專利名稱：一種早老性癡呆大鼠動物模型的構建方法
技術領域：
本發明屬于醫療評價、檢測技術領域，具體涉及一類用于篩選因蛋白激酶過度激活引發的骨架蛋白Tau AD樣異常過度磷酸化、神經原纖維纏結樣病理變化和學習、記憶障礙共存的早老性癡呆動物模型的建立，以用于治療藥物的篩選，以及研究蛋白激酶與AD發病之間的內在聯系。
背景技術：
早老性癡呆(Alzheimer Disease，AD)是一種常見的神經退行性疾病，其主要癥狀表現為記憶力減退，認知能力低下和思維遲鈍，且進行性加重，最后生活不能自理而死亡，病程一般5～20年。隨著社會老齡化進程的加快，AD的發病率和發病人數急劇上升，已成為威脅老齡特別是高齡人口身心健康的嚴重疾病，并帶來了嚴重的社會、經濟和家庭問題。
AD病人主要腦病理改變是大量神經原纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFTs)、大量老年斑、突觸和神經元丟失，與之相對映的兩大分子標志物是tau蛋白和β-淀粉樣蛋白。目前國外學者已采用轉基因技術，在小鼠成功地復制出β-淀粉樣沉積引起的老年斑病變，使得未來AD治療將減少β淀粉樣蛋白沉積作為藥物干預的目標成為可能，盡管如此，但在臨床上并不能從根本上治療AD。
AD的另一主要腦病理改變NFTs是AD患者神經元變性的基礎，其數量與AD臨床癡呆程度正相關。因此，對NFTs干預顯得尤為重要。蛋白tau屬于一種微管相關蛋白，主要參與調與微管組裝、運輸和空間結構(Mandelkow EM，1995)，而NFTs的主要成分是異常、過度磷酸化的tau蛋白聚集形成的雙螺旋絲，國內外學者普遍公認，骨架蛋白tau的異常、過度磷酸化是NFTs形成的關鍵步驟。過度磷酸化tau蛋白的聚集不僅以纏結的形式存在，它也是神經氈纖絲和老年斑中的營養不良突起的主要成分。有關神經元細胞骨架蛋白發生過磷酸化的機制十分復雜，目前研究認為蛋白激酶(催化磷酸化反應，如GSK-3，Cdk5和MAPK等)與磷酸酯酶(催化去磷酸化反應，如PP1，PP-2A，PP-2B等)的相對活性失衡，是造成骨架蛋白磷酸化的主要原因。因此，以蛋白激酶激動劑或抑制劑和磷酸酯酶抑制劑為工具藥，都可以在體誘導tau蛋白的異常、過度磷酸化，從不同的角度探討在此過程中的細胞病理改變、與動物學習、記憶的聯系，這作為研究NFTs的首選，將為AD早期診斷和防治AD樣神經細胞退化提供理論和實踐依據。
目前國外相關的動物模型有兩類，一類是崗田酸(Okadaic acid，OA)慢性損害模型，OA，一種磷酸酯酶抑制劑，通過微滲透泵輸送到側腦室，持續六周后，大鼠腦的紋狀體、海馬和皮質等部位出現高磷酸化tau蛋白免疫陽性神經元，并伴有工作記憶和參考記憶的損害(Arent T，1995)；另一類是轉染tau蛋白激酶基因的大鼠模型，該模型能高表達過度磷酸化的tau蛋白(野生型或人類tau蛋白的突變異構體)，可重復間歇饑餓刺激和對胰島素信號轉導途徑作用的藥物如atreptozotocin、tolbutamide、LY294002、wortmannin、PD98059等實驗，但無行為學記憶障礙(JP2000253774)。目前國內外尚無通過大鼠側腦室或海馬注射蛋白激酶激動劑或抑制劑誘導蛋白tau過度磷酸化的動物模型，尤其是聯合用藥。
本發明特點主要是針對大鼠海馬骨架蛋白tau，通過大鼠側腦室或海馬注射蛋白激酶激動劑或抑制劑，不僅出現AD樣異常、過度磷酸化tau蛋白的免疫陽性神經元和神經原纖維纏結樣病理變化，而且還伴有學習、記憶障礙，且所需費用低廉，重現性好，適用于篩選因不同蛋白激酶活性增高引發的骨架蛋白Tau AD樣異常過度磷酸化、形成神經原纖維纏結樣病理變化及行為異常的AD治療藥物，以及研究因不同蛋白激酶活性增高和AD發病機制之間內在聯系，與上述相關動物模型的比較見下表。
