專利名稱：江南卷柏醇提干粉及其制備方法
技術領域：
本發明涉及江南卷柏醇提干粉，及其制備方法和作為治療各種內出血和外傷出血的止血藥物的應用。
背景技術：
各種形式的內出血和外傷性出血導致的失血可造成機體急性、慢性缺血或各種繼發性疾病，嚴重時可危及生命。發展優秀止血藥一直被關注。江南卷柏(Selaginella moellendorfii Hieron)，又名地柏枝、摩來卷柏、鹿茸草，全草入藥，是江南一帶民間常用來治療肝炎、各種內出血和外傷出血的止血藥物。廣州白云山制藥總廠生產的江南卷柏片的主成分就是江南卷柏。江南卷柏片在臨床被用于清熱涼血，適用于治療皮下散在紫癜、出血點，舌質紅，脈細數等血熱癥候。江南卷柏片口服給藥，一天3次，一次5-6片，是治療原發性血小板減少性紫癜和其它各種出血性疾病理想的中成藥。江南卷柏片能明顯升高兔血小板數，在體內外均能促進家兔血小板的聚集功能，能明顯降低CRBC致敏狀態下小白鼠血清IgG的含量及特異性抗CRBC抗體(IgM溶血素)的含量。
與別的中成藥一樣，江南卷柏片也存在服藥劑量大和病人負擔重的弊病。改進工藝，除去江南卷柏片中無用的雜質一直是改進江南卷柏片生產和提高江南卷柏片療效的關鍵。
發明內容
本發明的目的是提供一種高純度的江南卷柏干粉的制備方法及所得高純度的江南卷柏干粉。
本發明的高純度的江南卷柏干粉的制備方法包括A、以江南卷柏水浸膏為原料，在乙醇水溶液中回流提取(例如達1-5小時)，濾去殘渣，獲得濾液；B、步驟A的殘渣在乙醇水溶液中回流提取(例如達1-5小時)，濾去殘渣，獲得濾液；C、將步驟A和B的濾液合并，減壓濃縮去醇，干燥或凍干，獲得江南卷柏醇提干粉。
其中江南卷柏水浸膏是江南卷柏的水提物或醇提物。
其中步驟A和B的乙醇水溶液的濃度例如是1-99％，優選10-95％，更優選10-40％，最優選約30％。
在一個實施方案中，江南卷柏水浸膏是江南卷柏葉用水煎煮一次、二次或多次后獲得的濾液濃縮干燥后的產品。
在另一個實施方案中，江南卷柏水浸膏是江南卷柏葉用醇溶液(例如1-95％的醇水溶液)煎煮一次、二次或多次后獲得的濾液濃縮干燥后的產品。
本發明還涉及由上述方法獲得的產品。
本發明還涉及上述卷柏醇提干粉作為治療各種內出血和外傷出血的止血藥物的應用。
本發明人出乎意料地發現，用低濃度，例如10-40％，尤其30％的乙醇水溶液回流提取卷柏水浸膏，獲得了療效顯著優于該卷柏水浸膏的卷柏醇提干粉。
在以下實施例中，本發明以江南卷柏水浸膏為原料，用不同濃度的乙醇水溶液平行提取。提取時，將50g江南卷柏水浸膏分別在600ml 30％、50％、70％及95％的乙醇水溶液中攪拌并回流1.5h，離心沉去殘渣后，減壓過濾。殘渣再用600ml 30％、50％、70％及95％的乙醇水溶液平行重復提取分離一次，所得濾液減壓濃縮除去醇，殘留物加水溶解并凍干，得江南卷柏干粉。收率見表1。
表1.江南卷柏水浸膏醇提取收率
具體實施例方式
為了解釋本發明，下面給出一系列實施例。這些實施例完全是例證性的，它們僅用來對本發明進行具體描述，不應當理解為對本發明的限制。
實施例1.江南卷柏水浸膏的制備500g江南卷柏干葉用清水洗凈，加入2L清水煎煮30分鐘。濾出煎煮液，濾渣加1.5L清水煎煮50分鐘。濾出煎煮液。兩次煎煮液合并，減壓濃縮，殘留物干燥，粉碎，得50g江南卷柏水浸膏干粉，收率10％。
