專利名稱：一種傳染性法氏囊病毒雞胚成纖維細胞適應株h11株及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物疫苗領域，具體涉及一種傳染性法氏囊病毒雞胚成纖維細胞適應株Hll株及其應用。
背景技術：
雞傳染性法氏囊病(Infeetious Bursal Disease, IBD)是由傳染性法氏囊病毒(Infeetious Bursal Disease Virus, IBDV)引起的一種高度接觸性傳染病,是目前危害世界養禽業的主要傳染病之一，主要侵害雛雞和青年雞的法氏囊器官，該病的危害不僅直接造成雞只死亡、增加淘汰率、影響增重，更重要的是破壞法氏囊中的B淋巴細胞，導致免疫抑制，使病雞更易感其它疫病，對疫苗接種的免疫應答下降或喪失。由于IBD在外界環境中較為穩定，采取消毒和隔離措施來控制本病不易達到目的。本病至今仍無有效的治療方法，預防該病最行之有效的辦法就是疫苗的接種。目前，市售的法氏囊疫苗絕大多數為雞胚組織苗，相對于細胞苗而言，其具有成本高、產品批間質量相差較大、且容易產生雞源性潛在疾病的感染等缺點。2011年初，哈藥集團生物疫苗有限公司分離了一株法氏囊病毒，其具有在雞胚成纖維細胞上增殖的特性，基于此，本研究針對組織苗的不足，馴化出了一株細胞適應毒，命名為Hll株，故此，提出對該病毒株進行專利保護。
發明內容
針對現有技術中的問題，本發明提供了一種傳染性法氏囊病毒雞胚成纖維細胞適應株，命名為Hll株，分類命名為傳染性法氏囊病毒，保藏編號為CGMCC N0.6910，保藏日期為2012年11月29日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址位于北京市朝陽區北辰西路I號院。本發明分離的傳染性法氏囊病毒雞胚成纖維細胞適應株Hll株通過以下方法制備得到:1、病毒的分離:病料來自黑龍江省阿城市郊某養殖場，采集瀕死法氏囊，無菌條件下剪碎，氯仿處理，離心，取上清接種雞胚，收集48h 120h雞胚和尿囊膜。用組織搗碎機研磨后，至_20°C保存備用。2、病毒分離株的初步鑒定組織液的紅細胞凝集試驗呈陰性；與抗雞傳染性法氏囊病病毒陽性血清進行瓊脂雙向擴散試驗，結果為陽性。3、在雞胚原代成纖維細胞(CEF)上的傳代與收獲
(I)將收獲的組織毒，用滅菌生理鹽水稀釋后，接種長成單層的CEF上，37°C培養5天，放入_20°C中凍融3次，收獲病毒液。
(2)重復上述試驗10次，直至病毒在CEF增殖良好，即得Hll株。本發明還提供了所述的傳染性法氏囊病毒雞胚成纖維細胞適應株Hll株在制備預防雞傳染性法氏囊病的活疫苗中的應用。將本發明獲得的傳染性法氏囊病毒雞胚成纖維細胞適應株Hl I株利用CEF細胞生產IBDV Hll活疫苗，其具體方法如下:1、生產用毒種制備(I)毒種繁殖將毒種Hll株(保藏編號為CGMCC N0.6910)用滅菌生理鹽水作IO3 IO4倍稀釋后，接種單層雞胚成纖維細胞(CEF)。棄掉細胞培養液，按培養液體積的1/10接毒，37°C吸附I小時，加入培養液，并向其添加1%體積的10%還原型谷胱甘肽溶液。37°C，5%C02條件下，培養3 4天，待80%細胞出現特異性病變時收獲病毒液。于_20°C冰柜中反復凍融3次，收獲于滅菌容器內，-20°C保存。注明收獲日期、毒種代次及裝量。(2)毒種鑒定應符合生產用種子標準。(3)毒種保存在_20°C以下保存，應不超過9個月。(4)毒種繼代應不超過3代。
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2、制苗材料制備(I)細胞的制備取9 10日齡SPF雞胚，制備雞胚成纖維細胞，37°C培養，待細胞長成單層后，用質量分數為0.2%的胰酶溶液進行消化，加入原體積2倍的含10%初生牛血清的DMEM，吹打均勻，再取原體積細胞液至另外細胞培養瓶中培養，直至長成單層，即可使用。(2)傳代培養傳代次數不超過5代。3、IBDV Hll株細胞病毒液的制備( I)接種棄掉細胞培養液，取生產用種毒Hll株，用滅菌生理鹽水作適當稀釋(IO3 IO4倍)，按培養液體積的1/10接種單層雞胚成纖維細胞。37°C吸附I小時，加入培養液，并向其添加1%體積的10%還原型谷胱甘肽溶液，輕輕混勻，37°C培養。(2)培養病毒接種24小時后，每6小時向培養液中加入總體積0.2%的0.5moI/LNaHCO3,培養3 4天，待80%細胞出現特異性病變時收獲病毒液。(3)病毒液收獲將裝有病毒液的培養瓶，放入_20°C冰柜中反復凍融3次，收獲于滅菌容器內，在-15°C以下保存，應不超過I個月。4、半成品檢驗(I)無菌檢驗每組病毒液分別取樣，應無菌生長。