表幾種早老性癡呆大鼠模型的比較
發明內容本發明的目的在于提供一種利用非轉基因技術構建早老性癡呆動物模型的方法，即通過大鼠側腦室或海馬注射蛋白激酶激動劑或抑制劑，在體誘導特定蛋白激酶活性增高，構建AD樣骨架蛋白異常過度磷酸化、神經原纖維纏結樣形成等病理變化與學習、記憶障礙共存的動物模型的方法。具體方法是在大鼠側腦室或雙側海馬注射蛋白激酶激動劑或/和抑制劑。
所選用的蛋白激酶抑制劑是磷脂酰肌醇3激酶抑制劑或/和蛋白激酶C的抑制劑，磷脂酰肌醇3激酶抑制劑的濃度是100μm，蛋白激酶C的抑制劑的濃度是100μm。所選用的蛋白激酶激動劑為反式異丙腎上腺素，其濃度為5至40mM。
在大鼠側腦室或雙側海馬注射wortmannin(磷脂酰肌醇3激酶抑制劑)和GF-109203X(蛋白激酶C的抑制劑)，直接復制出AD樣大鼠海馬骨架蛋白異常過度磷酸化、神經原纖維纏結樣病理變化和學習、記憶障礙動物模型的具體步驟如下(1)側腦室注射給藥選擇適當的大鼠，麻醉后固定在腦立體定位儀上，清晰暴露前后囟，于前囟后1.0～1.2mm，中線旁側1.5～1.gmm垂直進針至硬膜下約3.5～3.8mm，分別緩慢注入wortmannin和GF-109203X藥液10μl，wortmannin的濃度為100μM；GF-109203X濃度為100μM，用滅菌人工腦脊液配置，留針10min使藥液得到充分吸收。
(2)Morris水迷宮訓練及測試目的通過訓練及測試來判斷造模前后以及與對照組大鼠學習、記憶能力的變化。
實驗所采用Morris水迷宮測試系統主要包括大鼠行為學測試系統、圖象采集系統及微機數據處理分析系統。測試用圓形水池直徑120cm，高60cm；圓柱形有機玻璃平臺直徑10cm，高40cm。大鼠在訓練前2小時移入水迷宮室，并用染發劑將頭頸部涂黑，涂染面積不小于3×3cm2，以與背景形成反差。水池中水面高約45cm，室溫及水溫均保持在26±2℃，水以奶粉攪渾；平臺用雙層白色紗布覆蓋扎緊后任意放置于某一象限的中心位置，并沒于水面下約2cm。整個背景均為乳白色，以避免老鼠用視覺搜尋平臺。用于指導大鼠游泳找到平臺的紅色或蘭色標記物分別置于平臺所在象限邊緣1m左右。
訓練時將大鼠從任一象限1/2弧度處頭面向池壁輕放于水中，其游泳圖象經水面上方1.5m處的攝象機拍攝并連接于路徑追蹤系統采集，最后通過微機分析，可提供潛伏期(即大鼠從入水點起到找到平臺所用的時間)、路徑、搜索策略等指標，本實驗選用潛伏期作為衡量大鼠學習記憶和測試成績的指標。每只大鼠每天在4個象限共訓練4次，每次游泳時限為60s，即在60s內未找到平臺者系統自動停止記錄，潛伏期記為60s，由測試者引導其上臺，休息30s后進行下一次訓練。
(3)分子病理學檢測目的通過免疫印跡和免疫組化來反映造模前后以及與對照組大鼠海馬骨架蛋白的分子病理學變化。
①免疫印跡法頸椎脫臼斷頭處死雄性Wistar大鼠，迅速取出大腦腦組織置于0-4℃ 0.05M Tris緩沖鹽溶液(TB，PH7.0)內，快速分離雙側海馬，制成10％的蛋白勻漿，在1000rmp離心5分鐘，取上清，測定蛋白含量后備用。
②免疫組化法用4％多聚甲醛磷酸緩沖鹽溶液(PB)進行心臟灌注固定腦組織，待取出腦組織后再在上述固定液中后固定6h，即可作振蕩切片。免疫組化采用ABC法，二氨基聯苯氨(diaminobezidin，DAB)顯色。
(4)糖原合成激酶(Glycogen synthase kinase-3，GSK-3)酶活性測定目的通過同位素標記法來檢測造模前后以及對照組大鼠海馬GSK-3的活性改變。