實施例2.江南卷柏30％乙醇浸膏的制備500g江南卷柏干葉用清水洗凈，加入2 L30％的乙醇水溶液煎煮90分鐘。濾出煎煮液，濾渣加1.5L30％的乙醇水溶液煎煮60分鐘。濾出煎煮液。兩次煎煮液合并，減壓濃縮，殘留物干燥，粉碎，得30g江南卷柏水浸膏干粉，收率6％。實施例3.30％的乙醇提取物的制備50g江南卷柏水浸膏與200ml濃度為30％的乙醇水溶液混合，攪拌下回流2h。混合物在1000g下離心，減壓過濾，濾出殘渣。殘渣再與200ml濃度為30％的乙醇水溶液混合，攪拌下回流2h。混合物在1000g下離心，減壓過濾，除去殘渣。濾液減壓濃縮，殘留物加水20ml水溶解，冷凍干燥，得30％的乙醇提取物。
實施例3.50％的乙醇提取物的制備50g江南卷柏水浸膏與200ml濃度為50％的乙醇水溶液混合，攪拌下回流2h。混合物在1000g下離心，減壓過濾，濾出殘渣。殘渣再與200ml濃度為50％的乙醇水溶液混合，攪拌下回流2h。混合物在1000g下離心，減壓過濾，除去殘渣。濾液減壓濃縮，殘留物加水20ml水溶解，冷凍干燥，得50％的乙醇提取物。
實施例4.70％的乙醇提取物的制備50g江南卷柏水浸膏與200ml濃度為70％的乙醇水溶液混合，攪拌下回流2h。混合物在1000g下離心，減壓過濾，濾出殘渣。殘渣再與200ml濃度為70％的乙醇水溶液混合，攪拌下回流2h。混合物在1000g下離心，減壓過濾，除去殘渣。濾液減壓濃縮，殘留物加水20ml水溶解，冷凍干燥，得70％的乙醇提取物。
實施例5.95％的乙醇提取物的制備50g江南卷柏水浸膏與200ml濃度為95％的乙醇水溶液混合，攪拌下回流2h。混合物在1000g下離心，減壓過濾，濾出殘渣。殘渣再與200ml濃度為95％的乙醇水溶液混合，攪拌下回流2h。混合物在1000g下離心，減壓過濾，除去殘渣。濾液減壓濃縮，殘留物加水20ml水溶解，冷凍干燥，得95％的乙醇提取物。
實施例6.小鼠出血時間測定取體重為18-22g的ICR雄性小鼠92只(來自北京大學醫學部實驗動物部)，隨機分為5組，每天給藥一次。最后一次給藥1h后，將小鼠裝入透氣的瓶中，僅露出尾巴，然后以利剪將小尾尖3mm處橫斷，待血液自行溢出開始計時，每隔30s用濾紙吸去血滴一次，直至血液自行停止(濾紙吸時無血為止)。計算出血時間。
實施例7.指紋圖譜測定儀器和試劑Waters600泵，Waters2996雙波長紫外檢測器，Millennium色譜工作站；甲醇(北京化工廠)為分析純。
供試品溶液江南卷柏水浸膏、50％、70％或95％的乙醇水溶液提取的江南卷柏干粉與蒸餾水配成溶液(1g/ml)。得到的溶液超聲震蕩30min后于1000g離心，濾去殘渣，濾液經0.45μm微孔濾膜過濾后直接進樣分析，記錄色譜。
色譜條件色譜柱為Kromasil KR100-5C18分析柱150mm×4.6mm；進樣量為10μL；流動相為甲醇-水，按表2所示的二元梯度洗脫，流速1.0mL/min，檢測波長215nm、280nm及300nm。
表2使用甲醇-水體系的流動相梯度
本發明對不同濃度的乙醇水溶液提取得到的江南卷柏干粉進行了止血作用評價。生理止血主要有血小板和某些血漿成分參與。血小板在生理止血過程中有重要作用。正常情況下，血小板有保護血管壁完整性的功能。血管創傷出血時，血小板在生理止血中的功能活動大致可以分為兩段。創傷發生后的第一階段，血小板迅速粘附于創傷處并聚集成團，形成較松軟的止血栓子。創傷發生后的第二階段，血小板促進血凝并形成堅實的止血栓子。此外，血小板對于血液凝固也有重要的促進作用。常用的止血藥作用評價有凝血時間測定法，凝血因子活力或含量測定法，血管收縮作用的測定法，血小板粘附性測定法和血小板聚集性測定法。在比較了所有的評價模型之后，本發明評價了本發明的江南卷柏干粉對小鼠出血時間的影響。結果見表3。
表3.江南卷柏對小鼠尾出血時間的影響
