取原體積細胞液至另外細胞培養瓶中培養，直至長成單層，傳代培養，傳代次數不超過5代； (3)傳染性法氏囊病毒病毒液的制備 ①接種 棄掉細胞培養液，取生產用種毒，用滅菌生理鹽水作IO3 IO4倍稀釋，按培養液體積的1/10接種傳代培養后的單層雞胚成纖維細胞；37°C吸附I小時，加入培養液，并向其中添加1%體積的10%還原型谷胱甘肽溶液，輕輕混勻，37°C培養； ②培養 病毒接種24小時后，每6小時向培養液中加入總體積0.2%的0.5moI/LNaHCO3,培養3 4天，待80%細胞出現特異性病變時收獲病毒液； ③病毒液收獲 將裝有病毒液的培養瓶，放入_20°C冰柜中反復凍融3次，收獲于滅菌容器內，在_15°C以下保存，應不超過I個月； (4)半成品檢驗 ①無菌檢驗 每組病毒液分別取樣，應無菌生長； ②病毒含量測定 每0.2ml病毒含量應為IO5 5EID5tl，方可配苗； (5)配苗及分裝 ①凍干保護劑的制備 A液:明膠5g、蔗糖5g、糊精5g、胰蛋白胨2g，去離子水定容至100ml，116°C，高壓滅菌30min, 15°C保存，不超過7天；B液:維生素C0.lg、山梨醇2g、谷氨酸鈉1.5g,去離子水定容至IOOml,0.22μηι濾膜過濾除菌，4°C保存，不超過3天； ②分裝 將保護劑A液、B液按1:1體積混合均勻，將檢驗合格的細胞病毒液，按1:1體積比加入保護劑中，定量分裝； (6)凍干 分裝后迅速進行冷凍真空干燥。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的傳染性法氏囊病毒毒種為傳染性法氏囊病毒雞胚成纖維細胞適應株，所述的適應株命名為Hll株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCN0.6910。
3.根據權利要求1或2所述的方法制備得到的傳染性法氏囊病毒活疫苗。
4.權利要求3所述的傳染性法氏囊病毒活疫苗在制備預防雞傳染性法氏囊病藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種利用傳代雞胚成纖維細胞制備傳染性法氏囊病毒活疫苗的方法。本發明依次經過生產用毒種制備、制苗材料制備、IBDV細胞病毒液制備、成品檢驗、配苗及分裝、凍干等步驟制得IBDV活疫苗，本發明從接種材料、培養液改良、培養環境維護、凍干保護劑組分等方面，對現有的生產方法進行了改良，獨創了新的傳代細胞培養方法。此外，還包括通過本發明方法制得的IBDV活疫苗在預防雞傳染性法氏囊病中的應用。由本發明方法制備得到的IBDV活疫苗具有耐熱性能好，病毒滴度高，穩定性好，適合進行大規模疫苗生產的特點。
文檔編號C12N7/00GK103143007SQ201310061699
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月27日 優先權日2013年2月27日
發明者劉洪斌, 張楊, 楊萬秋, 丁國杰, 李東偉, 楊朋欣, 焦利紅, 孫心, 李敏, 張明艷 申請人:哈藥集團生物疫苗有限公司