大鼠海馬蛋白勻漿的糖原合成激酶(Glycogen synthase kinase-3，GSK-3)酶活性主要是依靠磷光體GS肽II作為底物進行測定(Pei et al.，1997；Tsujio et al.，2000)，具體方法如下在反應管中先一定體積的緩沖液(其組成為30mM Tris，pH7.4，10mM MgCl2，10mM NaF，1mM Na3VO4，2mM EGTA，and 10mM β-mercaptoethanol)，再分別加入7.5μg大鼠海馬蛋白勻漿、250μM底物肽和200μMγ-32P-ATP(1,500cpm/pmol ATP)，終體積為25μl，在30℃條件下孵育30min，用25μl of 300mM鄰磷酸終止反應，然后從中取出25μl在液態閃爍記數分析儀進行檢測。
(5)統計分析全部數據均采用X±SD表示，利用SPSS統計軟件進行統計分析。
(6)模型構建評估根據上述實驗步驟進行操作，結果顯示同時在大鼠側腦室注射wortmannin(100μM)和GF-109203X(100μM)，大鼠出現明顯行為學障礙，即水迷宮測試潛伏期明顯延長(見圖1～3)。酶活性檢測結果顯示手術48h后，與對照組相比，模型組大鼠海馬GSK-3酶活性增加到原來的3.7倍；免疫組化和免疫印跡結果顯示(見圖4～17)手術48h后，與對照組相比，模型組大鼠tau蛋白Ser198/Ser199/Ser202(抗體Tau-1識別非磷酸化位點)和Ser396/404位點(抗體PHF-1識別磷酸化位點)磷酸化明顯增強，并出現神經原纖維纏結樣病理變化；而骨架蛋白Tau的這些特殊位點的磷酸化程度與動物的學習、記憶障礙正相關，即Tau蛋白過度磷酸化程度越高，大鼠學習記憶能力越差。上述結果說明模型構建成功。
本發明提供的動物模型的構建方法，同時適用于(1)在大鼠雙側海馬或大鼠側腦室注射反式異丙腎上腺素(β-腎上腺素能受體激動劑，蛋白激酶A激動劑)；(2)在大鼠雙側海馬或大鼠側腦室注射異丙腎上腺素前1h及后6h，并同時腹腔注射尼莫地平(鈣離子拮抗劑)；(3)通過大鼠雙側海馬注射或大鼠側腦室注射其它藥物，如花萼海綿誘癌素(Calyculin A，蛋白磷酸酯酶PP-2A和PP-1抑制劑)、緩激肽(Bradykinin，鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶-II激動劑)、環胞菌素A(Cyclosporine A，蛋白磷酸酯酶PP-2B抑制劑)、forskolin(環磷酸腺苷依賴性蛋白激酶激動劑)等，都可以直接復制出AD樣大鼠海馬骨架蛋白異常過度磷酸化、神經原纖維纏結樣病理變化和學習、記憶障礙。
圖1為wortmannin單獨用藥對大鼠空間學習、記憶的影響與手術前相比較，單獨使用100μM的wortmannin能明顯延長大鼠水迷宮潛伏期，而10μM濃度卻沒有相同的作用(n＝15；*，p＜0.01與對照組相比較)圖2為GF-109203X單獨用藥對大鼠空間學習、記憶的影響與手術前相比較，單獨使用100μM的GF-109203X能明顯延長大鼠水迷宮潛伏期，而10μM濃度卻沒有相同的作用(n＝15；*，p＜0.01與對照組相比較)圖3為wortmannin and GF-109203X聯合用藥對大鼠空間學習、記憶的影響不同濃度的wortmannin and GF-109203X聯用對大鼠水迷宮潛伏期的影響，結果顯示100μM的wortmannin和100μM的GF-109203X聯用比單獨使用其中一種藥物更明顯延長大鼠水迷宮潛伏期(n＝15；*，p＜0.01與對照組相比較)圖4為免疫印跡結果顯示wortmannin單用用藥對大鼠海馬骨架蛋白tau Ser199/202位點磷酸化的影響單獨使用100μM的wortmannin能明顯降低tau-1的免疫活性(n＝7；$，p＜0.05與對照組相比較；*，p＜0.01與對照組相比較)。