(2)病毒含量測定每0.2ml病毒含量應為IO5 5EID5tl，方可配苗。5、配苗及分裝(1)凍干保護劑的制備A液:明膠5%、蔗糖5%、糊精5%、胰蛋白胨2%，去離子水配制，116°C，高壓滅菌30min, 15°C保存,不超過7天。B液:Vc0.1%、山梨醇2%、谷氨酸鈉1.5%，去離子水配制，0.22 μ m濾膜過濾除菌，4°C保存，不超過3天。(2)分裝將保護劑A液、B液按1:1體積混合均勻，將檢驗合格的細胞病毒液，按1:1加入保護劑中，定量分裝。6、凍干分裝后迅速進行冷凍真空干燥。進一步的，本發明還提出了一種預防雞傳染性法氏囊病的疫苗組合物，其特征在于所述的疫苗組合物中，其有效成分包含本發明所述的傳染性法氏囊病毒雞胚成纖維細胞適應株(Hll株)。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。材料和試劑:毒株:傳染性法氏囊病毒雞胚成纖維細胞適應株Hll株，保藏編號為CGMCCN0.6910，保藏日期為2012年11月29日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址位于北京市朝陽區北辰西路I號院。材料:9 10日齡SPF雞胚、10 12日齡SPF雞胚為哈藥集團生物疫苗有限公司SPF雞場種蛋在本研發中心孵化、雞胚原代成纖維細胞購自中國獸藥監察所、0.22 μ m濾膜購自PALL公司。試劑:抗雞傳染性法氏囊病病毒陽性血清購自中國獸醫藥品監察所、還原型谷胱甘肽購自Sigma、胰酶購自Gibco、明膠購自Sigma、鹿糖購自國藥化學試劑有限公司、糊精購自上海酶聯生化試劑有限公司、胰蛋白胨購自Amresco、維生素C購自SIGMA、山梨醇購自Amresco、谷氛酸納購自MBCHEM。實施例1傳染性法氏囊病毒雞胚成纖維細胞適應株Hll株的分離1、病毒的分離:病料來自黑龍江省阿城市郊某養殖場，采集瀕死法氏囊，無菌條件下剪碎，氯仿處理，離心，取上清接種雞胚，收集48h 120h雞胚和尿囊膜。用組織搗碎機研磨后，至_20°C保存備用。2、病毒分離株的初步鑒定組織液的紅細胞凝集試驗呈陰性；與兔抗法氏囊病毒多克隆抗體進行瓊脂雙向擴散試驗，結果為陽性。3、在雞胚原代成纖維細胞(CEF)上的傳代與收獲(I)將收獲的組織毒，用滅菌生理鹽水稀釋后，接種長成單層的CEF上，37°C培養5天，放入_20°C中凍融3次，收獲病毒液。(2)重復上述試驗10次，直至病毒在CEF增殖良好，即得Hll株。本發明獲得的傳染性法氏囊病毒雞胚成纖維細胞適應株Hll株，保藏編號為CGMCC N0.6910，保藏日期為2012年11月29日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址位于北京市朝陽區北辰西路I號院。實施例2利用傳代雞胚成纖維細胞生產IBDV Hll活疫苗1、生產用毒種制備(I)毒種繁殖將毒種Hll株(保藏編號為CGMCC N0.6910)用滅菌生理鹽水作IO3 IO4倍稀釋后，接種單層雞胚成纖維細胞(CEF)。棄掉細胞培養液，按培養液體積的1/10接毒，37°C吸附I小時，加入培養液，并向其添加1%體積的10%還原型谷胱甘肽溶液。37°C，5%C02條件，培養3 4天，待80%細胞出現特異性病變時收獲病毒液。于_20°C冰柜中反復凍融3次，收獲于滅菌容器內，_20°C保存。注明收獲日期、毒種代次及裝量。(2)毒種鑒定應符合生產用種 子標準。(3)毒種保存在_20°C以下保存，應不超過9個月。(4)毒種繼代應不超過3代。2、制苗材料制備(I)細胞的制備取9 10日齡SPF雞胚，制備雞胚成纖維細胞，37°C培養，待細胞長成單層后，用質量分數為0.2%的胰酶溶液進行消化，加入原體積2倍的含10%初生牛血清的DMEM，吹打均勻，再取原體積細胞液至另外細胞培養瓶中培養，直至長成單層，即可使用。(2)傳代培養傳代次數不超過5代。3、IBDV Hll株細胞病毒液的制備( I)接種棄掉細胞培養液，取生產用種毒Hll株，用滅菌生理鹽水作IO3 IO4倍適當稀釋，按培養液體積的1/10接種傳代后的單層雞胚成纖維細胞，37°C吸附I小時，加入培養液，并向其添加1%體積的10%還原型谷胱甘肽溶液，輕輕混勻，37°C培養。(2)培養病毒接種24小時后，每6小時向培養液中加入總體積0.2%的0.5moI/LNaHCO3,培養3 4天，待80%細胞出現特異性病變時收獲病毒液。