n＝13；與NS組比較，a)P＜0.01接受本發明的江南卷柏干粉的小鼠尾出血時間均值與接受江南卷柏水浸膏的小鼠尾出血時間均值比較并進行t檢驗，結果僅有接受30％的乙醇提取的江南卷柏干粉的小鼠尾出血時間均值與接受止血敏及江南卷柏水浸膏的小鼠尾出血時間均值有顯著性差異(P＜0.01)。本發明觀察了用30％的乙醇提取的江南卷柏干粉的量效關系，結果見表4。用30％的乙醇提取的江南卷柏干粉顯示比較明確的量效關系。
表4.30％的乙醇提取的江南卷柏干粉對小鼠出血時間的影響
N＝13，a)與NS組及低劑量組及比較，P＜0.001；b)與低劑量組及比較，P＜0.01。
本發明測定了江南卷柏水浸膏，30％、50％、70％及95％的乙醇水溶液提取的江南卷柏干粉的指紋圖譜。本發明采用配有Waters600泵，Waters2996雙波長紫外檢測器和Millennium色譜工作站的HPLC系統，甲醇-水二元梯度洗脫溶劑，獲得了表5-表7的指紋圖譜。
表5.檢測波長為215nm時指紋峰的保留時間及峰面積
*峰4及14為30％乙醇提取物區別于江南卷柏水浸膏，50％、70％及95％的乙醇水溶液提取的江南卷柏干粉的色譜峰。峰4及14的峰面積分別占總峰面積的7.97％及29.16％。
表6.檢測波長為280nm時指紋峰的保留時間及峰面積
*峰5、8、16及32為30％乙醇提取物區別于江南卷柏水浸膏，50％、70％及95％的乙醇水溶液提取的江南卷柏干粉的色譜峰。峰5、8、16及32的峰面積分別占總峰面積的3.42％、7.91％、31.29％及20.55％。
表7.檢測波長為300nm時指紋峰的保留時間及峰面積
峰8、15、20及61為30％乙醇提取的江南卷柏干粉區別于江南卷柏水浸膏，50％、70％及95％的乙醇水溶液提取的江南卷柏干粉的色譜峰。峰號8、15、20及61的峰面積分別占總峰面積的13.55％、7.68％、14.70％及6.82％。
權利要求
1.卷柏醇提干粉的制備方法，包括以下步驟A、以江南卷柏水浸膏為原料，在乙醇水溶液中回流提取(例如達1-5小時)，濾去殘渣，獲得濾液；B、步驟A的殘渣在乙醇水溶液中回流提取(例如達1-5小時)，濾去殘渣，獲得濾液；C、將步驟A和B的濾液合并，減壓濃縮去醇，干燥或凍干，獲得江南卷柏醇提干粉。
2.根據權利要求1的制備方法，其中江南卷柏水浸膏是江南卷柏的水提物或醇提物。
3.根據權利要求1的制備方法，其中步驟A和B的乙醇水溶液的濃度例如是1-99％，優選10-95％，更優選10-40％，最優選約30％。
4.根據權利要求1的制備方法，其中江南卷柏水浸膏是江南卷柏葉用水煎煮一次、二次或多次后獲得的濾液濃縮干燥后的產品。
5.根據權利要求1的制備方法，其中江南卷柏水浸膏是江南卷柏葉用醇溶液(例如1-95％的醇水溶液)煎煮一次、二次或多次后獲得的濾液濃縮干燥后的產品。
6.根據權利要求1-5的任一項的制備方法獲得的卷柏醇提干粉。
7.根據權利要求6的卷柏醇提干粉作為治療各種內出血和外傷出血的止血藥物的應用。
全文摘要
本發明涉及以江南卷柏水浸膏為原料，經乙醇水溶液提取去除雜質的工藝，本發明還涉及30％、50％、70％及95％的乙醇水溶液提取的江南卷柏干粉作為止血藥的應用，本發明進一步涉及30％、50％、70％及95％的乙醇水溶液提取的江南卷柏干粉的HPLC指紋圖譜。
文檔編號A61P7/04GK1606986SQ20031010025
公開日2005年4月20日 申請日期2003年10月15日 優先權日2003年10月15日
發明者彭師奇, 趙明, 王超, 戚潁玫 申請人:廣州白云山制藥股份有限公司