圖5為免疫印跡結果顯示GF-109203X單用用藥對大鼠海馬骨架蛋白tau Ser199/202位點磷酸化的影響單獨使用10μM或100μM的GF-109203X都能明顯降低tau-1的免疫活性(n＝7；$，p＜0.05與對照組相比較；*，p＜0.01與對照組相比較)。
圖6為免疫印跡結果顯示wortmannin and GF-109203X聯合用藥對大鼠海馬骨架蛋白tau Ser199/202位點磷酸化的影響不同濃度的wortmannin and GF-109203X聯用不同程度地降低tau-1的免疫活性(n＝7；$，p＜0.05與對照組相比較；*，p＜0.01與對照組相比較)。
圖7為免疫組化結果顯示空白對照組大鼠海馬骨架蛋白tau Ser199/202位點磷酸化的情況空白對照組在大鼠海馬CA3和CA4區tau-1抗體著色的免疫組化結果(n＝7；$，p＜0.05與對照組相比較；*，p＜0.01與對照組相比較)，Bar＝200μm。)圖8為免疫組化結果顯示wortmannin單用用藥對大鼠海馬骨架蛋白tau Ser199/202位點磷酸化的影響100μM wortmannin單獨用藥在大鼠海馬CA3和CA4區tau-1抗體著色的免疫組化結果(n＝7；$，p＜0.05與對照組相比較；*，p＜0.01與對照組相比較)，Bar＝200μm。)圖9為免疫組化結果顯示GF-109203X單用用藥對大鼠海馬骨架蛋白tau Ser199/202位點磷酸化的影響100μM GF-109203X單獨用藥在大鼠海馬CA3和CA4區tau-1抗體著色的免疫組化結果(n＝7；$，p＜0.05與對照組相比較；*，p＜0.01與對照組相比較)，Bar＝200μm。)圖10為免疫組化結果顯示wortmannin and GF-109203X聯合用藥對大鼠海馬骨架蛋白tau Ser199/202位點磷酸化的影響(100μM wortmannin和100μM GF-109203X聯合用藥在大鼠海馬CA3和CA4區tau-1抗體著色的免疫組化結果100μM wortmannin和100μMGF-109203X聯用比單獨使用其中一種藥物更明顯降低tau-1的免疫活性(n＝7；$，p＜0.05與對照組相比較；*，p＜0.01與對照組相比較)，Bar＝200μm。)圖11為免疫印跡結果顯示wortmannin單用用藥對大鼠海馬骨架蛋白tauSer395/404位點磷酸化的影響單獨使用100μM的wortmannin能明顯增高PHF-1的免疫活性(n＝7；$，p＜0.05與對照組相比較；*，p＜0.01與對照組相比較。)圖12為免疫印跡結果顯示GF-109203X單用用藥對大鼠海馬骨架蛋白tauSer395/404位點磷酸化的影響單獨使用10μM或100μM的GF-109203X都能明顯增高PHF-1的免疫活性(n＝7；$，p＜0.05與對照組相比較；*，p＜0.01與對照組相比較。)圖13為免疫印跡結果顯示wortmannin and GF-109203X聯合用藥對大鼠海馬骨架蛋白tau Ser395/404位點磷酸化的影響不同濃度的wortmannin and GF-109203X聯用不同程度地增高PHF-1的免疫活性(n＝7；$，p＜0.05與對照組相比較；*，p＜0.01與對照組相比較。)