(3)病毒液收獲將裝有病毒液的培養瓶，放入_20°C冰柜中反復凍融3次，收獲于滅菌容器內，在-15°C以下保存，應不超過I個月。4、半成品檢驗(I)無菌檢驗每組病毒液分別取樣，應無菌生長。(2)病毒含量測定每0.2ml病毒含量應為105_5EID5tl，方可配苗。5、配苗及分裝( I)凍干保護劑的制備A液:明膠5%、蔗糖5%、糊精5%、胰蛋白胨2%，去離子水配制，116°C，高壓滅菌30min, 15°C保存,不超過7天。B液:Vc0.1%、山梨醇2%、谷氨酸鈉1.5%，去離子水配制，0.22 μ m濾膜過濾除菌，4°C保存，不超過3天。(2)分裝將保護劑A液、B液按1:1體積混合均勻，將檢驗合格的細胞病毒液，按1:1加入保護劑中，定量分裝。6凍干:分裝后迅速進行冷凍真空干燥。試驗例I利用雞胚生產IBDV Hll株活疫苗
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1、生產用毒種制備(I)毒種繁殖將毒種Hll株用滅菌生理鹽水作100 1000倍稀釋后，經絨毛尿囊膜途徑接種10 12日齡SPF雞胚，每胚0.2ml。置37°C孵育，選接種48 120小時死亡雞胚，收取病變胎兒及尿囊膜，裝于無菌容器內，同時吸取部分雞胚液作無菌檢驗。將培養無菌的雞胚、尿囊膜剪碎混合，用普通肉湯或同批尿囊液制成5倍稀釋的乳劑，離心去渣，上清液加適量的抗生素分裝，_20°C保存。注明收獲日期、毒種代次及裝量。(2)毒種鑒定應符合生產用種子標準。(3)毒種保存在-10°C以下保存，應不超過6個月。(4)毒種繼代應不超過3代。2、制苗材料選擇選擇發育良好，10 12日齡SPF雞胚作為制苗材料。3、制苗毒液的制備(I)接種取生產用毒種Hll株，用滅菌生理鹽水稀釋50 100倍，每胚經尿囊腔或絨毛尿囊膜途徑接種0.1 0.2ml，封口后，置37°C繼續孵育，不必翻蛋。(2)孵育和觀察接種后，將36小時前死亡的雞胚棄去。36小時后，每隔4 8小時照蛋一次，隨時取出48 168小時死亡雞胚，置2 8°C冷卻。(3)收獲
將冷卻4 24小時的雞胚取出，用碘酊消毒氣室部，以無菌手術除去蛋殼，收獲胎兒和尿囊膜，分組置于無菌容器內，置-10°c以下冷凍保存。在收獲的同時，應逐個檢查胎兒病變，須具有傳染性法氏囊病病毒Hll株所引起的特異性病變。4、半成品檢驗(1)無菌檢驗每組雞胚分別取樣，應無菌生長。(2)病毒含量測定每0.2ml病毒含量應為105_ 5EID50,方可配苗。5、配苗及分裝將檢驗合格的雞胚、雞胚尿囊膜磨碎，按適當比例加入5%蔗糖脫脂奶制成乳劑，同時加入適量的抗生素充分混勻，定量分裝。6、凍干分裝后迅速進行冷凍真空干燥。
試驗例2實施例2通過細胞培養制備的10批次IBDV Hll株活疫苗(細胞苗(毒))與試驗例I通過組織培養制備的10批次IBDV Hll株活疫苗(組織苗(毒))相比較，現將其中一些指標的比較結果總結如下:表I兩種種毒雞胚毒力的比較
權利要求
1.一種傳染性法氏囊病毒雞胚成纖維細胞適應株，其特征在于所述的適應株命名為Hll株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCN0.6910。
2.權利要求1所述的傳染性法氏囊病毒雞胚成纖維細胞適應株在制備預防雞傳染性法氏囊病的活疫苗中的應用。
3.一種預防雞傳染性法氏囊病的疫苗組合物，其特征在于所述的疫苗組合物中，其有效成分包含權利要求1所述的傳染`性法氏囊病毒雞胚成纖維細胞適應株。
全文摘要
本發明涉及一種傳染性法氏囊病毒雞胚成纖維細胞適應株及其應用。本發明的一種傳染性法氏囊病毒雞胚成纖維細胞適應株，其保藏編號為CGMCC NO.6910，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。此外，本發明還提供了分離該H11株的方法，及該毒株在制備預防雞傳染性法氏囊病的活疫苗中的應用。本發明的提出克服了雞胚組織苗成本高、產品批間質量相差較大、且容易產生雞源性潛在疾病的感染等缺點，具有廣泛的應用前景。
文檔編號C12N7/00GK103146653SQ201310061700
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月27日 優先權日2013年2月27日
發明者丁國杰, 張楊, 鄭德富, 劉洪斌, 焦利紅, 李東偉, 楊鵬欣, 孫心, 王全杰, 孫德君 申請人:哈藥集團生物疫苗有限公司