圖14為免疫組化結果顯示空白對照組大鼠海馬骨架蛋白tau Ser395/404位點磷酸化的影響空白對照組大鼠海馬CA3和CA4區PHF-1抗體免疫組化結果(n＝7；$，p＜0.05與對照組相比較；*，p＜0.01與對照組相比較)，Bar＝200μm。)圖15為免疫組化結果顯示wortmannin單用用藥對大鼠海馬骨架蛋白tauSer395/404位點磷酸化的影響(100μM wortmannin單獨用藥在大鼠海馬CA3和CA4區PHF-1抗體免疫組化結果(n＝7；$，p＜0.05與對照組相比較；*，p＜0.01與對照組相比較)，Bar＝200μm。)圖16為免疫組化結果顯示GF-109203X單用用藥對大鼠海馬骨架蛋白tauSer395/404位點磷酸化的影響(100μM GF-109203X以及后兩者的聯合用藥在大鼠海馬CA3和CA4區PHF-1抗體免疫組化結果(n＝7；$，p＜0.05與對照組相比較；*，p＜0.01與對照組相比較)，Bar＝200μm。)圖17為免疫組化結果顯示wortmannin and GF-109203X聯合用藥對大鼠海馬骨架蛋白tau Ser395/404位點磷酸化的影響100μM wortmannin和100μMGF-109203X聯合用藥在大鼠海馬CA3和CA4區PHF-1抗體免疫組化結果顯示100μM wortmannin和100μM GF-109203X聯用比單獨使用其中一種藥物更明顯升高PHF-1的免疫活性，且出現神經原纖維纏結樣細胞(n＝7；$，p＜0.05與對照組相比較；*，p＜0.01與對照組相比較)，Bar＝200μm。)具體實施方式
實例1側腦室注射wortmannin(磷脂酰肌醇3激酶抑制劑)和GF-109203X(蛋白激酶C的抑制劑)構建AD樣大鼠動物模型(1)實驗動物及分組雄性Wistar大鼠(華中科技大學同濟醫學院實驗動物實驗中心提供)，SPF級，體重250～320克，150只，常規環境飼養。分十組，每組15只①正常組；②假手術組；③wortmannin組1(10μM)；④wortmannin組2(100μM)；⑤GF-109203X組1(10μM)；⑥GF-109203X組2(100μM)；⑦wortmannin(10μM)+GF-109203X(10μM)組1；⑧wortmannin(10μM)+GF-109203X(100μM)組2；⑨wortmannin(100μM)+GF-109203X(10μM)組3；⑩wortmannin(100μM)+GF-109203X(100μM)組4。
(2)主要試劑丙烯酰胺(Arc)，N，N-亞甲基雙丙烯酰(bis)，四甲基乙二胺(TEMED)，十二烷基磺酸鈉(SDS)，甘氨酸(Glycine)，牛血清白蛋白(BSA)，三羥甲基氨基甲烷(Tris)，礬酸鈉(Na3 VO4)，β-磷酸甘油(β-PG)，氟化鈉(NaF)，wortmannin和GF-109203X，均為Sigma產品；過硫酸銨(AP)及考馬斯亮藍蛋白顯色液從Pierce(美國)公司購買；預染的高分子量蛋白標準從Gibco公司購買。
(3)主要儀器WDT-V型腦立體定位儀(西安西北光電儀器廠)STT-III型三維手動推進器(西安西北光電儀器廠)垂直型電泳槽和濕式電轉膜槽(Hoefer，USA)電泳儀(DF-C型，東方特力科貿中心)轉膜儀(BIO-RAD，北京市六一儀器廠)臺式高速離心機(Sigma，德國)酶標儀(DG-3022型)圖象分析系統(Image pro-plus kodak，USA)衡溫雜交孵育箱(Biometra)(4)側腦室注射給藥選擇適當的大鼠，麻醉后固定在腦立體定位儀上，清晰暴露前后囟，于前囟后1.0～1.2mm，中線旁側1.5～1.8mm垂直進針至硬膜下約3.5～3.8mm，分別緩慢注入wortmannin和GF-109203X藥液各10μl，wortmannin的濃度為100μM；GF-109203X濃度為100μM，用滅菌人工腦脊液配置，留針10min使藥液得到充分吸收。
(5)Morris水迷宮訓練及測試實驗所采用Morris水迷宮測試系統主要包括大鼠行為學測試系統、圖象采集系統及微機數據處理分析系統。測試用圓形水池直徑120cm，高60cm；圓柱形有機玻璃平臺直徑10cm，高40cm。大鼠在訓練前2小時移入水迷宮室，并用染發劑將頭頸部涂黑，涂染面積不小于3×3cm2，以與背景形成反差。水池中水面高約45cm，室溫及水溫均保持在26±2℃，水以奶粉攪渾；平臺用雙層白色紗布覆蓋扎緊后任意放置于某一象限的中心位置，并沒于水面下約2cm。整個背景均為乳白色，以避免老鼠用視覺搜尋平臺。用于指導大鼠游泳找到平臺的紅色或蘭色標記物分別置于平臺所在象限邊緣1m左右。
訓練時將大鼠從任一象限1/2弧度處頭面向池壁輕放于水中，其游泳圖象經水面上方1.5m處的攝象機拍攝并連接于路徑追蹤系統采集，最后通過微機分析，可提供潛伏期(即大鼠從入水點起到找到平臺所用的時間)、路徑、搜索策略等指標，本實驗選用潛伏期作為衡量大鼠學習記憶和測試成績的指標。每只大鼠每天在4個象限共訓練4次，每次游泳時限為60s，即在60s內未找到平臺者系統自動停止記錄，潛伏期記為60s，由測試者引導其上臺，休息30s后進行下一次訓練。
(6)分子病理學檢測目的通過免疫印跡和免疫組化來反映造模前后以及與對照組大鼠海馬骨架蛋白的分子病理學變化。
免疫印跡法頸椎脫臼斷頭處死雄性Wistar大鼠，迅速取出大腦腦組織置于0-4℃ 0.05M Tris緩沖鹽溶液(TB，PH7.0)內，快速分離雙側海馬，制成10％的蛋白勻漿，在1000rmp離心5分鐘，取上清，測定蛋白含量后備用。
免疫組化法用4％多聚甲醛磷酸緩沖鹽溶液(PB)進行心臟灌注固定腦組織，待取出腦組織后再在上述固定液中后固定6h，即可作振蕩切片。免疫組化采用ABC法，二氨基聯苯氨(diaminobezidin，DAB)顯色。
(7)糖原合成激酶(Glycogen synthase kinase-3，GSK-3)酶活性測定目的通過同位素標記法來檢測造模前后以及對照組大鼠海馬GSK-3的活性改變。
大鼠海馬蛋白勻漿的糖原合成激酶(Glycogen synthase kinase-3，GSK-3)酶活性主要是依靠磷光體GS肽II作為底物進行測定(Pei et al.，1997；Tsujio et al.，2000)，具體方法如下在反應管中先一定體積的緩沖液(其組成為30mM Tris，pH7.4，10mM MgCl2，10mM NaF，1mM Na3VO4，2mM EGTA，and 10mMβ-mercaptoethanol)，再分別加入7.5μg大鼠海馬蛋白勻漿、250μM底物肽和200μMγ-32P-ATP(1,500cpm/pmol ATP)，終體積為25μl，在30℃條件下孵育30min，用25μl of 300mM鄰磷酸終止反應，然后從中取出25μl在液態閃爍記數分析儀進行檢測。
(8)統計分析全部數據均采用X±SD表示，利用SPSS統計軟件進行統計分析。
(9)模型構建評估根據上述實驗步驟進行操作，結果顯示同時在大鼠側腦室注射wortmannin(100μM)和GF-109203X(100μM)，大鼠出現明顯行為學障礙，即水迷宮測試潛伏期明顯延長；酶活性檢測結果顯示手術48h后，與對照組相比，模型組大鼠海馬GSK-3酶活性增加到原來的3.7倍；免疫組化和免疫印跡結果顯示在手術48h后，與對照組相比，模型組大鼠骨架蛋白tau磷酸化異常程度明顯增強，并出現神經原纖維纏結樣病理變化。上述結果說明模型構建成功。分組、實驗及結果列表如下
實例2 海馬注射wortmannin和GF-109203X構建AD樣大鼠動物模型(1)實驗動物及分組雄性Wistar大鼠(華中科技大學同濟醫學院實驗動物實驗中心提供)，SPF級，體重250～320克，150只，常規環境飼養。分十組，每組15只①正常組；②假手術組；③wortmannin組1(1μM)；④wortmannin組2(10μM)；⑤GF-109203X組1(1μM)；⑥GF-109203X組2(10μM)；⑦wortmannin(1μM)+GF-109203X(1μM)組1；⑧wortmannin(1μM)+GF-109203X(10μM)組2；⑨wortmannin(10μM)+GF-109203X(1μM)組3；⑩wortmannin(10μM)+GF-109203X(10μM)組4。
(2)主要試劑和儀器同實例1(3)海馬注射給藥 依次按以下步驟進行①Wistar大鼠稱重后，以5％水合氯醛0.6～0.8ml/100g腹腔注射麻醉；②麻醉后之大鼠固定于腦立體定位儀上，頭頂局部剪毛，碘酊、酒精依次消毒；③頭頂正中皮膚矢狀切開約1.5cm長，清晰暴露前、后囟；
④確定前后囟在同一水平線上后，于前囟后3.8～4.8mm，矢線旁側2.0mm用手鉆各鉆一孔；分別進針至硬膜下約3.0mm，慢速注入；⑤用5μl微量注射器吸取wortmannin液、GF-109203X(1μM或10μM))或0.9％的NaCl滅菌液2μl，在上述矢線旁兩側所鉆孔部位分別進針至硬膜下約3.0mm，慢速注入，或分別緩慢注入wortmannin和GF-109203X藥液各10μl，注射完畢后留針8～10min，再緩慢退針，以防藥物沿針道返流顱外；⑥局部涂抹青霉素粉末，縫合皮膚，再次消毒創處，將鼠置于空籠內待其蘇醒。
(4)行為學訓練、測試及分子病理學檢測方法、統計分析方法同實例1(5)模型構建評價根據上述實驗步驟進行操作，結果顯示同時在大鼠海馬注射wortmannin(10μM)和GF-109203X(10μM)，大鼠出現明顯行為學障礙，即水迷宮測試潛伏期明顯延長；酶活性檢測結果顯示手術48h后，與對照組相比，模型組大鼠海馬GSK-3酶活性明顯增強；免疫組化和免疫印跡結果顯示在手術48h后，與對照組相比，模型組大鼠海馬骨架蛋白tau磷酸化異常程度明顯增強，并出現神經原纖維纏結樣病理變化。上述結果說明模型構建成功。
實例3 側腦室射注反式異丙腎上腺素((-)Isoproterenol，IP)，并在射注反式異丙腎上腺素前1h及后6h腹腔注射尼莫地平構建AD樣大鼠動物模型(1)實驗動物及分組雄性Wistar大鼠(華中科技大學同濟醫學院實驗動物實驗中心提供)，體重250至320克，常規環境飼養。實驗大鼠隨機分為七組，每組15只正常組；NS注射24h組(假手術對照組，C-24h)，IP注射+NIM腹腔注射24h組(IP+NIM 24h)，NIM腹腔注射24h組(NIM 24h)；NS注射48h組(C-48h)，IP注射+NIM腹腔注射48h組(IP+NIM 48h)，NIM腹腔注射48h組(NIM 48h)。尼莫地平腹腔注射于IP注射前1h及后6h進行，0.2mg/kg。
(2)其他同實例1(3)模型構建評估根據上述實驗步驟進行操作，結果顯示在大鼠側腦室注射IP(濃度為5-40mM均可，優選濃度為20mM，注射量10μl)，并于注射IP前1h及后6h腹腔注射尼莫地平，大鼠出現明顯行為學障礙，即水迷宮測試潛伏期明顯延長；免疫組化和免疫印跡結果顯示在手術48h后，與對照組相比，模型組大鼠海馬骨架蛋白tau磷酸化異常程度明顯增強。上述結果說明模型構建成功。
實例4 海馬注射反式異丙腎上腺素，并在注射反式異丙腎上腺素前1h及后6h腹腔注射尼莫地平構建AD樣大鼠動物模型
(1)實驗動物及分組同實例3(2)其他同實例2(3)模型構建評估根據上述實驗步驟進行操作，結果顯示在大鼠海馬注射IP(濃度為5-40mM，優選濃度為20mM，2μl)，并于海馬注射IP前1h及后6h腹腔注射尼莫地平，大鼠出現明顯行為學障礙，即水迷宮測試潛伏期明顯延長；免疫組化和免疫印跡結果顯示在手術48h后，與對照組相比，模型組大鼠海馬骨架蛋白tau磷酸化異常程度明顯增強。上述結果說明模型構建成功。
權利要求
1.一種早老性癡呆動物模型的構建方法，其特征在于在大鼠側腦室或雙側海馬注射蛋白激酶激動劑或/和抑制劑。
2.根據權利要求1所述的早老性癡呆動物模型的構建方法，其特征在于所說的蛋白激酶抑制劑是磷脂酰肌醇3激酶抑制劑或/和蛋白激酶C的抑制劑。
3.根據權利要求2所述的早老性癡呆動物模型的構建方法，其特征在于所說的磷脂酰肌醇3激酶抑制劑的濃度是100μM，蛋白激酶C的抑制劑的濃度是100μM。
4.根據權利要求1所述的早老性癡呆動物模型的構建方法，其特征在于所說的蛋白激酶激動劑為反式異丙腎上腺素。
5.根據權利要求4所述的早老性癡呆動物模型的構建方法，其特征在于所說的反式異丙腎上腺素的濃度為5至40mM。
6.根據權利要求4所述的早老性癡呆動物模型的構建方法，其特征在于在大鼠側腦室或雙側海馬注射反式異丙腎上腺素前1h及后6h對該大鼠腹腔注射尼莫地平。
7.根據權利要求6所述的早老性癡呆動物模型的構建方法，其特征在于腹腔注射尼莫地平的用量為0.2mg/kg。
8.根據權利要求1所述的早老性癡呆動物模型的構建方法，其特征在于所說的蛋白激酶激動劑為緩激肽或forskolin。
9.根據權利要求1所述的早老性癡呆動物模型的構建方法，其特征在于所說的大鼠側腦室注射包括將大鼠麻醉后固定在腦立體定位儀上，清晰暴露前后囟，于前囟后1.0～1.2mm，中線旁側1.5～1.8mm垂直進針至硬膜下約3.5～3.8mm緩慢注入所選藥物10μl。
10.根據權利要求1所述的早老性癡呆動物模型的構建方法，其特征在于所說的海馬注射包括將大鼠麻醉后固定于腦立體定位儀上，頭頂局部剪毛，碘酊、酒精依次消毒，頭頂正中皮膚矢狀切開約1.5cm長，清晰暴露前、后囟，確定前后囟在同一水平線上后，于前囟后3.8～4.8mm，矢狀線兩側2.0mm處用手鉆各鉆一孔，在所鉆孔處分別進針至硬膜下約3.0mm，慢速注入所選藥物2μl。
全文摘要
本發明提供了同時在大鼠側腦室注射wortmannin(磷脂酰肌醇3激酶抑制劑)和GF－109203X(蛋白激酶C的抑制劑)構建早老性癡呆大鼠動物模型的方法，該方法能直接誘導出海馬骨架蛋白的AD樣異常過度磷酸化、神經原纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFTs)樣病理變化和學習、記憶障礙共存的大鼠動物模型，該類模型可用于篩選因蛋白激酶過度激活引發的骨架蛋白Tau AD樣異常過度磷酸化、神經原纖維纏結樣病理變化及學習、記憶障礙的早老性癡呆治療藥物，以及研究蛋白激酶和AD發病機制之間的內在聯系。
文檔編號A61K49/00GK1636601SQ0312534
公開日2005年7月13日 申請日期2003年8月28日 優先權日2003年8月28日
發明者王建枝 申請人:華中科技大學同濟醫學院